Einfluss von Acetylsalicylsäure auf die Ausschüttung endothelialer Progenitorzellen

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1 Aus der Medizinischen Klinik II des St. Josef-Hospital Bochum -Universitätsklinikder Ruhr-Universität Bochum Direktor: Prof. Dr. med. A. Mügge Einfluss von Acetylsalicylsäure auf die Ausschüttung endothelialer Progenitorzellen Inaugural-Dissertation zur Erlangung des Doktorgrades der Medizin einer Hohen Medizinischen Fakultät der Ruhr-Universität Bochum vorgelegt von Christian Andreas Lenz aus Bochum 2010

2 Dekan: Prof. Dr. med. K. Überla Referent: Prof. Dr. med. A. Mügge Korreferent: Prof. Dr. med. D. Horstkotte Tag der mündlichen Prüfung:

3 denen, die mich begleitet, ermutigt und unterstützt haben

4 Inhaltsverzeichnis 1. Einleitung 1.1. Epidemiologie der arteriellen Hypertonie Pathogenese der arteriellen Hypertonie Hypertonie und Gefäßsystem Endothel Endotheliale Dysfunktion und primäre Hypertonie Endotheliale Progenitorzellen Bedeutung der Eicosanoide Biochemie des Eicosanoid-Stoffwechsels Cyclooxygenase-System Funktion der Eicosanoide Einfluss von COX-Inhibitoren auf die endotheliale Funktion Acetylsalicylsäure Einfluss der COX-Hemmung durch Acetylsalicylsäure auf die Endothelfunktion Problemstellung Patienten & Methoden 2.1. Isolierung & durchflusszytometrische Messung der EPC Patienten Methodik.37 Exkurs Funktionsprinzip der Durchflusszytometrie Durchflusszytometrische Messung Isolierung und Kultivierung der EPC Patienten Methodik

5 3. Ergebnisse 3.1. Einfluss ASS-Bolusgabe auf die Anzahl der EPC Einfluss ASS-Bolusgabe auf Anzahl und Morphologie der EPC Diskussion Literaturverzeichnis

6 Abkürzungsverzeichnis ANOVA ACE ADP ANP ASS ATP BMI Ca 2+ camp cgmp cgtp CO 2 CoA COX EDTA EGF EPC Et al. FITC FSC HLP HMG H 2 O 2 INR IP 3 ISHAGE L-Arg LDL analysis of variance Angiotensin-Converting-Enzym Adenosindiphosphat Atrial Natriuretisches Peptid Acetylsalicylsäure Adenosintriphosphat Body Mass Index Calcium-Ionen cyclisches Adenosinmonophosphat cyclisches Guanosinmonophosphat cyclisches Guanosintriphosphat Kohlenstoffdioxid Coenzym-A Cyclooxygenase Ethylendiamintetraacetat Epidermal-Growth-Factor Endotheliale Progenitorzellen et alia Fluorescin-Isothiocyanat forward scatter Hyperlipoproteinämie 3-Hydroxy-3-Methylglutaryl Wasserstoffperoxid International Normalized Ratio Inositol-1,3,4-tris-phosphat International Society of Hematotherapy and Graft Engineering L-Arginin Low Density Lipoprotein 3

7 MBD mrna MW NO (e)nos n.s. NAD(P)H NSAID PBS PerCP PG PGI 2 PMNC ROS SEM SOD SSC membranbindende Domäne messenger RNA Mittelwert Stickstoffmonoxid (endotheliale) NO-Synthase nicht signifikant Nicotinamidadenindinukleotid(phosphat) nichtsteroidale Antiphlogistika Phosphate buffered saline Peridin-Chlorophyllprotein Prostaglandin Prostaglandin I 2 oder Prostacyclin Peripheral blood mononuclear cells reaktive Sauerstoffspezies standard error of the mean Superoxiddismutase side scatter TXA 2 Thromboxan A 2 VE-Cadherin Vascular Endothelial Cadherin VEGF(R) Vascular Endothelial Cell Growth Factor (Receptor) vs. versus WHO World Health Organisation 4

8 1. Einleitung 1.1. Epidemiologie der arteriellen Hypertonie Unter arterieller Hypertonie wird, unabhängig von der Ätiologie, die chronische Erhöhung des systolischen und/oder diastolischen arteriellen Blutdrucks verstanden. Gemäß den Definitionen der World Health Organisation (WHO) wird ein Blutdruckwert systolisch höher 140 mmhg und/oder diastolisch höher 90 mmhg als hyperton beschrieben. Eine klare Grenze zwischen normalem und pathologisch erhöhtem Blutdruck gibt es in der Praxis jedoch nicht, wodurch sich der Übergang vom hochnormalen Blutdruck zu der Grenzwerthypertonie nicht nur sprachlich, sondern auch in der Praxis fließend gestaltet. Daher gibt es Überlegungen, die arterielle Hypertonie individuell ab der Blutdruckhöhe zu definieren, von der an die Abklärung und Behandlung für den Patienten von Vorteil ist [78, 175]. Einen Überblick über die jeweilige Klassifikation anhand der systolischen und/ oder diastolischen Blutdruckwerte veranschaulicht Tabelle 1: Tabelle 1: Definition und Klassifikation von Blutdruckbereichen in mmhg (wenn systolischer und diastolischer Blutdruck bei einem Patienten in unterschiedliche Klassen fallen, sollte die höhere Klasse Anwendung finden). Modifiziert nach den WHO-Richtlinien [310]. Klassifikation Systolischer Blutdruck (in mmhg) Diastolischer Blutdruck (in mmhg) Optimal < 120 < 80 Normal < 130 < 85 Hoch-normal

