25 (OH) Vitamin D ELISA

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1 Instructions for Use 25 (OH) Vitamin D ELISA Enzyme Immunoassay for the quantitative determination of 25-OH Vitamin D in plasma and serum EIA DRG Instruments GmbH, Germany DRG International, Inc. Frauenbergstr. 18, D Marburg USA Telefon: +49 (0) , Fax: +49-(0) Telephone: (908) Internet: Fax: (908) drg@drg-diagnostics.de corp@drg-international.com

2 Version 9.0 Effective, April 2013 ( ) Please use only the valid version of the package insert provided with the kit. Verwenden Sie nur die jeweils gültige, im Testkit enthaltene, Arbeitsanleitung. Si prega di usare la versione valida dell'inserto del pacco a disposizione con il kit. Por favor, se usa solo la version valida de la metodico técnico incluido aqui en el kit. Table of Contents / Inhaltsverzeichnis / Tabella die Contenuti / Tabla de Contenidos 1 INTENDED USE SUMMARY AND EXPLANATION OF THE TEST MATERIAL SUPPLIED MATERIAL REQUIRED BUT NOT SUPPLIED PREPARATION AND STORAGE OF REAGENTS SPECIMEN COLLECTION AND PREPARATION ASSAY PROCEDURE RESULTS LIMITATIONS QUALITY CONTROL PERFORMANCE CHARACTERISTICS PRECAUTIONS TECHNICAL HINTS GENERAL NOTES ON THE TEST AND TEST PROCEDURE VERWENDUNGSZWECK KLINISCHE BEDEUTUNG INHALT DER TESTPACKUNG ERFORDERLICHE LABORGERÄTE UND HILFSMITTEL VORBEREITUNG UND LAGERUNG DER REAGENZIEN PROBENVORBEREITUNG UND LAGERUNG TESTDURCHFÜHRUNG ERGEBNISSE EINSCHRÄNKUNGEN QUALITÄTSKONTROLLE TESTCHARAKTERISTIKA VORSICHTSMAßNAHMEN TECHNISCHE MERKMALE ALLGEMEINE HINWEISE ZUM TEST L USO INTESO RIASSUNTO E SPIEGAZIONI MATERIALE FORNITO MATERIALE RICHIESTO MA NON FORNITO PREPARAZIONE E CONSERVAZIONE DEI REAGENTI RACCOLTA DEI CAMPIONI E PREPARAZIONE PROCEDIMENTO D ANALISI RISULTATI LIMITAZIONI CONTROLLO QUALITÁ CARATTERISTICHE DEL TEST PRECAUZIONI NOTE TECNICHE NOTE GENERALI AL TEST E AL PROTOCOLLO DEL TEST LITERATURE / LITERATUR / BIBLIOGRAFIA SYMBOLS USED WITH DRG ASSAYS Version 9.0; 2013/04 - vk - 1 -

3 1 INTENDED USE The DRG Assay is intended for the quantitative determination of the 25-OH Vitamin D in plasma and serum. For in vitro diagnostic use only. 2 SUMMARY AND EXPLANATION OF THE TEST Vitamin D is a steroid hormone involved in the intestinal absorption of calcium and the regulation of calcium homeostasis. There are two different forms of Vitamin D, named D 3 and D 2, which are very similar in structure. The D 2 is a synthetic product, which is predominantly absorbed by fortified food. Physiological Vitamin D 3 levels result not only from dietary uptake but also by biosynthesis of 7-dehydrocholesterol and UV-light in skin because of sun exposure. In the liver, the vitamin is hydroxylated to 25-hydroxyvitamin D (25-OH Vitamin D), the major circulating metabolite of Vitamin D. Although 1,25-(OH) 2 Vitamin D portrays the biological active form of Vitamin D, which is synthesized in the kidney, it is widely accepted that the measurement of circulating 25-OH Vitamin D provides better information with respect to patients Vitamin D status and allows its use in diagnose hypovitaminosis (1,2). The concentration of 25-OH Vitamin D decreases with age and a deficiency is common among elderly persons. Clinical applications of 25-OH Vitamin D measurements are the diagnosis and therapy control of postmenopausal osteoporosis, rickets, osteomalacia, renal osteodystrophy, pregnancy, neonatal hypocalcemia and hyperpara-thyroidism. In addition, a prevalence of subclinical Vitamin D deficiency has been discussed lately in different European countries. Vitamin D intoxication mostly occurs during a large intake of pharmaceutical preparations of Vitamin D and may lead to hypercalcemia, hypercalcuria and nephrocalcinosis in susceptible infants. 3 MATERIAL SUPPLIED Content Kit Components Quantity Microtiter Wells PLATE One holder with precoated strips 12 x 8 wells Wash Buffer WASBUF ELISA wash concentrate 10x 1 x 100 ml Assay Buffer ASYBUF Assay Buffer, ready to use 1 x 15 ml Binding Protein VDBP Vitamin D binding protein (VDBP), lyophilized (blue cap) Precipitation Reagent PREC Precipitation Reagent (blue solution) ready to use 1 x 50 ml Antibody AB Anti-VDBP antibody, (yellow solution), ready to use 1 x 11 ml Standard, NSB STD Standards and NSB, ready to use (white cap) (0; 6.4; 16; 40; 100; 250 nmol/l) 1 vial 7 vials Control A & B CTRL Controls, ready to use (see specification for range) 2 vials Conjugate CONJ Peroxidase labeled conjugate, ready to use 1 x 22 ml TMB Substrate Solution SUB TMB substrate (Tetramethylbenzidine) 2 x 15 ml Stop Solution STOP ELISA stop solution, ready to use 1 x 15 ml 4 MATERIAL REQUIRED BUT NOT SUPPLIED Bidistilled water (aqua bidest.) Laboratory balance Deep freezer -20 C Precision pipettors calibrated to deliver µl Horizontal microtiter plate shaker Multi-channel dispenser or repeating dispenser Centrifuge capable of 3000 x g Vortex-Mixer Standard laboratory glass or plastic vials, cups, etc. (one time products) Microtiter plate reader 450 nm (reference wave length 620 or 690 nm) Version 9.0; 2013/04 - vk - 2 -

