Wirkung der Blockade des Angiotensin II ATi-Rezeptors auf die Funktion und die Struktur des Herzens der Streptozotodn-diabetischen Ratte
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1 Wirkung der Blockade des Angiotensin II ATi-Rezeptors auf die Funktion und die Struktur des Herzens der Streptozotodn-diabetischen Ratte Inaugural-Dissertation zur Erlangung des Doktorgrades der Mathematisch-Naturwissenschaftlichen Fakultät der Universität zu Köln vorgelegt von Carsten Hönack f\ aus Leverkusen Copy Team GmbH, Köln 1996
2 Inhalt Verzeichnis der verwendeten Abkürzungen i 1 Einleitung 1.1 Diabetes Kardiale Dysfunktionen im Diabetes Veränderte Gefäßreaktivität und Remodeling" im Diabetes Aktivierung des Renin-Angiotensin-Systems im Diabetes? Zielsetzung 6 2 Material und Methoden 2.1 Verwendete Chemikalien und Geräte Tierexperimentelle Techniken Diabetes Fosinopril Angiotensin II Rezeptor (AT )AntagonistICID Organentnahme Morphologische Methoden Herz-Perfusion : Messung des koronaren Flusses und Druckes Gewebefixierung und Präparation des linken Papillarmuskels Morphometrische Analyse der Kapillaren Trichrom-Färbung Nachweis und Quantifizierung von Glukosetransporter-Proteinen Zellmembran-Präparationen und deren Charakterisierung Herz-Gesamtmembranen Fraktionierte Herzmembranen (Saccharose-Gradienten- Zentrifugation) K + -stimulierte p-nitrophenylphosphatase (Na +,K + -ATPase)... 14
3 Präparation von Hirnmembranen (Standard für GLUT 1) Proteinbestimmung mit Bicinchoninsäure Immunochemischer Nachweis von GLUT1 und GLUT SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese(SDS-PAGE) Western Blot Inkubation mit Antiseren gegen GLUT 1 und GLUT Nachweis des ersten Antikörpers mit 125 I-Protein A Signalauswertung und Statistik Hydroxyprolin-Bestimmung (Prockop und Udenfriend) Bestimmung von Clucose, Insulin und Kreatinin Bestimmung der Aktivität des Angiotensin I Konversions-Enzymes Isolierung und Nachweis spezifischer mrna Northern Blot RNA-Präparation: CsCl-Gradienten Methode (Chirgwin) RNA-Präparation: Phenol - Guanidiniumisothiocyanat- Methode (Chomczynski undsacchi) Vergleich beider Präparations-Methoden Formaldehyd-Gel Kapillartransfer der RNA (Northern Blot) cdna-gewinnung Transformation Plasmidpräparation Restriktion und Gel-Elution Agarose-Gele zur Auftrennung von DNA Hybridisierung Prähybridisierung Radioaktive Markierung (Random Primed Labeling) doppelsträngiger DNA '-Markierung (Endlabeling) von Oligonukleotiden Trennung von DNA und nichtinkorporierten Nukleotiden Hybridisierung von immobilisierter RNA und markierter 35 DNA Transkriptgrößen 36
4 3 Ergebnisse 3.1 Tierexperimentelle Daten Einfluß von Diabetes und Behandlung auf die Herzfunktion Mikroskopische Strukturanalysen Herzfunktion Myozytendurchmesser Myosin schwere Kette (MHC) mrna Angiotensin I Konversions-Enzym (ACE) Glukosetransporter Protein GLUT4 mrna Einfluß von Diabetes und Angiotensin II Rezeptor-Blockade auf das kardiale Gefäßsystem Kapillaren Bindegewebe, Hydroxyprolingehalt und Kollagen Ia(l) mrna Zusammenfassung der Ergebnisse 61 4 Diskussion Diabetisches Tiermodell Einfluß von Diabetes und Angiotensin-Rezeptorblockade auf Herzfunktion und Morphologie Aktivierung des Renin-Angiotensin-Systems Einfluß von Diabetes und Behandlung auf die Myosin-Isoenzym-Expression Einfluß der Behandlung auf den Glukosetransporter GLUT Mögliche Quellen reaktiver Sauerstoffspezies im Diabetes Zum Mechansimus der Angiotensin II-Wirkung Ausblick 88
5 5 Zusammenfassung 90 6 Literaturverzeichnis 93 Anhang I: Standardpuffer Anhang II: Konzentrations- und Qualitätsbestimmung von Nukleinsäuren Anhang III: Verzeichnis benutzter cdna-plasmide und Oligonukleotide sowie Restriktionsbedingungen Anhang IV: verwendete Molekulargewichtsmarker Anhang V: Kurzschreibweisen für Nukleotide und Aminosäuren
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