9 Leichte Hypertonie (Schweregrad I) Grenzwerthypertonie Mittelschwere Hypertonie (Schweregrad II) Schwere Hypertonie (Schweregrad III) Isolierte systolische Hypertonie 140 < 90 - systolische Grenzwerthypertonie < 90 Die Bedeutung der arteriellen Hypertonie liegt in ihrer Häufigkeit. Die Prävalenz wird in den westlichen Industrienationen mit 20-25% angegeben. Mindestens 20% der Hypertonie-Patienten wissen nicht um ihre Erkrankung, von den bekannten Patienten werden 20% nicht und 20% unzureichend behandelt [79]. Das Fehlen und die Unspezifität möglicher anfänglicher Beschwerden sind Erklärungsansätze. Als erstes typisches Anzeichen ist allenfalls ein frühmorgendlich auftretender Kopfschmerz, besonders im Bereich des Hinterkopfes, beschrieben [79]. Schwindel, Nervosität, Herzschmerzen, Präkordialschmerz, Nasenbluten und Ohrensausen sind weitere mögliche Symptome. Erst die Spätkomplikationen führen häufig zu den ersten zielführenden Krankheitsanzeichen. Als Folgekrankheiten bei Patienten mit einer langjährigen Hypertonieanamnese stehen Veränderungen am Gefäßsystem (periphere arterielle Verschlusskrankheit, Bauchaortenaneurysma, Aortendissektion), am Herzen (koronare Herzkrankheit, Kardiomyopathie, Linksherz-Druckhypertrophie), am Gehirn (zerebrale Ischämie, hypertonische Massenblutung, akute Hochdruckenzephalopathie) und an der Niere (Mikroalbuminurie, benigne 6

10 hypertensive Nephrosklerose mit Albuminurie, arterio-/ arteriolosklerotische Schrumpfniere mit Niereninsuffizienz) im Vordergrund. Für die Entstehung einer Arteriosklerose und einer koronaren Herzkrankheit zählt die arterielle Hypertonie zu den Risikofaktoren erster Ordnung und gilt als zentraler Risikofaktor für die zerebrale Ischämie. Patienten mit hoch-normalem Blutdruck weisen statistisch bereits ein deutlich gesteigertes Risiko auf, an den oben genannten Komplikationen zu erkranken, allerdings fehlen hier kontrollierte klinische Studien, die die Effektivität einer blutdrucksenkenden Intervention belegen [130]. Bei der Grenzwerthypertonie oder höher gradigeren Bluthochdruckformen existieren dagegen Belege für den Benefit einer medikamentösen Therapie [130] Pathogenese der arteriellen Hypertonie Nur selten führen Grunderkrankungen, wie zum Beispiel die Nierenarterienstenose, Glomerulonephritiden, Aortenisthmusstenose oder das Phäochromozytom durch ihre Komplikationen zu Bluthochdruck, der so genannten sekundären Hypertonie. Dem gegenüber steht die sogenannte primäre Hypertonie. Ihr Vorliegen kann jedoch nur durch Ausschluss einer sekundären Hypertonie angenommen werden. Sie betrifft aktuell etwa 90% der Patienten in den Industrieländern. Der genaue Pathomechanismus der primären Hypertonie ist unklar. Sie tritt in der Regel erst nach dem 30. Lebensjahr auf [79]. Viele Untersuchungen zeigen, dass unter anderem genetische Faktoren Auswirkungen auf Entstehung, Manifestation und Verlauf der Erkrankung haben. In etwa 60% der Fälle wird die primäre Hypertonie vererbt [79]. Familienstudien belegen, dass die Blutdruckwerte von biologischen Kindern höher mit den Blutdruckwerten der Eltern korrelieren als die Blutdruckwerte von adoptierten Kindern mit den Blutdruckwerten ihrer Adoptiveltern [18, 104]. 7