4 5 PREPARATION AND STORAGE OF REAGENTS o To run the assay more than one time, make sure that the reagents are carefully stored at conditions stated on the label. Prepare just the appropriate amount necessary for the assay. The kit can be used up to 4 times within the expiry date stated on the label. o Reagents with the less than 100 µl volume should be centrifuged before use to avoid loss of volume. o The WASHBUF (wash buffer concentrate) should be diluted with aqua bidest. 1:10 before use (add 900 ml of a. bidest. to 100 ml concentrate), mix well. Crystals could occur due to high salt concentration in the stock solutions. The crystals have to be redissolved at room temperature or at 37 C using a water bath before dilution of the buffer solutions. The buffer concentrates are stable at 2-8 C until the expiry date stated on the label. Diluted buffer solution could be stored in a closed container at 2-8 C for 1 month. o Incubate the ASYBUF (Assay Buffer) for 10 minutes at 37 C in a water bath before use. o Dissolve vitamin D binding protein (VDBP, blue cap) in 11 ml of Assay Buffer, mix well (no vortexer) and leave at room temperature for 30 min. Reconstituted VDBP is stable at -20 C until expiry date stated on the label. Avoid freezing/thawing cycles. We recommend to aliquote the VDBP (use glass containers). Frozen VDBP have to incubate for 10 minutes at 37 C in a water bath before use. Avoid repeated freeze-thaw cycles! o All other test reagents are ready for use. The test reagents are stable up to the date of expiry (see label of test package) when stored at 2 8 C. 6 SPECIMEN COLLECTION AND PREPARATION 1. Vitamin D is an inert substance. The samples can be stored at room temperature but we recommend storage at 2-8 C after collection when the measurement will be performed within the first 24 hours. Otherwise, the samples have to be stored at -20 C. Avoid repeated freeze-thaw cycles. 2. Hemolysis does not disturb the results; whole blood is not suitable. 3. Untreated lipemic samples lead to wrong results. Therefore we recommend: a. Centrifuge lipemic samples 10 min at x g. The lipid phase floats up. Collect the aqueous phase. b. For highly lipemic samples we recommend using a special delipidation kit (REF.: K1003A). This kit was developed for lipemic samples in clinical laboratories. 4. Indicated incubation times and temperatures have to be observed exactly. 5. Mix the samples well before use. 7 ASSAY PROCEDURE 7.1 Principle of the test This test kit is a competitive protein binding assay for the measurement of 25-OH Vit D. It is based on the competition of 25-OH Vit D present in the sample with 25-OH Vit D tracer, for the binding pocket of vitamin D binding protein (VDBP, Gc-globulin). Since all circulating 25-OH Vit D is bound to VDBP in vivo, samples have to be precipitated with precipitation reagent to extract the analyte. The supernatant can be used without further treatment within the test. In the first incubation step, sample, calibrator, control, the vitamin D binding protein and the VDBP-Antibody, an antibody specific for this protein is added to the solid phase. 25-OH Vit D present in the sample then competes with the tracer, coated on the well for the specific binding site of the binding protein and the VDBP Antibody is bound to the vitamin binding protein. Hence, with increasing concentrations of 25-OH Vit D in the sample, the amount of binding protein, immobilized to the well via the tracer, is reduced. After a washing step to remove unbound components, the quantitation of VDBP is achieved by incubation with a host specific peroxidase labeled antibody using TMB (tetramethylbenzidine) as enzyme substrate. An acidic stopping solution is then added to stop the reaction. The colour converts to yellow. The intensity of the yellow colour is indirectly proportional to the concentration of 25-OH Vitamin D in the sample. A dose response curve of the absorbance unit vs. concentration is generated using the results obtained from the calibrators. Concentrations of 25-OH Vitamin D, present in the patient samples, are determined directly from this curve. Version 9.0; 2013/04 - vk - 3 -

5 7.2 Extraction Procedure Sample, Calibrator, NSB and Control preparation: o Add 50 µl, standard, control, NSB (non specific binding control, assay buffer only) and samples into plastic V tubes (we recommend Eppendorf tubes with a cap) o Add 400 µl of precipitation reagent to standard, control, NSB and samples. Mix thoroughly on a Vortex mixer. Incubate for 30 min at -20 C. o Centrifuge for 10 min at 3000 x g and at 4 C. The supernatant contains the extracted 25-OH Vit D and must be assayed immediately. Please note: Keep samples during the transfer to the microtiterplate at 4 C We recommend reconstitution of VDBP at room temperature for 30 min. This can be done during the incubation of the samples. 7.3 Test Procedure 1. Prior to use in the assay allow all reagents and samples to come to room temperature (18-26 C) and mix gentle, avoid foam formation. 2. Mark the positions of STD (Standards)/SAMPLE/CTRL (Control) on a protocol sheet. 3. Take microtiter strips out of the kit. Store unused strips covered at 2-8 C. Strips are stable until the expiry date stated on the label. 4. Put the microtiter wells and the precipitated STD/SAMPLE/CTRL on a cool block or ice. The microtiter plate and the precipitated STD/SAMPLE/CTRL must be cooled during the complete pipetting step. 5. Add 20 µl of STD/SAMPLE/CTRL (Standard/Sample/Control) in duplicate into respective well. 6. Add 100 µl VDBP (binding protein) into each well, except the NSB. 7. Add 100 µl ASYBUF (Assay Buffer) to the NSB wells. 8. Add 100 µl AB (anti-vdbp antibody) into each well. 9. Cover the plate tightly and incubate for 3 hours at 8-10 C in the dark. 10. Aspirate and wash the wells 5x with 250 µl of diluted Wash Buffer, remove remaining Wash Buffer by hitting the plate against paper towel after the last wash. 11. Add 200 µl CONJ (Conjugate) into each well. 12. Cover the plate tightly and incubate for 1 hour at 8-10 C in the dark. 13. Aspirate and wash the wells 5x with 250 µl of diluted Wash Buffer), remove remaining Wash Buffer by hitting the plate against paper towel after the last wash. 14. Add 200 µl of SUB (Substrate) into each well. 15. Incubate for minutes at room temperature (18-26 C) in the dark. 16. Add 50 µl of STOP (Stop Solution) into each well, shake well. 17. Determine the absorption with an ELISA reader at 450 nm against 620 nm (or 690 nm) as a reference. If no reference wave length is available, read only at 450 nm. If the extinction of the highest standard exceeds the range of the photometer, absorption must be measured immediately at 405 nm against 620 nm (690 nm) as a reference. Version 9.0; 2013/04 - vk - 4 -

6 8 RESULTS The following algorithms can be used alternatively to calculate the results. However, we recommend to use the option 1: 4-parameter-algorithm parameter-algorithm It is recommended to use a linear ordinate for the optical density and a logarithmic abscissa for the concentration. When using a logarithmic abscissa, the zero standard has to be specified with a value smaller than 1 (e. g. 0.01). 2. Point-to-point-calculation We recommend for the optical density a linear ordinate and for the concentration a linear abscissa. 3. Spline-algorithm We recommend for the optical density a linear ordinate and for the concentration a logarithmic abscissa. When using a logarithmic abscissa, the zero standard has to be specified with a value smaller than 1 (e.g. 0.01). The plausibility of the pairs of values should be examined before the automatic evaluation of the results. If this option is not available with the used program, a manual control of the paired values should be made. Standards B/BO Mean [%] B/BO Median [%] SD B/BO [%] n = 17 NSB LIMITATIONS Samples with a 25-OH Vitamin D level greater than the highest calibrator should be diluted with pre-warmed ASYBUF (Assay buffer; 37 C) and re-essayed. Whole blood is not suitable. Untreated lipemic samples lead to wrong results. 10 QUALITY CONTROL Control samples or serum pools should be analyzed with each run of calibrators and patient samples. Results generated from the analysis of the control samples should be evaluated for acceptability using appropriate statistical methods. In assays in which one or more of the quality control sample values lie outside the acceptable limits, the results for the patient sample may not be valid Expected values 1 ng/ml = 2.5 nmol/l 1 nmol/l = 0.4 ng/ml Information from ASBMR 2006 Deficiency (seriously deficient) < 12 ng/ml resp. < 30 nmol/l Insufficiency (deficient) ng/ml resp nmol/l Sufficiency (adequately supplied) > 30 ng/ml resp. > 75 nmol/l Society of Osteology SACHSEN E. V. ( Note The vitamin D production in the skin is high variable and depends on the season- and daily time, degree of latitude, age, sun protection etc. The normal ranges depend on the method used (e. g. vitamin-d-release from the vitamin D binding protein, DBP) and serve only as orientation. Version 9.0; 2013/04 - vk - 5 -

