LUNA HILIC Methodenentwicklungsansatz

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1 LUA HILIC Polare, hydrophile Substanzen, die im Reversed Phase Modus nicht oder kaum zurückgehalten werden, erfahren im HILIC Modus eine maximale Retention. Dabei beobachtet man häufig eine Umkehr der Elutionsreihenfolge der Substanzen. 1. Im HILIC Modus führt ein höherer rganikanteil im Eluenten zu einer Erhöhung der Retention der Analyten. 2. Vermeiden Sie 100% rganik oder 100% Wasser als Eluent. 100% rganik führt zur Diffusion des Wassers aus den Poren und damit zu einem Verlust der Retention. 3. Der klassische HILIC Modus beruht auf einer einfachen flüssig/flüssig Verteilung zwischen wässriger und organischer Phase. Ionenaustauschmechanismen sollten durch die Wahl der geeigneten Säule (wie der Luna HILIC) vermieden werden. Reine Silica-Phasen nutzen Kationenaustauschmechanismen, was ihren Einsatz bei der Analyse von neutralen und sauren Verbindungen einschränkt. 4. HILIC Phasen sind nur bedingt für schnelle Gradienten und kurze Equilibrierzyklen geeignet. Eine unzureichende Equilibrierung kann zu sich verschiebenden Retentionszeiten führen. 5. Aufgrund der zunehmenden Viskosität des Laufmittels nimmt der Rückdruck während des Gradienten zu. 6. Stellen Sie sicher, dass das Injektionslösungsmittel einen hohen rganikanteil besitzt. Ein Verhältnis von 5:1 oder höher ist zu empfehlen.

2 LUA HILIC 7. Luna HILIC Säulen werden in Acetonitril / 100 mm Ammoniumformiatpuffer, ph 3,2 (90:10) geliefert und können direkt nach der Equilibrierung mit der mobilen Phase eingesetzt werden. Es sollten hierfür mindestens 20 Säulenvolumina verwendet werden. 8. Luna HILIC Säulen werden in Acetonitril / Wasser (80:20) gelagert. 9. Die Verwendung von anorganischen Puffern wie z.b. Phosphatpuffer ist zu vermeiden. Aufgrund ihrer geringen Löslichkeit in organischen Lösungsmitteln besteht die Gefahr des Ausfallens des Puffers und damit einer Schädigung der Säule. 10. Bei Gradientenmethoden sollte die effektive Pufferkonzentration konstant gehalten werden. Dies bedeutet, dass bei HPLC-Systemen mit binären Pumpen unterschiedliche Ausgangskonzentrationen des Puffers für Eluent A und B zu verwenden sind. 11. Einige Hinweise zu generischen Gradienten, Puffer und Ionenstärke, die als Ausgangspunkt für Ihre HILIC Methodenentwicklung dienen können:

3 LUA HILIC Generell sollten bei der Methodenentwicklung zwei unterschiedliche ph-werte des Eluenten überprüft werden. Empfohlene Puffer sind 100 mm Ammoniumformiat, ph 3,2 und 100 mm Ammoniumacetat, ph 5,8. Die effektive Pufferkonzentration sollte während des Gradienten konstant bei 5 mm gehalten werden. Bei quaternären Pumpen erreicht man dies, indem man den Puffer (Eluent C) konstant bei 5% hält und lediglich den Wasseranteil (Eluent B) erhöht (s.o.). Bei binären Pumpen können die mobilen Phasen A und B vorgemischt werden, wobei Eluent A aus Acetonitril / Wasser / 100 mm Puffer (90:5:5) und Eluent B aus Acetonitril/Wasser / 100 mm Puffer (50:45:5) besteht. Der Gradient wird von 100% A auf 100% B gefahren. Herstellung für Formiat- und Acetatpuffer : 100 mm Ammoniumformiatpuffer, ph 3,2: 6,3 g Ammoniumformiat werden in Wasser (MQ) gelöst. Man gibt 0,5 ml Ameisensäure zu und füllt mit Wasser (MQ) auf 1 L Gesamtvolumen auf. ach dem Durchmischen wird der ph-wert überprüft. 100 mm Ammoniumacetatpuffer, ph 5,8: 7,7 g Ammoniumacetat werden in Wasser (MQ) gelöst. Man gibt 0,5 ml Essigsäure zu und füllt mit Wasser (MQ) auf 1,L Gesamtvolumen auf. ach dem Durchmischen wird der ph-wert überprüft.

4 LUA HILIC Ausgewählte Probensubstanzen p-aminobenzoesäure (1) pk a 4,7, H + pk a 2,7 logp 0,83 icotinamid (2) H + pk a 3,35 logp 0,37 Riboflavin (3) pk a 10,2 logp -1,46 icotinäure (4) pk a 4.7, H + pk a 3,0 logp 0,36 Pyridoxin (5) H + pk a 5,6, pk a 8,6 logp 0,77 H H H H H H 2 H H 2 H H H H Thiamin (6) H + pk a 5,5 logp 4,6 Ascorbinsäure (7) pk a 4,1, 11,2 logp 1,85 Vitamin B12 (8) pk a 1,59 logp 0,90 Folsäure (9) pk a 2,7, 4,1, 8,9 logp -0,02 H 2 H 2 H 2 Cl - + S H H H H H H 2 Co H H 2 H H H H - P H H H 2 H 2 H H H H H H 2 H

5 1. % rganik - Gradientenelution LUA HILIC K = 2.3 k 0 2,3 Isokratisch 90 % Acetonitril - schwache Retention % Acetonitril K = k > 14 Isokratisch 50 % Acetonitril - Starke Retention min

6 LUA HILIC 2. Puffer ph Luna HILIC ph 5,8 Ammoniumacetat ph 5,8, 100 mm (~ 5 mm effektive Konzentration) ph 3,2 Ammoniumformiat ph 3,2, 100 mm (~ 5 mm effektive Konzentration)

7 LUA HILIC Spezifikationen Phase Cross-linked Diol Partikelform/-größe Sphärisch; 3 µm, 5 µm Porenweite 200 Å berfläche 200 m 2 / g Endcapping - Kohlenstoffbeladung - ph-bereich 1,5 8,0 Luna ist ein eingetragegenes Markenzeichen von Phenomenex, Inc Phenomenex, Inc. Alle Rechte vorbehalten.

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