11 Jeunemaitre und Mitarbeiter veröffentlichten 1997 eine Arbeit über einen Polymorphismus im Gen für Angiotensinogen bei Patienten mit primärer Hypertonie [131]. Des Weiteren wurden Polymorphismen und Expressionsveränderungen in Genen entdeckt, wie zum Beispiel im Angiotensin-Converting-Enzym [156], in der endothelialen NO-Synthase [115, 126, 182, 240, 263], in ß2-Rezeptoren [113], im Atrialen Natriuretischem Peptid und dessen Rezeptor [77, 133, 191, 218, 226] und im Insulinrezeptor [260], die ebenfalls mit der primären Hypertonie in einem Zusammenhang stehen. Diese Vielzahl von möglichen genetischen Abweichungen bestärkt die Hypothese der polygenen Ätiologie der primären Hypertonie. Exogene Einflüsse scheinen eine bedeutende Rolle in der Manifestation einer Hypertonie zu spielen. So können psychische und soziale Faktoren, wie zum Beispiel beruflicher Stress oder zu wenig Schlaf, zu einer pathologischen Modifikation des Blutdrucks führen [49, 90, 150, 236]. Auch falsche Ernährungsgewohnheiten und ein erhöhter Sympathikotonus scheinen die Entwicklung einer Hypertonie begünstigen zu können. So weisen adipöse Menschen häufig einen erhöhten Symphatikotonus auf [238]. Vermehrtes Fettgewebe kann in seiner endokrinen Funktion zu einer erhöhten Sekretion von Leptin führen. Durch den erhöhten Leptin-Spiegel werden das sympathische Nervensystem und die Sekretion von Angiotensinogen so beeinflusst, dass schlussendlich eine Blutdruckerhöhung resultiert [54, 75, 111, 189]. Die INTERSALT-Studie zeigte, dass ein übermäßiger Salzkonsum bei salzempfindlichen Personen ebenfalls für die Entwicklung einer primären Hypertonie von Bedeutung ist [223]. Die Auswirkungen auf die Entstehung, Manifestation und Verlauf der Erkrankung, sowie die Wechselwirkungen mit anderen endogenen und exogenen Abweichungen, sind größtenteils unbekannt. 8

12 1.3. Hypertonie und Gefäßsystem Der Blutdruck ist hämodynamisch das Resultat aus dem Produkt von Herzzeitvolumen und Gefäßwiderstand. Charakteristischerweise findet sich oft bei Patienten mit primärer Hypertonie ein abnormer Anstieg des systemischen Gefäßwiderstandes. Die Gründe dieser Widerstandserhöhung sind im Einzelnen noch ungeklärt, allerdings deutet vieles auf eine multifaktorielle pathophysiologische Genese hin. So führt die primäre Hypertonie zu einem strukturellen Remodelling der Gefäße, woraus zuletzt eine Widerstandserhöhung resultiert [195, 222, 231]. Ebenfalls scheint eine Reduzierung der Kapillardichte, gemessen bei Patienten mit primärer Hypertonie, einen Anstieg des Gefäßwiderstands zu bewirken [6, 7, 106]. Neben diesen strukturellen Modifikationen zeigen sich auch funktionelle Veränderungen des Gefäßsystems, die in eine Steigerung des Gefäßwiderstandes involviert sind. Patienten mit primärer Hypertonie weisen häufig eine Dysbalance der an der Regulation des Gefäßtonus beteiligten Faktoren in Richtung Vasokonstriktion auf. So zeigen Untersuchungen, dass die NO-abhängige Vasodilatation bei Patienten mit primärer Hypertonie abgeschwächt bis aufgehoben ist [39, 112, 204] Endothel Das Endothel wird aus einer einreihigen, dem Gefäßlumen zugewandten Zellschicht gebildet, das lange Zeit als eine funktionslose Zellreihe angesehen wurde, die eine Barriere zwischen Blut und Gewebe darstellt. Allerdings hat sich gezeigt, dass das Endothel ein eigenständiges, hoch differenziertes, in verschiedenste physiologische, biochemische, wie auch pathologische Prozesse involviertes Organ ist. Die lumenseitige Gefäßoberfläche wird bei einem circa 70 kg schweren Menschen auf 700 m² und das Gewicht auf 1250 g geschätzt [59]. Aufgrund dieser prädisponierten Lage und seiner großen Oberfläche kommen dem 9