7 Literature references Visser M, Deeg DJ, Puts MT, Seidell JC, Lips P. (2006) Low serum concentrations of 25-hydroxyvitamin D in older persons and the risk of nursing home admission. Am J Clin Nutr. Sep;84(3):616-22; quiz Grant WB, Holick MF.Benefits and requirements of vitamin D for optimal health: a review. (2005) Altern Med Rev. Jun;10(2): Review Wicherts IS, van Schoor NM, Boeke AJ, Visser M, Deeg DJ, Smit J, Knol DL, Lips P. (2007) Vitamin D status predicts physical performance and its decline in older persons. J Clin Endocrinol Metab. Jun;92(6): PERFORMANCE CHARACTERISTICS 11.1 Precision and reproducibility Intra-assay (n = 20) Sample 25-OH Vitamin D [nmol/l] CV [%] Inter-assay (n = 20) Sample 25-OH Vitamin D [nmol/l] CV [%] Cross reactivity 24,25-(OH) 2 Vit D % 25-OH Vit D % 25-OH Vit D % 1,25-(OH) 2 Vit D 3 < 1 % Vit D 2 & D 3 < 1 % Alphacalcidol < % 11.3 Recovery 10 samples were spiked with 156 nmol/l 25-OH Vit D calibrator and measured in the kit. The recovery was 94 per cent. Spike [nmol/l] Vitamin D measured mean [nmol/l] Recovery [%] Sensitivity The sensitivity or minimum detection limit of this assay is defined as the smallest single value that can be distinguished from zero at the 2 x standard variation as confidence limit.(bo + 2 SD) Sensitivity n = 20 Sample Vitamin D mean value [OD] Standard variation Detection limit [nmol/l] Version 9.0; 2013/04 - vk - 6 -

8 11.5 Sample Dilution Two patient serum samples were diluted with pre-warmed ASYBUF (Assay buffer; 37 C). The results in nmol/l are shown below: Sample Dilution Observed [nmol/l] Expected [nmol/l] A undiluted : : : B undiluted : : : PRECAUTIONS o For in vitro diagnostic use only. o The quality control guidelines should be observed. o Human material used in the kit components was tested and found to be negative for HIV, Hepatitis B and Hepatitis C. However, for safety reasons, all kit components should be treated as potentially infectious. o Reagents of the kit package contain sodium azide and thimerosal as bactericides. Sodium azide and thimerosal are toxic. The substrates for the enzymatic color reactions are described to be also toxic and carcinogenic. Contact with skin or mucous membranes has to be avoided. o Stop solution consists of sulfuric acid, a strong acid. Although diluted, it still must be handled with care. It can cause burns and should be handled with gloves, eye protection, and appropriate protective clothing. Any spill should be wiped out immediately with copious quantities of water. 13 TECHNICAL HINTS o Do not interchange different lot numbers of any kit component within the same assay. o Reagents should not be used beyond the expiration date shown on the kit label. o Substrate solution should remain colourless until use. o To ensure accurate results, proper adhesion of plate sealers during incubation steps is necessary. o Avoid foaming when mixing reagents. o The assay should always be performed according the enclosed manual. o Incubation time, incubation temperature and the volumes of the different components are defined by the producer. Any variation of the test procedure, which is not coordinated with the producer, may influence the test results. DRG can therefore not be held responsible for any damage resulting from this. 14 GENERAL NOTES ON THE TEST AND TEST PROCEDURE o This assay was produced and put on the market according to the IVD guidelines of 98/79/EC. o All reagents in the kit package are for in vitro diagnostic use only. o The guidelines for medical laboratories should be observed. o Incubation time, incubation temperature and volumes of the different components are defined by the producer. Any variation of the test procedure, which is not coordinated with the producer, may influence the results of the test. DRG can therefore not be held responsible for any damage resulting from this. o Warranty claims and complaints in respect of deficiencies must be lodged within 14 days of receipt of the product. The product shall be send to DRG together with the complaint in writing. Version 9.0; 2013/04 - vk - 7 -

9 1 VERWENDUNGSZWECK Der hier beschriebene Enzyme-Immuno-Assay (EIA) ist für die quantitative Bestimmung von 25-OH Vitamin D aus humanem Serum und Plasma. Nur zur in vitro Diagnostik. 2 KLINISCHE BEDEUTUNG Vitamin D 3 wird in der Haut unter Einfluss von ultraviolettem Licht (UV-B) gebildet. Vitamin D 2 stammt aus der Nahrung oder künstlichen Supplementen und wird über den Dünndarm aufgenommen. Vitamin D 2 und -D 3 werden vom Organismus in gleicher Weise verstoffwechselt und haben gleiche biologische Aktivität. Vitamin D wird in der Blutbahn an ein Bindungsprotein (DBP) gebunden und in der Leber zu 25-hydroxyvitamin D metabolisiert. Diese 25-Hydroxylierung ist im Wesentlichen vom Substratangebot abhängig. 25-hydroxy-vitamin D hat noch eine geringe biologische Aktivität, liegt aber mit der höchsten Konzentration von allen D-Metaboliten in der Zirkulation vor. Aufgrund seiner hohen Affinität zum Bindungsprotein DBP stellt es die Speicherform des Vitamin D dar. Die Serum/Plasma-Konzentration von 25-hydroxyvitamin D ist deshalb der beste Indikator für die Vitamin D-Versorgung. 25-hydroxyvitamin D wird in der Niere weiter zum 1,25-dihydroxyvitamin D metabolisiert, welches der biologisch aktivste Vitamin D-Metabolit ist und die Funktion eines Hormons hat (D-Hormon). Es reguliert die Calciumaufnahme aus dem Darm, die Knochenmineralisierung, die Osteoblastendifferenzierung und die Knochenmatrixsynthese. Weiterhin wird die neuromuskuläre Funktion durch D-Hormon beeinflusst. Bereits leichter Vitamin D-Mangel mit einem 25(OH)D < 15 ng/ml (37,5nmol/L) führt über die verminderte Calciumaufnahme zu einem sekundären Parathormonanstieg und zu einer gesteigerten Knochenresorption (Chapuy et al. 1996). In der deutschen Normalbevölkerung mit einem Alter über 50 Jahren ist der Vitamin D Status signifikant mit der Knochendichte assoziiert (Scharla et al. 1996). Vitamin D-Mangel ist somit einer der wichtigsten Risikofaktoren insbesondere für die senile Osteoporose. Die frühzeitige Erkennung eines Vitamin D-Mangels ermöglicht eine effektive Prävention von Frakturen durch Vitamin D-Supplementation. Schwerer Vitamin D-Mangel mit einem 25(OH) D < 5 ng/ml (12,5 nmol/l) führt zum Krankheitsbild der Rachitis (Kinder) oder der Osteomalazie (Erwachsene), das durch eine gestörte Knochenneubildung und durch eine mangelhafte Matrix-Mineralisierung gekennzeichnet ist (Scharla 1997). Ein Überschuß an Vitamin D (Medikamenten-Überdosierung) ruft ein Hypercalciämiesyndrom hervor. Häufigkeit von Vitamin D-Mangel: Leichter Vitamin D-Mangel aufgrund mangelnder UV-B-Bestrahlung (Sonnenmangel) oder verminderter Fähigkeit zur cutanen Vitamin D-Synthese (ältere Menschen) ist in Europa sehr häufig (Scharla 1998). In Deutschland oder Frankreich leiden im Winter bis zu einem Drittel der Normalbevölkerung über 50 Jahre an Vitamin D-Mangel. Eine besondere Risikogruppe stellen Immigranten mit dunklerer Hautfarbe dar. Schwerer Vitamin D-Mangel kann bei geriatrischen Patienten in ca. 3 % der Behandlungsfälle nachgewiesen werden (Oster et al. 1983). Aber auch jüngere Menschen können bei Vorliegen von gastrointestinalen Erkrankungen (Leberfunktionsstörungen, Malabsorption) oder bei verstärktem Metabolismus (Medikamente wie Antiepileptika) einen Vitamin D-Mangel aufweisen. In Deutschland werden auch bei "Normalpersonen" häufig niedrigere Spiegel vorgefunden. Diese sind jedoch bereits mit einem sekundären Parathormonspiegel assoziiert. 25-hydroxyvitamin D-Werte < 15 ng/ml werden deshalb von den meisten Autoren übereinstimmend als erniedrigt angesehen (subklinischer Vitamin D-Mangel) (Übersicht: Scharla 1998). Version 9.0; 2013/04 - vk - 8 -

