F Ü R S T U D I E R E N D E D E R M E D I Z I N BIOCHEMISCHES INSTITUT DER UNIVERSITÄT ZÜRICH

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1 B I O C H E M I S C H E S P R A K T I K U M F Ü R S T U D I E R E N D E D E R M E D I Z I N BIOCHEMISCHES INSTITUT DER UNIVERSITÄT ZÜRICH 2003

2 INHALTSVERZEICHNIS *) Zum Biochemischen Praktikum steht Ihnen die Webunterstützung bipweb im Internet und auf der beigelegten CD zur Verfügung. Die Web-basierte Lernhilfe soll bei der Vorbereitung auf die Kursnachmittage, bei der Auswertung und Nachbereitung der Experimente helfen. Sie können darin Ihren Wissensstand im Selbsttest prüfen und im bipweb-lexikon Informationen über Struktur und Funktion einzelner Moleküle nachschlagen. Benützen Sie bipweb zusammen mit dem Kursheft, um sich auf die Kursnachmittage vorzubereiten. Sie benötigen hierzu etwa 20 Minuten für jeden Arbeitsplatz. Bipweb hilft Ihnen die Experimente besser zu verstehen. Für einzelne Experimente finden Sie im bipweb erklärende Animationen oder Berechnungs- und Auswertehilfen. Sie können die richtigen Antworten zu den Fragen aus dem Praktikumsheft nachschlagen und zu jedem Platz in einem kleinen Selbsttest ihren Wissensstand überprüfen. Im bipweb-lexikon finden Sie Informationen über Struktur und Funktion kleiner und grosser Moleküle mit Abbildungen und dreidimensionalen Moleküldarstellungen. Studierende haben mit ihrem uniaccess login Zugriff auf bipweb über die virtuelle Ausbildungsplattform Medizin VAM: Unter dieser Adresse finden Sie viele weitere Angaben zu Lehrveranstaltungen im ersten und zweiten Studienjahr. THEORETISCHER TEIL Seite Gebräuchliche Einheiten für Substanzquantität, Volumen und Konzentration 5 Kohlenhydrate 7 Aminosäuren und Proteine 10 Lipide 16 Biologische Membranen 18 Nucleinsäuren 20 ph-messung und Titration 20 Elektrophorese 26 Chromatographie 27 Photometrie 31 Enzymreaktionen 34 Molekularbiologische Methoden 45 Radioaktive Isotope 51 Immunologische Bestimmungsmethoden 56 Eisenstoffwechsel 56 Demonstrationen auf Computer - Ressourcen im Internet 58

3 Seite PRAKTIKUM I: ANALYSE VON BIOMOLEKÜLEN PLATZ 1: Messung von Enzymaktivitäten und Metabolitkonzentrationen; 60 Stoffwechselwege Exp. 1.6 UV-Spektren von NAD + und NADH 61 Exp. 1.7 Aktivität und Substratspezifität der Alkoholdehydrogenase 61 Exp. 1.8 Messung der Aktivität von Kreatinkinase im Plasma mit "Trockenchemie" 63 Exp. 1.9 Messung der Pyruvatkonzentration mit Lactatdehydrogenase 67 Exp.1.10 Alkoholische Gärung 68 PLATZ 2: Aminosäuren und Proteine 69 Exp. 2.1 Herstellung von Pufferlösungen 69 Exp. 2.2 Titrationskurven von Aminosäuren 69 Exp. 2.3 Titration von Hämoglobin 70 Exp. 2.4 Ionenaustauschchromatographie von Aminosäuren 71 Exp. 2.7 Löslichkeit von Serumalbumin 73 PLATZ 3: Verdauung 74 Exp. 3.1 Verdauung von Eieralbumin durch Pepsin 74 Exp. 3.2 Aktivierung von Chymotrypsinogen 75 Exp. 3.3 Löslichkeit der Lipide 76 Exp. 3.4 Verdauung von Triacylglycerin mit Lipase und Nachweis der 77 entstandenen Verdauungsprodukte Exp. 3.5 Abbau von Stärke durch Amylase 79 Exp. 3.6 Nachweis reduzierender Zucker nach Benedict 80 PLATZ 4: Analyse von Serumbestandteilen I 81 Exp. 4.1 Proteinbestimmung nach der Biuret-Methode 81 Exp. 4.2 Elektrophorese von Serumproteinen in Agarose-Gel 82 Exp. 4.3 Bestimmung der Eisenkonzentration und der Eisenbindungskapazität im Serum 85 PLATZ 5: Analyse von Serumbestandteilen II 87 Exp. 5.1 Dialyse von Serum 87

4 Seite Exp. 5.2 Trennung von hoch- und niedrigmolekularen Substanzen durch Gelchromatographie 87 Exp. 5.3 Colorimetrische Bestimmung von Phosphat 88 Exp. 5.6 Enzymatische Bestimmung von Glucose 89 Exp. 5.7 Spezifischer Nachweis von Glucose mit Diabur-Teststäbchen 90 PRAKTIKUM II: ENZYMREAKTIONEN UND STOFFWECHSEL PLATZ 8: Eigenschaften von DNA, DNA-Rekombinationstechnik, 91 Polymerase-Kettenreaktion in der medizinischen Diagnostik Exp. 8.7 Antibiotikaresistenz von Bakterien 91 Exp. 8.8 Spezifische Spaltung von DNA durch Restriktionsenzyme 93 Exp. 8.9 Amplifikation eines spezifischen DNA-Abschnitts durch Polymerase-Kettenreaktion 95 Exp Denaturierung von DNA durch Hitze und Lauge 98 PLATZ 9: Enzymkinetik, Enzymimmuntest eines Hormons 100 Exp. 9.1 Bestimmung von K m und V max der sauren Phosphatase 101 Exp. 9.2 ph-abhängigkeit der sauren und alkalischen Phosphatase 102 Exp. 9.5 Enzymimmuntest zur Thyroxin-Bestimmung im Serum (in silico) 104 PLATZ 10: Wirkungsmechanismus und Spezifität von Enzymen 108 Exp Acylierung von Chymotrypsin mit p-nitrophenyl-[ 3 H]acetat 110 Exp Deacylierung des markierten Chymotrypsins 111 Exp Acylierung von Chymotrypsin, Auswertung von Versuchsergebnissen 112 Exp Zählausbeute für 14 C im Flüssigkeitsszintillationszähler 115 Exp Substratspezifität von Trypsin und Chymotrypsin 115 PLATZ 11: Biologische Membranen und Blutlipide 117 Exp Exp Lipidzusammensetzung der Erythrozytenzellmembran und der Plasmalipide 117 Bestimmung von Cholesterin im Serum und in Lipoproteinen 121

5 PLATZ 12: Blut 123 Seite Exp Katalase im Blut 124 Exp Absorptionsspektrum von Oxy-Hämoglobin 124 Exp Absorptionsspektrum von Desoxy-Hämoglobin 125 Exp Bestimmung von Methämoglobin im Blut 128 Exp Bestimmung von Na + und K + in Erythrozyten und Blutplasma mit dem Flammenphotometer 129 Exp Undurchlässigkeit der Erythrozytenmembran für polare Substanzen 133

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