13 Endothel zahlreiche zentrale Funktionen zu. Neben den Aufgaben als selektive Permeabilitäts- und Diffusionsbarriere und des Stofftransportes ist das Endothel an der Regulation des Gefäßtonus und des Blutflusses, an vielen immunologischen Prozessen wie der Antigenpräsentation, an inflammatorischen Geschehen, an der Hämostase, der Thrombozytenaggregation, der Angiogenese und Gefäßwandreparatur beteiligt [28, 31, 32, 84, 88, 89, 100, 211, 216, 217]. Zur Initiation und Durchführung dieser oben beschrieben Prozesse wurden eine Reihe von Membranrezeptoren, Enzymsysteme und Signalkaskaden nachgewiesen. Die folgende Auswahl fokussiert sich vor allem auf die Beteiligung der Endothelzellen an der Regulation des Blutdrucks: Bedeutender Syntheseort von Stickstoffmonoxid (NO). Die Freisetzung von NO kann durch zahlreiche Stoffe (wie Acetylcholin, Substanz P, Bradykinin, Thrombin, ATP und ADP, Arachidonsäure), aber auch durch mechanische Scherkräfte (shear stress) stimuliert werden. Durch eine Relaxation der glatten Gefäßmuskulatur führt NO zu einer Vasodilatation [16, 21, 24, 29, 30, 60, 63, 127, 184, 203]. Synthese von Endothelin und anderen vasokonstriktorischen Substanzen [228, 274]. Zahlreiche Ektoenzyme auf der dem Lumen zugewandten Seite, wie zum Beispiel das Angiotensin-Converting-Enzym (ACE), das aus Angiotensin-I das vasokonstriktorische Angiotensin-II bildet und Bradykinin abbaut [36, 52, 274]. Wichtigster Entstehungsort vasoaktiver Prostaglandine, die im Rahmen des Arachidonsäurestoffwechsels entstehen. Dazu gehören unter anderem das vasodilatierende Prostacyclin und die vasokonstriktorischen Prostaglandine E 2 und F 2α [60, 102, 274, 303]. 10

14 Durch ein fein abgestimmtes Gleichgewicht zwischen Vasodilatation und Vasokonstriktion wird eine adäquate Perfusion distal gelegener Gewebe gewährleistet und gleichzeitig die Gefäßwand vor einer Schädigung durch zu hohe hämodynamische Kräfte geschützt. Grundlegend für die regelhafte Beteiligung an diesen multiplen und differenten Aufgaben ist ein morphologisch und funktionell intaktes Endothel. Aktiviert werden die Endothelzellen durch physikalische und/ oder chemische Stimuli, wie Blutdruck, Scherkräfte, Hypoxie, Nukleotide, Fettsäuren, Amine, Peptide und Proteasen [16, 24, 30, 63]. Die dadurch lokal in der Intima synthetisierten Faktoren wie Stickstoffmonoxid (NO), Atrial Natriuretisches Peptid (ANP), Bradykinin, Substanz P oder Endothelin modulieren ihrerseits zusätzlich die endothelialen Stoffwechselwege und verändern den Spiegel der endothelialen und glattmuskulären second messenger Calcium und der cyclischen Nukleotide (cgmp, camp) [8, 84, 265]. Eine bedeutende Rolle für die Vermittlung endothelialer Wirkungen spielt die endotheliale NO-Synthase (enos). Dieses Enzym synthetisiert aus der Aminosäure L-Arginin (L-Arg) die chemisch instabile Substanz Stickstoffmonoxid (NO), deren Halbwertszeit unter in-vitro Bedingungen drei bis fünf Sekunden beträgt. Die Aktivität der enos wird durch den intrazellulären Calciumspiegel kontrolliert. Intrazelluläres Calcium steuert die Bindung des Calcium/Calmodulin-Komplexes an die konstitutiven NO-Synthasen und bewirkt eine Konformationsänderung, die das Enzym in seine aktive Form überführt [233]. Wie bereits oben erwähnt, stimulieren durch Blutflussänderungen ausgelöste Schubspannungen oder Rezeptor-Agonisten (wie z.b. Bradykinin, Acetylcholin, Substanz P u. a.) die endotheliale NO-Synthase. Produziertes NO kann aufgrund seiner Lipidlöslichkeit leicht in benachbarte Zellen, wie Endothelzellen, Thrombozyten oder glatte Muskelzellen, diffundieren. 11

15 Abbildung 1: Das endotheliale L-Arginin/NO-System. Durch Blutflussänderungen ausgelöste Schubspannung oder Rezeptor- Agonisten (Bradykinin, Acetylcholin, Substanz P u. a.) stimulieren die endotheliale NO-Synthase, die aus L-Arginin NO bildet und freisetzt. NO diffundiert zum glatten Gefäßmuskel und aktiviert dort die lösliche Guanylcyclase, die durch cgmp-bildung und darauf folgender Erniedrigung der Calciumkonzentration zur Relaxation führt (modifiziert nach Karstens [140]). In glatten Muskelzellen oder Thrombozyten aktiviert das Stickstoffmonoxid die zytosolische Guanylatcyclase, die cyclisches Guanosinmonophosphat (cgmp) aus Guanosintriphosphat (GTP) bildet. Der intrazelluläre Anstieg der cgmp-konzentration aktiviert cgmp-abhängige Effektormoleküle, wie cgmpabhängige Proteinkinasen, cgmp-operierte Ionenkanäle und cgmp-aktivierte Phosphodiesterasen [42, 161]. Die durch cgmp stimulierte cgmp-abhängige Proteinkinase reduziert den intrazellulären Calciumspiegel [161]. Die cgmpabhängigen Proteinkinasen bilden eine Kaskade, deren genauer Ablauf, Funktion und Aufbau Gegenstand aktueller Diskussionen darstellt. Am Ende der vasorelaxierenden Kaskade resultiert jedoch der Transport des intrazellulären Calciums aus dem Zytosol in das Endoplasmatische 12