10 3 INHALT DER TESTPACKUNG Inhalt Kit-Komponenten Menge Microtiter Wells PLATE Mikrotitermodul, vorbeschichtet 12 x 8 Vertiefungen Wash Buffer WASBUF ELISA Waschpufferkonzentrat 10x 1 x 100 ml Assay Buffer ASYBUF Assaypuffer, gebrauchsfertig 1 x 15 ml Binding Protein VDBP Vitamin D Bindungsprotein (VDBP, blauer Verschluss) lyophilisiert 1 Fläschchen Precipitation Reagent PREC Fällungsreagenz (blaue Flüssigkeit), gebrauchsfertig 1 x 50 ml Antibody AB Anti-VDBP-Antikörper, gebrauchsfertig (gelbe Flüssigkeit) 1 x 11 ml Standard, NSB STD Standards und NSB, gebrauchsfertig (weißer Verschluss) (O; 6.4; 16; 40; 100; 250 nmol/l) 7 Fläschchen Control A & B CTRL Kontrollen, gebrauchsfertig (Bereich der Spezifikation entnehmen) 2 Fläschchen Conjugate CONJ Konjugat (Peroxidase markiertes), gebrauchsfertig 1 x 22 ml TMB Substrate Solution SUB TMB Substrat, gebrauchsfertig (Tetramethylbenzidine) 2 x 15 ml Stop Solution STOP ELISA Stopplösung, gebrauchsfertig 1 x 15 ml 4 ERFORDERLICHE LABORGERÄTE UND HILFSMITTEL Bidestilliertes Wasser (aqua bidest.) Laborwaage Tiefkühlschrank -20 C Präzisionspipetten und Pipettenspitzen für den Einmalgebrauch mit variablen Volumina von µl Mikrotiterplattenschüttler Multikanal- bzw. Multipipette Zentrifuge, 3000 x g Vortex-Mixer Laborübliche Glas- oder Plastikröhrchen (Einmalartikel) Mikrotiterplattenreader mit Filter 450 nm (Referenzfilter 620 oder 690 nm) 5 VORBEREITUNG UND LAGERUNG DER REAGENZIEN o Beim Mehrfachansatz der Platte ist bitte darauf zu achten, dass die Reagenzien wie in der Vorschrift beschrieben gelagert werden und nur die für den jeweiligen Ansatz benötigten Reagenzienmengen frisch angesetzt werden. Der Kit kann so bis zu 4 x je nach Probenaufkommen (Innerhalb des angegebenen Verfallsdatums) verwendet werden. o Reagenzien mit einem Volumen kleiner 100 µl sollten vor Gebrauch kurz anzentrifugiert werden, um Volumenverluste zu vermeiden. o Der WASHBUF (Waschpufferkonzentrat) muss vor Gebrauch 1:10 in bidestilliertem Wasser (aqua bidest.) verdünnt werden (100 ml Konzentrat ml aqua bidest), gut mischen. Aufgrund der hohen Salzkonzentration in den Stammlösungen kann es zu Kristallbildungen kommen. Die Kristalle lösen sich bei Raumtemperatur bzw. im Wasserbad bei 37 C auf. Das Pufferkonzentrat kann bei 2-8 C bis zum angegebenen Haltbarkeitsdatum aufbewahrt werden. Die verdünnte Pufferlösung ist bei 2-8 C 1 Monat in einem geschlossenen Gefäß haltbar. o Der ASYBUF (Assay Buffer) muss vor Gebrauch 10 Minuten im Wasserbad bei 37 C inkubieren. o Vitamin D-bindendes Protein (Blaue Verschlußkappe): Auflösen in 11 ml Assay-Puffer, gut mischen (nicht vortexen). Mehrfaches Auftauen/Einfrieren soll vermieden werden (Hinweis: es wird ein portioniertes Einfrieren des gelösten VDBP in entsprechenden Aliquots empfohlen (verschließbare Glasgefäße). Eingefrorenes Bindungsprotein muss vor Gebrauch 10 Minuten im Wasserbad bei 37 C inkubieren. o Anmerkung: es wird empfohlen, während der Inkubation der Proben das VDBP bei Raumtemperatur 30 Minuten aufzulösen. o Alle anderen Testreagenzien sind bei 2-8 C zu lagern und bei entsprechender Lagerung bis zum angegebenen Verfallsdatum (siehe Etikett) verwendbar. Version 9.0; 2013/04 - vk - 9 -

11 6 PROBENVORBEREITUNG UND LAGERUNG o Vitamin D ist eine stabile Substanz; die Proben können deshalb in der Regel bei Raumtemperatur gelagert werden. Wir empfehlen aber, die Proben nach der Abnahme bei 2-8 C zu lagern. Sollte innerhalb dieser 24 Stunden keine Messung erfolgen, empfiehlt es sich, die Proben bei 20 C einzufrieren. Ein mehrfaches Einfrieren und Auftauen der Proben ist unter allen Umständen zu vermeiden. o Hämolyse stört das Ergebnis nicht; Vollblut darf aber nicht als Probenmaterial eingesetzt werden. o Lipämisches Probenmaterial führt- falls unbehandelt- zu falschen Ergebnissen. Wir empfehlen daher: Lipämische Proben scharf abzentrifugieren (10 min. bei ca x g) Dabei schwimmt die Fettphase nach oben; die wässrige Phase kann dann durch die Fettschicht hindurch mit der Pipette abgenommen werden. Für stark lipämisches Material empfehlen wir die Verwendung unseres Delipidierungs-Kits (REF: K 1003A), der speziell für lipämisches Probenmaterial im klinischen Labor entwickelt wurde. 4. Bei der Durchführung des Assays sind die in der Anleitung genannten Inkubationszeiten und Temperaturen sorgfältig zu beachten. 5. Vor der Fällung müssen die Proben gut gemischt werden. 7 TESTDURCHFÜHRUNG 7.1 Testprinzip Dieser Testkit arbeitet nach dem Prinzip eines kompetitiven Protein-Bindungs-Assay. Das 25-(OH)-Vitamin D der Probe konkurriert mit dem Tracer (25-OH-Vit. D) um die Bindung an das Vitamin D-bindende Protein (VDBP, Gc-Globulin). Da in vivo das gesamte zirkulierende 25-(OH)-Vit D an VDBP gebunden vorliegt, müssen die Proben mit Fällungsreagenz präzipitiert werden, um den Analyt freizusetzen. Der alkoholische Überstand kann dann ohne weitere Vorbehandlung im Test eingesetzt werden. Im ersten Inkubationsschritt wird Probe bzw. Standard und NSB, Vitamin D Bindungsprotein und ein VDBPspezifischer Antikörper pipettiert. Das 25(OH)-Vit D der Probe (Standard) kompetitiert mit dem Tracer um die spezifische Bindung an das VDBP. Mit steigender Analyt-Konzentration in der Probe (Standard) wird weniger VDBP über den Tracer auf der Platte immobilisiert. Anschließend wird gewaschen (ungebundenes VDBP wird entfernt). Über ein Antikörper-Peroxidase/TMB-System wird das VDBP schließlich quantifiziert. Nach Zugabe einer Stoplösung wechselt die Farbe von blau nach gelb. Die Farbentwicklung ist dabei zur nachgewiesenen Analytmenge (Probe bzw. Standard) umgekehrt proportional. Eine Standardkurve wird erstellt, aus der die Konzentrationen ermittelt werden. 7.2 Extraktion Vorbereitung der Proben, Standards, NSB und Kontrollen: o 50 µl Standard, Kontrolle, NSB und Proben in einem Glas- oder Plastikröhrchen (V-Tube) bei Raumtemperatur pipettieren. o 400 µl Fällungsreagenz zu Standard, Kontrolle, NSB und Proben geben, gut vortexen (10 s) und dann für 30 min. bei 20 C inkubieren. o 10 min. bei 4 C und 3000 x g zentrifugieren. Es ist unbedingt notwendig die zentrifugierten Proben sofort zu kühlen (Eis oder Kühlakku). Der Überstand sollte sofort nach dem Zentrifugieren in die Mikrotiterplatte überführt werden. Die Kühlung der Proben sollte während des Transfers auf die Mikrotiterplatte gewährleistet sein. Wir empfehlen während der Inkubation der Proben, das VDBP bei Raumtemperatur 30 Minuten aufzulösen. Version 9.0; 2013/04 - vk