16 Retikulum. Der zytosolische Abfall der Calciumkonzentration und die geringere Menge an bindungsfähigem Calcium an den kontraktilen Elementen der glatten Muskulatur führt schlussendlich zu einer Vasodilatation [265, 269]. Die Rolle von NO bei der Vermittlung zytoprotektiver Effekte war lange Zeit unklar [294]. So haben anfangs Studien zeigen können, dass NO in verschiedenen Zelltypen zytotoxische, pro-apoptotische Eigenschaften besitzt. Im Gegensatz dazu zeigen neuere Untersuchungen, dass NO neben seinen vasodilatierenden oder antithrombotischen Eigenschaften im Gefäßsystem auch zytoprotektiv und antioxidativ wirken kann [212, 295, 296]. Weitere Arbeiten zeigen sogar eine Hemmung des programmierten Zelltodes durch NO [93, 146, 253]. Die Begründung dieser Diskrepanz liegt in den konzentrationsabhängigen Funktionen von NO. Hohe Mengen von NO können zytotoxisch wirken, wohingegen niedrigere Konzentrationen von NO überwiegend zytoprotektive Effekte aufweisen [65, 145, 193]. Die molekularen Vorgänge, die dieser Schutzfunktion in der Gefäßwand zugrunde liegen, sind erst teilweise aufgedeckt worden. Neben einer direkten Inaktivierung von Sauerstoffradikalen konnte auch die Aktivierung zellulärer, antioxidativer Mechanismen, wie die Induktion zytoprotektiver Gene, gezeigt werden [198, 208, 212, 296]. Produkte der Cyclooxygenasen oder Superoxidanionen können den Abbau von NO beschleunigen und die Halbwertszeit von Stickstoffmonoxid reduzieren. Konsekutiv kommt es bei einer verminderten Bioverfügbarkeit von NO am Endothel zu einer verstärkten Leukozytenadhäsionsneigung, sowie einer vermehrten Thrombozytenadhäsion und -aggregation, wodurch proinflammatorische und thrombozytenadhäsive Prozesse am Endothel verstärkt werden. Dies begünstigt die Entstehung einer endothelialen Dysfunktion und somit auch die Atherogenese. Eine schematische Übersicht über die Wirkungen von Stickstoffmonoxid zeigt Abbildung 2: 13

17 Abbildung 2: NO hat protektive Wirkungen im Gefäßsystem. So wird die Plättchenadhäsion und -aggregation gehemmt, sowie die Adhäsion der Leukozyten am Endothel. An der glatten Muskulatur wirkt NO vasodilatierend und außerdem antiproliferativ im Sinne einer Verhinderung von Arteriosklerose (modifiziert nach Bulut [25]) Endotheliale Dysfunktion und primäre Hypertonie Die endotheliale Dysfunktion stellt den Oberbegriff für alle Funktionseinschränkungen eines geschädigten Endothels dar, einhergehend mit einer Dysbalance der gefäßerweiternden und -verengenden Faktoren des Endothels. Im klinischen Alltag und der wissenschaftlichen Literatur wird die endotheliale Dysfunktion häufig durch eine reduzierte Bioverfügbarkeit von Vasodilatatoren, vornehmlich NO, charakterisiert [157, 284]. Die Genese ist dabei noch unklar. Als wichtigste Ursachen gelten die kardiovaskulären Risikofaktoren. Zu diesen Faktoren zählen unter anderem die arterielle Hypertonie, Diabetes mellitus, Hyperlipoproteinämie, Nikotin, 14

18 männliches Geschlecht und das zunehmende Alter. Diese Faktoren führen unter anderem zu einer vermehrten Bildung von freien Sauerstoffradikalen [34, 261]. Dadurch kommt es konsekutiv zu einer vorzeitigen Inaktivierung von NO und damit zu einer reduzierten Bioverfügbarkeit [94]. Das schädigende Potential der einzelnen Risikofaktoren auf die endotheliale Dysfunktion scheint dabei unterschiedlich gewichtet und individuellen genetischen Faktoren unterworfen zu sein [43, 278]. Für den Fall der Hypercholesterinämie ist der Pathomechanismus hin zur endothelialen Dysfunktion weitestgehend aufgedeckt. So bewirkt die Hypercholesterinämie eine vermehrte Produktion von Sauerstoffradikalen. Schon 1993 haben Ohara et al. gezeigt, dass in Aorten von Kaninchen, die mehrere Wochen eine cholesterinreiche Nahrung erhielten, eine gesteigerte Synthese von freien Sauerstoffradikalen nachweisbar gewesen sind [199]. Die chemische Stabilität von NO ist gering. In Anwesenheit des freien Sauerstoffradikals Superoxid entsteht mit hoher Reaktionsgeschwindigkeit der toxische Metabolit Peroxynitrit. Dieser Reaktionsschritt läuft 3-5fach schneller ab als die Dismutierungsreaktion von Superoxid zu H 2 O 2 und Sauerstoff durch die Superoxiddismutase (SOD) [103, 292]. Normalerweise besteht ein Gleichgewicht zwischen den reaktiven Sauerstoffspezies (ROS)- produzierenden und ROS-abbauenden Enzymen in der Gefäßwand. Das Verhältnis zwischen der Aktivität antioxidativer (z.b. SOD) und oxidativer Enzymsysteme, wie z.b. die NAD(P)H-Oxidase, beeinflusst den Anteil von biologisch aktivem NO. Ein Ungleichgewicht durch ein Überwiegen von ROS führt zu einer Abnahme der NO-Bioverfügbarkeit. Als ein gemeinsamer Pathomechanismus dieses multifaktoriellen Geschehens wird die vermehrte Produktion freier Sauerstoffradikale, der sogenannte oxidative Stress, in der Gefäßwand angesehen. Der oxidative Stress ist ein häufig verwendeter Begriff, der grundsätzlich das Ungleichgewicht zwischen der Anstiegsrate des intra- und extrazellulären Gehaltes von freien Sauerstoffradikalen und der Eliminationsrate der freien Sauerstoffradikale, abhängig von der relativen Kapazität der Zelle, beschreibt. Die resultierende vermehrte Inaktivierung von NO, und die daraus folgende endotheliale Dysfunktion, ist eine pathogenetisch essentielle Folge von oxidativem Stress [62, 94, 125, 155]. Konsekutiv konnte die Verschlechterung der endothelabhängigen 15

19 Vasodilatation durch gleichzeitige Applikation von Antioxidantien vermindert werden [144]. Die vermehrte Produktion freier Sauerstoffradikale gilt daher als zentraler pathogenetischer Vorgang für die Entstehung der Hypercholesterinämie-induzierten endothelialen Dysfunktion [108, 109]. Abbildung 3: Verminderung der NO-Bioverfügbarkeit durch vermehrte Produktion freier Sauerstoffradikale, an deren Entstehung kardiovaskuläre Risikofaktoren, unter besonderer Betrachtung des Cholesterins, mitwirken. Im Gegensatz zur Hypercholesterinämie ist der Pathomechanismus der endothelialen Dysfunktion bei arterieller Hypertonie unklar. Die Ursache ist vermutlich multifaktoriell und nur teilweise auf einen abnormen NO- Stoffwechsel zurückzuführen. Diskutiert wird unter anderem über ursächliche Defekte im IP 3 -Calcium-Aktivierungsweg und Mangel an Co-Faktoren der endothelialen NO-Synthase, wie Tetrahydrobiopterin, und somit eine geringere NO-Produktion und vermehrten NO-Abbau durch Sauerstoffradikale [39, 55, 94]. Des Weiteren werden als Ursache dieser Dysfunktion auch Produkte vaskulärer Cyclooxygenasen diskutiert [5]. Als Surrogatmarker der globalen endothelialen Dysfunktion kann die Acetylcholin-vermittelte Vasodilatation, gemessen im Ultraschall, in der venösen Verschlussplethysmographie oder in der Angiographie, dienen. 16

20 Untersuchungen an Patienten mit kardiovaskulären Risikofaktoren zeigen eine abgeschwächte bis aufgehobene endothelabhängige Vasodilatation [39, 41, 82, 98, 202, 204, 205]. Die verminderte Vasodilatation scheint dabei zum größten Teil durch eine verminderte NO-Verfügbarkeit bedingt zu sein [215]. In arteriosklerotischen Arterien ist sowohl die basale als auch die stimulierte Freisetzung von NO erniedrigt [47]. Die klinische Untersuchung der endothelialen Funktion wurde 1986 erstmals am Patienten durch Ludmer et al. untersucht, indem Acetylcholin in die Koronararterien infundiert wurde [165]. Bei gesunden Gefäßpatienten erfolgte eine Vasodilatation, bei arteriosklerotisch vorgeschädigtem Endothel resultierte eine Vasokonstriktion. Eine entscheidende Rolle scheint dabei NO zu spielen. So konnte neben der endothelabhängigen vasodilatierenden Fähigkeit von NO beobachtet werden, dass nach Entfernung der Endothelzellschicht der thorakalen Aorta von Kaninchen eine Vasokonstriktion erfolgte [89]. Die Auswirkungen einer endothelialen Dysfunktion verdeutlichen die Folgen eines enos-knock-out-modells an Mäusen [126]. Bei diesen Tieren fanden sich ein signifikant höherer Blutdruck, eine Widerstandserhöhung in den kleinen Arterien und Arteriolen und ausgeprägte morphologische Veränderungen im Sinne einer Arteriosklerose. In Kenntnis der potentiellen Folgeerkrankungen einer endothelialen Dysfunktion wurde sie auch als funktionelle Vorstufe der Arteriosklerose beschrieben [273]. Unabhängig zeigten Schächinger et al. und Suwaidi et al., dass Patienten eine höhere Inzidenz kardiovaskulärer Ereignisse aufwiesen, die eine schlechtere endothel-abhängige Vasodilatation in der Endothelfunktionsprüfung gezeigt hatten [232, 254]. Damit lieferten beide Arbeiten den entscheidenden Beweis, dass die endotheliale Funktion einen prognostischen Wert für zukünftige kardiovaskuläre Ereignisse darstellt [232, 254]. Somit korreliert das Ausmaß der endothelialen Dysfunktion negativ mit dem Outcome der Patienten. 17