12 7.3 Pipettierschema 1. Im Test dürfen nur Reagenzien und Proben verwendet werden, welche Raumtemperatur (18-26 C) aufweisen. Vor Gebrauch Reagenzien und Proben vorsichtig mischen. Schaumbildung vermeiden 2. Markieren Sie die Positionen für STD/PROBE/CTRL (Standard/Probe/Kontrolle) im Protokollblatt 3. Nehmen Sie die benötigten Mikrotiterstreifen aus dem Kit. Nicht verwendete Mikrotiterstreifen können abgeklebt bis zum angegebenen Ablaufdatum bei (2-8 C) gelagert werden. 4. Stellen Sie die Mikrotiterplatte und die gefällten STD/PROBE/CTRL auf einen Kühlblock oder Eis. Die Mikrotiterplatte und gefällten STD/PROBE/CTRL müssen während des gesamten Pipettiervorgangs gekühlt werden. (siehe Kap. 7.2 Extraktion) 5. Pipettieren Sie 20 µl STD / PROBE /CTRL in Doppelbestimmung in die Mikrotiterstreifen. 6. Pipettieren Sie 100 µl VDBP (Bindeprotein) in alle Vertiefungen, außer der NSB. 7. Pipettieren Sie 100 µl ASYBUF (Assay Buffer) in die NSB Vertiefungen. 8. Pipettieren Sie 100 µl AB (anti-vdbp-antikörper) in alle Vertiefungen. 9. Streifen abdecken und 3 Stunden bei 8-10 C im Dunkeln inkubieren. 10. Inhalt der Vertiefungen verwerfen und 5x mit je 250 µl verdünntem Waschpuffer waschen. Nach dem letzten Waschschritt Reste von Waschpuffer durch Ausklopfen auf saugfähigem Papier entfernen. 11. Pipettieren Sie 200 µl CONJ (Konjugat) in alle Vertiefungen. 12. Streifen abdecken und 1 Stunde bei 8-10 C im Dunkeln inkubieren. 13. Inhalt der Vertiefungen verwerfen und 5x mit je 250 µl verdünntem Waschpufferwaschen. Nach dem letzten Waschschritt Reste von Waschpuffer durch Ausklopfen auf saugfähigem Papier entfernen. 14. Pipettieren Sie 200 µl SUB (Substrat) in alle Vertiefungen Minuten bei Raumtemperatur (18-26 C) im Dunkeln inkubieren. 16. Pipettieren Sie 50 µl STOP (Stopplösung) in alle Vertiefungen. 17. Extinktion sofort im Mikrotiterplattenphotometer bei 450 nm gegen die Referenzwellenlänge 620 nm (oder 690 nm) messen. Ist keine Referenzwellenlänge vorhanden, wird nur bei 450 nm gelesen. Falls die Extinktion des höchsten Standards den Messbereich des Photometers übersteigt, sollte sofort bei 405 nm gegen 620 nm (690 nm) gemessen werden. 8 ERGEBNISSE Die unten beschriebenen mathematischen Modelle können alternativ zur Auswertung benutzt werden. Wir empfehlen die 4-Parameter Funktion Parameter-Funktion Für die optische Dichte empfehlen wir eine lineare Ordinate und für die Konzentration eine logarithmische Abszisse (bei einer logarithmischen Abszisse muss für den Standard mit der Konzentration von 0 ein Wert kleiner 1 eingegeben werden z. B. 0.01). 2. Punkt-zu-Punkt-Auswertung Für die optische Dichte und für die Konzentration empfehlen wir eine lineare Ordinate bzw. Abszisse. 3. Gewichtete Spline-Funktion Für die optische Dichte empfehlen wir eine lineare Ordinate und für die Konzentration eine logarithmische Abszisse (bei einer logarithmischen Abszisse muss für den Standard mit der Konzentration von 0 ein Wert kleiner 1 eingegeben werden z. B. 0.01). Vor jeder automatischen Auswertung sollte stets eine Kontrolle der Doppelwerte auf Plausibilität ( Ausreißerkontrolle ) durchgeführt werden; falls dies nicht durch das verwendete Programm erfolgt, sollte die Kontrolle manuell durchgeführt werden. Version 9.0; 2013/04 - vk

13 Mustereichkurve Standards B/BO Mittelwert [%] B/BO Median [%] SD B/B0 [%] n = 17 NSB EINSCHRÄNKUNGEN Proben mit einer 25-OH Vitamin D Konzentration größer dem größten Standard sollten mit vorgewärmtem ASYBUF (Assaypuffer; 37 C) verdünnt werden und nochmals im Assay eingesetzt werden. Vollblut kann nicht verwendet werden. Lipämische Proben führen zu falschen Ergebnissen. 10 QUALITÄTSKONTROLLE Der Einsatz von externen Kontrollen(wenn vorhanden) für die interne Qualitätskontrolle wird empfohlen. Wir empfehlen die Kontrollen bei jedem Testansatz mit zumessen. Die Ergebnisse der Kontrollen müssen auf Richtigkeit überprüft werden. Liegen eine oder mehrere Kontrollen außerhalb des angegebenen Bereiches kann Immundiagnostik die Richtigkeit der Proben nicht gewährleisten Erwartete Ergebnisse 1 ng/ml = 2.5 nmol/l 1 nmol/l = 0.4 ng/ml Information from ASBMR 2006 Defizienz (schwerer Mangel) < 12 ng/ml bzw. < 30 nmol/l Insuffizienz (Mangel) ng/ml bzw nmol/l Suffizienz (gut versorgt) > 30 ng/ml bzw. > 75 nmol/l Bund der Osteologen SACHSEN E. V. ( Achtung Die Produktion von Vitamin D in der Haut ist hoch variabel und abhängigvon Jahres- und Tageszeit, Breitengrad, Alter, Sonnenschutz u. a. Die Referenzbereiche sind von der verwendeten Untersuchungsmethode abhängig (z. B. Vitamin-D-Freisetzung von dem Vitamin D Bindeprotein, DBP) und können daher nur zur Orientierung dienen. Literaturreferenzen Visser M, Deeg DJ, Puts MT, Seidell JC, Lips P. (2006) Low serum concentrations of 25-hydroxyvitamin D in older persons and the risk of nursing home admission. Am J Clin Nutr. Sep;84(3):616-22; quiz Grant WB, Holick MF.Benefits and requirements of vitamin D for optimal health: a review. (2005) Altern Med Rev. Jun;10(2): Review Wicherts IS, van Schoor NM, Boeke AJ, Visser M, Deeg DJ, Smit J, Knol DL, Lips P. (2007) Vitamin D status predicts physical performance and its decline in older persons. J Clin Endocrinol Metab. Jun;92(6): Version 9.0; 2013/04 - vk