21 1.6. Endotheliale Progenitorzellen Endothelzellen sind weitestgehend ausdifferenziert und besitzen nur eine geringe Proliferationskapazität, welche die Möglichkeit der Regeneration und Neubildung limitiert. Zwar können sich verletzte Gefäßabschnitte zum einen durch Einwanderung und Proliferation von benachbarten Endothelzellen regenerieren [15, 38]. Allerdings werden für weitergehende Maßnahmen der Regeneration und Neubildung zusätzliche Zellpopulationen benötigt, die sich im Knochenmark zu finden scheinen. Vielzählige Arbeiten haben eine Zellpopulation identifiziert, die aus polymorph-mononukleären Zellen aus dem Knochenmark und peripherem Blut isoliert werden können [9, 10]. Sie exprimieren eine Reihe von Oberflächenmarkern, die sie als Stammzellen endothelialen Ursprunges charakterisieren [9, 128, 207]. So konnte gezeigt werden, dass diese Zellen in Gebiete der Neovaskularisation einwandern [15, 38, 136, 268] und dort zumindest unter in-vitro Bedingungen und im tierexperimentellen Modell untergegangene Endothelzellen ersetzen können [85, 101, 174, 280], um dadurch die globale Funktionalität des Endothels zu erhalten [105]. Aufgrund dieses Verhaltens wurden diese Zellen als endotheliale Progenitorzellen (EPC) beschrieben [10]. Endotheliale Progenitorzellen können auch aus Nabelschnurblut separiert werden. Aktuelle Untersuchungen werfen allerdings die Frage auf, ob diese EPC eine eigenständige Population darstellen. Zwar scheinen auch die endothelialen Progenitorzellen aus Nabelschnurblut sich letztendlich zu reifen Endothelzellen zu differenzieren, doch lassen sich unterschiedliche Antigene, Phänotypen und proliferative Fähigkeiten nachweisen [12, 301]. Wichtige Voraussetzung für die Reendothelialisierung und Gefäßneubildung innerhalb geschädigter Gefäßabschnitte oder ischämischer Areale ist eine Adhäsionsfähigkeit, die vor allem in der Heraufregelung des stromal cell derived factor I (SDF-1) über einen hypoxia-inducible factor I (HIF-1) begründet ist [44]. Der Nachweis der endothelialen Progenitorzellen gelingt über die Detektion ihrer Oberflächenmoleküle [9]. Während ihrer Reifungsphase im Knochenmark exprimieren EPC auf ihrer Oberfläche hauptsächlich CD133, CD34 und den Vascular Endothelial Cell Growth Factor Receptor-2 (VEGFR- 18

22 2) [10, 92, 121, 207, 214]. Mit Eintritt der endothelialen Progenitorzellen in den systemischen Blutkreislauf und während ihrer Differenzierungsphase gehen ihre Vorläufereigenschaften verloren und sie beginnen endotheliale Marker, wie VE-Cadherin und CD31, auf ihrer Oberfläche zu exprimieren und endotheliale NO-Synthase und von-willebrand-faktor zu produzieren [10, 92, 121, 123, 207, 214]. Im Durchschnitt ist die Anzahl zirkulierender EPC beim gesunden Menschen gering. Untersuchungen haben gezeigt, dass physiologische, pathologische und medikamentöse Faktoren mit einer Erhöhung oder Erniedrigung der Anzahl der freien EPC im Blut einhergehen. Eine Übersicht über Bedingungen und Faktoren, die die Anzahl und Funktion der im Blut zirkulierenden EPC verändern können, veranschaulicht Tabelle 2: Tabelle 2: Physiologische, pathologische und medikamentöse Bedingungen und Faktoren, die die Anzahl und Funktion der im Blut zirkulierenden EPC erhöhen oder erniedrigen können. Veränderungen der EPC-Anzahl Bedingungen/ Faktoren Physiologisch: körperliches Training, Apoptoseprodukte von ausdifferenzierten Endothelzellen, Östrogene, Erythropoetin EPC-Erhöhung Pathologisch: Gefäßverletzung, kongenitaler Herzfehler (Klasse I- II), ossäre Verletzungen Medikamentös: HMG-CoA-Reduktase-Inhibitoren, Wachstumshormon Physiologisch: CRP EPC-Erniedrigung Pathologisch: kardiovaskuläre Risikofaktoren, Arteriosklerose, Rauchen, Hypertonie, akuter Myokardinfarkt, kongenitale Herzfehler (Klasse III- IV), Endotoxine (Akutphase) 19