14 11 TESTCHARAKTERISTIKA 11.1 Präzision und Reproduzierbarkeit Intra-Assay (n = 20) Probe 25-OH Vitamin D [nmol/l] VK [%] Inter-Assay (n = 20) Probe 25-OH Vitamin D [nmol/l] CV [%] 1 39,.8 13,2 2 86,7 11, Spezifität Die Spezifität wurde nachgewiesen durch Bestimmung der Kreuzreaktivität verwandter Substanzen. Die Kreuzreaktivität wird angegeben in Prozent, bezogen auf die 25-(OH)-Vit D-Reaktivität: 24,25-(OH) 2 Vit D % 25-OH Vit D % 25-OH Vit D % 1,25-(OH) 2 Vit D 3 < 1 % Vit D 2 & D 3 < 1 % Alphacalcidol < % 11.3 Wiederfindung 10 Plasmaproben wurden mit 156 nmol/l 25-(OH) Vit D Plasmastandard gespiked und im Assay bestimmt. Die Wiederfindung betrug 94%. Spike [nmol/ml] Vitamin D gemessen [nmol/l] Wiederfindung [%] , Nachweisgrenze Die Nachweisgrenze wurde festgelegt als 5.6 nmol/l. (B0 + 2SD) Probe Mittelwert Vitamin D [OD] Standardabweichung Detektionslimit [nmol/l] Linearität Zwei Patientenproben wurden mit vorgewärmtem ASYBUF (Assaypuffer; 37 C) verdünnt. Die Ergebnisse in nmol/l werden in der folgenden Tabelle angezeigt. Probe Verdünnung Gemessen [nmol/l] Sollwert[nmol/L] A unverdünnt : : : B unverdünnt : : : Version 9.0; 2013/04 - vk

15 12 VORSICHTSMAßNAHMEN o Nur zur in vitro Diagnostik. o Qualitätskontrollen sollten immer mit gemessen werden. o Das für Kitkomponenten verwendete humane Material wurde auf HIV und Hepatitis B und C getestet und für negativ befundet. Dennoch wird empfohlen die Kitkomponenten als Vorsichtsmaßnahme immer wie potentiell infektiöses Material zu behandeln. o Die Kitkomponenten enthalten zum Schutz vor bakteriellen Kontaminationen Natriumazid oder Thimerosal. Natriumazid bzw. Thimerosal sind giftig. Substrate für enzymatische Farbreaktionen sind als giftig und karzinogen beschrieben. Jeder Kontakt mit der Haut oder der Schleimhaut ist zu vermeiden. o Die Stopplösung besteht aus verdünnter H 2 SO 4. H 2 SO 4 ist eine starke Säure und muss auch in verdünnter Form mit Vorsicht benutzt werden. H 2 SO 4 verursacht bei Kontakt mit der Haut Verätzungen. Es sollte daher mit Schutzhandschuhen und Schutzbrille gearbeitet werden. Bei Kontakt mit der Säure muss die verätzte Stelle sofort mit viel Wasser gespült werden. 13 TECHNISCHE MERKMALE o Reagenzien der Kitpackung dürfen nicht mit anderen Chargen gemischt werden. o Die Reagenzien dürfen nach Ablauf des Mindesthaltbarkeitsdatums nicht mehr verwendet werden. o Substratlösung muss vor Gebrauch farblos sein. o Mikrotiterstreifen müssen bei den Inkubationen mit Abdeckfolie abgedeckt sein. o Vermeiden Sie Schaumbildung beim Mischen der Reagenzien. o Der Assay ist immer nach der im Kit beigefügten Arbeitsanleitung durchzuführen. o Inkubationszeit, Temperatur und Pipettiervolumina sind vom Hersteller festgelegt. Jegliche Abweichung der Testvorschrift, die nicht mit dem Hersteller abgesprochen wurde, kann zu fehlerhaften Ergebnissen führen. DRG übernimmt keine Haftung. 14 ALLGEMEINE HINWEISE ZUM TEST o Dieser Kit wurde nach der IVD Richtlinie 98/79/EG hergestellt und in den Verkehr gebracht. o Alle im Kit enthaltenen Reagenzien dürfen ausschließlich zu wissenschaftlichen Zwecken oder, wenn vermerkt, zur in vitro Diagnostik eingesetzt werden. o Für die Qualitätskontrolle sind die für medizinische Laboratorien erstellten Richtlinien zu beachten. o Die charakteristischen Testdaten wie Inkubationszeiten, Inkubationstemperaturen und Pipettiervolumina der verschiedenen Komponenten wurden firmenintern festgelegt. Nicht mit dem Hersteller abgesprochene Veränderungen in der Testdurchführung können die Resultate beeinflussen. Die Firma DRG übernimmt für die hierdurch entstandenen Schäden und Folgeschäden keine Haftung. o Bei Gewährleistungsansprüchen ist das beanstandete Material mit schriftlicher Erklärung innerhalb von 14 Tagen zum Hersteller zurück zu senden. Version 9.0; 2013/04 - vk

16 1 L USO INTESO Il test DRG è inteso per la determinazione quantitativa di 25-OH vitamina D nel plasma e siero. Per il solo uso diagnostico in vitro. 2 RIASSUNTO E SPIEGAZIONI La vitamina D è un ormone steroidale coinvolto nell assorbimento intestinale del calcio e nella regolazione dell omeostasi di calcio. Esistono due forme della vitamina D, chiamate D 3 e D 2, che si assomigliano strutturalmente. La forma D 2 è un prodotto sintetico, che viene prevalentemente assorbito dal cibo arricchito. I livelli fisiologici di vitamina D 3 risultano non soltanto dall assorbimento dal cibo ma anche dalla biosintesi di 7-idrossi-vitamina D (25-OH vitamin D), il metabolita circolante più abbondante. Anche se 1,25-(OH) 2 vitamina D, che è sintetizzata nel rene, rappresenta la forma biologicamente attiva, communemente si accetta di misurare la quantità di 25-OH vitamina D circolante, che fornisce una informazione migliore dello stato di vitamina D dei pazienti e permette la diagnosi della ipovitaminosi (1,2). La concentrazione di vitamina D decresce con l età e una deficienza è communemente trovata tra persone anziane. L applicazione clinica della misura di 25-OH vitamina D è importante per la diagnosi e il controllo terapeutico della osteoporosi postmenopausale, del rachitismo, della osteomalacia, della osteodistrofia renale, della ipocalcemia neonatale e del iperpartiroidismo. In aggiunta, L occorrenza prevalente della deficienza subclinica di vitamina D è stata recentemente discussa per molti paesi europei. L intossicazione da vitamina D occorre raramente durante il consumo di preparati farmaceutici di vitamina D e puó portare a ipercalcemia, ipercalcuria e nefrocalcinosi in bambini suscettibili. 3 MATERIALE FORNITO Componenti del kit Quantità Microtiter Wells PLATE Piastre micropozzetti: Un sostegno con pozzetti ricoperti 12 x 8 pozzetti Wash Buffer WASBUF Tampone di lavaggio: ELISA soluzione tamponata di lavaggio concentrato 10x 1 x 100 ml Assay Buffer ASYBUF Tampone d analisi, pronto all uso 1 x 15 ml Binding Protein VDBP Proteina legante vitamina D (VDBP), liofillizzato (tappo blu) 1 flacone Precipitation Reagent PREC Reagente di precipitazione (soluzione blu) pronto all uso 1 x 50 ml Antibody AB Anti-VDBP anticorpo, (soluzione gialla), pronto all uso 1 x 11 ml Standard, NSB Control A & B Conjugate TMB Substrate Solution Stop Solution STD CTRL CONJ Standard e NSB, pronto all uso (tappo bianco) (0; 6.4; 16; 40; 100; 250 nmol/l) Controlli, pronto all uso (vedi informazioni specifiche per il campo di concentrazione) Tracciante enzimatico, coniugato legato alla perossidasi, pronto all uso 7 flaconi 2 flaconi 1 x 22 ml SUB Soluzione substrato TMB (benzidine tetrametilico) 2 x 15 ml STOP Soluzione d arresto, Reazione d arresto ELISA, pronto all uso 1 x 15 ml 4 MATERIALE RICHIESTO MA NON FORNITO Acqua bidistillata (aqua bidest.) Bilancia analitica Congelatore a -20 C Pipette di precisione calibrate per µl Agitatore orizzontale per piastre Pipette multicanale o a ripetizione Centrifuga per 3000 x g Agitatore vortex Vetreria e recipienti di laboratorio standard (usa e getta) Spettrofotometro per piastre a 450 nm (lunghezza d onda di riferimento a 620 o 690 nm) Version 9.0; 2013/04 - vk

17 5 PREPARAZIONE E CONSERVAZIONE DEI REAGENTI o Per poter usare i reagenti più di una volta, assicurarsi che i reagenti siano conservati alle condizioni indicati sulle etichette. Preparare soltanto la quantità necessaria. Il test kit puó essere usato fino a 4 volte entro la data di scadenza indicata sull etichetta. o Reagenti con meno di 100 µl volumi devono essere centrifugati prima dell uso per evitare perdite di volume. o Il WASHBUF (tampone di lavaggio) (concentrato) deve essere diluito con aqua bidest. 1:10 prima dell uso (aggiungere 900 ml di a. bidest. A 100 ml del concentrato) e agitare bene. o Possono formarsi cristalli a causa della alta concentrazione salina nella soluzione concentrata. I cristalli devono essere redissolti a temperatura ambiente o a 37 C usando un bagnomaria prima della diluizione della soluzione tampone. Il tampone concentrato è stabile a 2-8 C entro la data di scadenza indicata sull etichetta. La soluzione tampone diluita puó essere conservata in un recipiente chiusa a 2-8 C per 1 mese. o Incubare il ASYBUF (tampone d analisi) per 10 minuti a 37 C a bagnomaria prima dell uso. o Dissolvere la proteina legante (VDBP, tappo blu) in 11 ml del tampone d analisi, agitare bene (no vortex) e lasciare riposare a temperatura ambiente per 30 min. VDBP recostituito è stabile a -20 C entro la data indicata sull etichetta. Evitare cicli ripetuti di congelamento e scongelamento! Raccomandiamo di aliquotare la VDBP (in contenitori di vetro). VDBP congelato deve essere incubato per 10 minuti a 37 C a bagnomaria prima dell uso. o Tutti gli altri reagenti sono pronti all uso. I reagenti del test sono stabili fino alla data indicata (vedi etichetta sulla scatola del test) se conservati a 2-8 C. 6 RACCOLTA DEI CAMPIONI E PREPARAZIONE 1. La vitamina D è una sostanza inerta. I campioni possono essere conservati a temperatura ambiente, ma raccomandiamo di conservali a 2-8 C dopo la raccolta, se l analisi viene eseguita entro 24 ore. Altrimenti i campioni devono essere conservati a -20 C. Evitare ripetuti cicli di congelamento e scongelamento. 2. L emolisi non disturba i risultati, sangue intero non puó essere utilizzato. 3. Campioni lipemici non trattati portano a falsi risultati. Raccomandiamo pertanto: a. di centrifugare campioni lipemici per 10 min a x g. La fase lipidica è nel surnatante. Collezionare la fase acquosa. b. Per campioni fortemente lipemici raccomandiamo l uso di un speciale kit per la delipidazione (REF.: K1003A). Questo test è stato sviluppato per campioni lipemici in laboratori clinici. 4. I tempi e le temperature d incubazione devono essere esattamente seguiti. 5. Mescolare i campioni prima dell uso. 7 PROCEDIMENTO D ANALISI 7.1 Principio del test Questo test kit è un test basato sul legame proteico competivo per la determinazione di 25-OH Vit D. Si basa sulla competizione della 25-OH Vit D presente nel campione con il tracciante 25-OH Vit D per il sito di legame della proteina legante 25-OH Vit D (VDBP, Gc-globulina). Dato che tutta la 25-OH Vit D è legata a VDBP in vivo, i campioni devono essere precipitati con il reagente di precipitazione per estrarre l analita. Il surnatante puó essere usato senza ulteriore trattamento per il test. La 25-OH Vit D presente nel campione compete con il tracciante, immobilizzato sul fondo dei pozzetti, per il sito di legame specifico della proteina legante e l anticorpo VDBP si lega alla proteina legante la vitamina. Con quantità crescenti di 25-OH Vit D nel campione, la quantità di proteina immobilizzata nei pozzetti a causa del tracciante si riduce. Dopo un passaggio di lavaggio per rimuovere i componenti liberi, si determina la quantità di VDBP incubando con un anticorpo specifico legato alla perossidasi e usando TMB (benzidine tetrametilico) come substrato dell enzima. Una soluzione d arresto acida è poi aggiunta per fermare la reazione. Il colore vira al giallo. L intensità del colore è indirettamente proporzionale alla concentrazione di 25-OH vit D nel campione. Si costruisce una curva di dosaggio-risposta dei valori di assorbanza contro le concentrazioni usando i risultati ottenuti dai calibratori. Concentrazioni di 25-OH Vit D presenti nei campioni dei pazienti sono determinati direttamente da questa curva. Version 9.0; 2013/04 - vk

18 7.2 Procedimento d estrazione Preparazione di campioni, calibratori, NSB e controlli: o Aggiungere 50 µl degli standards, dei controlli, del NSB (controllo del legame aspecifico, soltanto tampone del test) e dei campioni in tubetti di plastica V (raccomandiamo tubetti Eppendorf con tappo) o Aggiungere 400 µl del reagente di precipitazione agli standard, ai controlli, NSB e campioni. Mescolare accuratamente su un vortex. Incubare per 30 min a -20 C. o Centrifugare per 10 min a 3000 x g a 4 C. Il surnatante contiene l OH-25 Vit D estratto e deve essere analizzato immediatamente. Nota: mantenere i campioni a 4 C durante il trasferimento nei pozzetti. Raccomandiamo la ricostituzione di VDBP a temperatura ambiente per 30 min. Il tempo di incubazione dei campioni puó essere usato per la ricostituzione. 7.3 Procedimento del test 1. Prima dell uso permettere a tutti i reagenti e ai campioni di raggiungere temperatura ambiente (18-26 C) e mescolare gentilmente, evitare la formazione di schiume. 2. Annotare la posizione degli STD (standards)/campioni/ctrl (controlli) su un foglio protocollo. 3. Prelevare le strisce dei pozzetti dal test kit. Conservare strisce non utilizzate coperti a 2-8 C. Le strisce sono stabili fino alla data di scadenza indicata sull etichetta. 4. Posare i pozzetti e i STD/CAMPIONI/CTRL precipitati su un sostegno freddo o su ghiaccio. La piastra dei micropozzetti e i STD/CAMPIONI/CTRL precipitati devono essere raffreddati per la durata di tutti i passaggi. 5. Aggiungere 20 µl di STD/CONTROLLI/CTRL (Standard/campioni/controlli) in doppio nei rispettivi pozzetti. 6. Aggiungere 100 µl VDBP (proteina legante) ad ogni pozzetto, eccetto il NSB. 7. Aggiungere 100 µl del ASYBUF (tampone del test) ai pozzetti NSB. 8. Aggiungere 100 µl dell AB (anti-vdbp-anticorpo) ad ogni pozzetto. 9. Coprire la piastra accuratamente e incubare per 3 ore a 8-10 C al buio. 10. Aspirare e lavare i pozzetti 5 volte con 250 µl del tampone di lavaggio diluito, rimuovere il tampone rimasto appoggiando la piastra capovolta su della carta assorbente dopo l ultimo lavaggio. 11. Aggiungere 200 µl del CONJ (tracciante) ad ogni pozzetto. 12. Coprire la piastra accuratamente e incubare per 1 ora a 8-10 C al buio. 13. Aspirare e lavare i pozzetti 5 volte con 250 µl del tampone di lavaggio diluito, rimuovere il tampone rimasto appoggiando la piastra capovolta su della carta assorbente dopo l ultimo lavaggio. 14. Aggiungere 200 µl del SUB (substrato TMB) ad ogni pozzetto. 15. Incubare per minuti a temperatura ambiente (18-26 C) al buio. 16. Aggiungere 50 µl della STOP (soluzione d arresto) in ogni pozzetto, agitare bene. 17. Determinare l assorbanza con uno spettrofotometro ELISA a 450 nm contro la lunghezza d onda di riferimento di 620 nm (o 690 nm). Se non si dispone di una lunghezza d onda di riferimento, leggere soltanto a 450 nm. Se l estinzione dello standard più alto eccede il campo dello spettrofotometro, l assorbanza deve essere determinata immediatamente a 405 nm contro 620 nm (o 690 nm) come riferimento. Version 9.0; 2013/04 - vk

19 8 RISULTATI I seguenti algoritmi possono essere usati alternativamente al calcolo dei risultati. Comunque raccomandiamo di usare il primo metodo dell algoritmo a 4 parametri. 1. algoritmo a 4 parametri Si raccomanda di usare l ordinata lineare per la densità ottica e l ascisse logaritmica per le concentrazioni. Se si usa l ascisse logaritmica, lo standard zero deve essere specificato con un valore minore di 1 (p.es. 0.01). 2. Calcolo punto-a-punto Raccomandiamo una ordinata lineare per la densità ottica e una ascisse lineare per le concentrazioni. 3. algoritmo Spline Raccomandiamo una ordinata lineare per la densità ottica e un ascisse logaritmico per le concentrazioni. Se si usa l ascisse logaritmica, lo standard zero deve essere specificato con un valore minore di 1 (p.es. 0.01). La plausibilità delle coppie dei valori deve essere esaminata prima della valutazione automatica. Se questa opzione non è possibile con i programmi usati, si raccomanda una valutazione manuale delle coppie. Standard B/BO medio [%] B/BO mediano [%] DS B/BO [%] n = 17 NSB LIMITAZIONI Campioni con livelli di 25-OH Vit D maggiori del calibratore più concentrato devono essere diluiti con ASYBUF (Tampone d analisi ; 37 C) e riesaminati. Sangue intero non è adatto. Campioni lipemici non trattati portano a risultati falsi. 10 CONTROLLO QUALITÁ Sieri di controllo o un pool di siero dovrebbe essere analizzato in parallelo ad ogni determinazione. I risultati generati dei sieri di controllo devono essere analizzati per l accettabilità usando appropriati metodi statistici. Test che contengono uno o più valori dei controlli di qualità fuori dai limiti possono essere non validi Valori aspettati 1 ng/ml = 2.5 nmol/l 1 nmol/l = 0.4 ng/ml Informazione dall' ASBMR 2006 Deficienza (seriamente deficiente) < 12 ng/ml risp. < 30 nmol/l Insufficienza (defieciente) ng/ml risp nmol/l Sufficienza (adeguatamente dotato) > 30 ng/ml risp. >75 nmol/l Societa' di Osteologia SACHSEN e.v. ( Nota La produzione cutanea di vitamina D e' altamente variabile e dipende dallla stagione e dall'orario, dalla latitudine, dall'eta', dalla protezione solare, ecc. I campi normali dipendono dal metodo usato (p.es. rilascio di vitamina D dalla proteina legante vitamina D, DBP) e servono soltanto come orientamento. Version 9.0; 2013/04 - vk

20 Literature references Visser M, Deeg DJ, Puts MT, Seidell JC, Lips P. (2006) Low serum concentrations of 25-hydroxyvitamin D in older persons and the risk of nursing home admission. Am J Clin Nutr. Sep;84(3):616-22; quiz Grant WB, Holick MF.Benefits and requirements of vitamin D for optimal health: a review. (2005) Altern Med Rev. Jun;10(2): Review Wicherts IS, van Schoor NM, Boeke AJ, Visser M, Deeg DJ, Smit J, Knol DL, Lips P. (2007) Vitamin D status predicts physical performance and its decline in older persons. J Clin Endocrinol Metab. Jun;92(6): CARATTERISTICHE DEL TEST 11.1 Precisione e riproducibilità Intra-assay (n = 20) campione 25-OH Vitamin D [nmol/l] CV [%] Inter-assay (n = 20) campione 25-OH Vitamin D [nmol/l] CV [%] Reattività incrociata 24,25-(OH) 2 Vit D % 25-OH Vit D % 25-OH Vit D % 1,25-(OH) 2 Vit D 3 < 1 % Vit D 2 & D 3 < 1 % Alfacalcidolo < % 11.3 Ritrovamento A 10 campioni sono stati aggiunti 156 nmol/l 25-OH Vit D calibratore e i campioni sono analizzati con il test. Il ritrovamento è stato definito di essere 94 %. Aggiunta [nmol/l] Medio di vitamin D misurato [nmol/l] ritrovamento [%] Sensitività La sensitività o il minimo di rintracciabilità di questo test è definito come il valore singolo minimo che puó essere distinto dal valore zero ad un livello di confidenza uguale a 2 x variazioni standard (B0 + 2 SD). Sensitività n = 20 campione Vitamin D valore medio [OD] Variazione standard Limite inferiore [nmol/l] Version 9.0; 2013/04 - vk