23 Die Mobilisation von EPC kann durch VEGF [129, 135, 137], NO [2], Apoptoseprodukte von ausdifferenzierten Endothelzellen [120], dem Östrogenstatus [26, 252], körperliches Training [1, 154], Erythropoetin [13, 14] und HMG-CoA-Reduktasehemmern [70] getriggert werden. Auch pathologische Zustände, wie der Zustand nach akutem Myokardinfarkt [159, 242] oder nach traumatischen Gefäßverletzungen bei gefäßchirurgischen Eingriffen [23, 96], sind mit einer erhöhten Anzahl von EPC assoziiert. Ebenfalls nach Frakturen ist ein erhöhtes Level an EPC nachweisbar. Diesem Zusammenhang wird eine essentielle Rolle in der Frakturheilung durch Neovaskularisierung im Traumagebiet zugeschrieben [174]. Demgegenüber sind kardiovaskuläre Risikofaktoren, wie zum Beispiel arterielle Hypertonie, Nikotinkonsum, Hyperlipoproteinämie und Diabetes mellitus, mit einer erniedrigten EPC-Anzahl verknüpft [71, 114, 141, 174, 200, 275]. Auch akute oder chronische Entzündungen können mit einer Verminderung des EPC-Levels einhergehen [176, 276]. Abbildung 4: Schädigung des Endothels und Erniedrigung der EPC-Anzahl durch kardiovaskuläre Risikofaktoren mit konsekutiv verminderter Möglichkeit der Endothelregeneration durch EPC (modifiziert nach Werner [287]). 20

24 Auf diesen Grundlagen basierend werden aufgereinigte EPC in ersten kontrollierten klinisch-therapeutischen Untersuchungen bei Patienten nach Myokardinfarkt [11, 249, 299] oder bei der peripheren arteriellen Verschlusskrankheit [149, 257] mit vielversprechenden Ergebnissen angewendet. In Untersuchungen an Tieren konnte durch den Einsatz von kultivierten EPC per Injektion bei Myokardischämie die Apoptoserate der Myocyten gesenkt und das Remodelling und die Herzfunktion verbessert werden [142, 147]. Weiterreichende Erforschungen der endothelialen Progenitorzellen könnten vor allem in den folgenden drei Punkten für Patienten einen Benefit bringen: Interpretierbarkeit der gemessenen EPC-Konzentration im Patientenblut als unabhängiger prädiktiver Marker eines arteriosklerotischen Progresses und für zukünftige kardiovaskuläre Ereignisse [151, 171, 180, 234], im Sinne einer Korrelation der globalen Funktionalität des Endothels mit der Anzahl und Aktivität der EPC [71, 94, 114, 141, 180, 291]. Ausnutzung endothelialer Progenitorzellen als endogener Reparaturmechanismus nach gefäßinterventionellen Maßnahmen oder in ischämischen Arealen, um dysfunktionierende Endothelzellen zu ersetzen und um einen regelhaften Endothelstatus aufrechtzuerhalten [23, 48, 123, 141, 143, 159, 290, 305]. Therapeutischer Ausgleich der gegenüber dem Normkollektiv erniedrigten EPC-Konzentrationen bei Patienten mit arterieller Hypertonie und anderen kardiovaskulären Risikofaktoren, um das Ausmaß der endothelialen Schädigung und mögliche Folgeerkrankungen in diesem Kollektiv zu verringern [4, 114, 123, 132, 275]. So zeigen mehrere, unabhängig voneinander publizierte Arbeiten zum Beispiel die Möglichkeit der Mobilisation von EPC durch HMG-CoA-Reduktase-Inhibitoren [97, 163, 172, 21

25 281, 289] oder auch durch niedrig dosierte Gabe von Wachstumshormon [67]. Abbildung 5: Mögliche medikamentöse Therapieansätze auf Mobilisation, Differenzierung und homing von EPC (modifiziert nach Werner [287]) Bedeutung der Eicosanoide Biochemie des Eicosanoid-Stoffwechsels Die Cyclooxygenase ist das bifunktionelle Schlüsselenzym in der Eicosanoid- Biosynthese. In zwei Reaktionsschritten katalysiert dieses Membranprotein die Umwandlung der hydrolytisch aus Membranphospholipiden freigesetzten Arachidonsäure über das Zwischenprodukt Prostaglandin G 2 zu Prostaglandin H 2 [245]. 22

26 Die folgende Abbildung 6 zeigt eine graphische Zusammenfassung der Arachidonsäurestoffwechselwege mit den chemischen Strukturen der einzelnen Substrate: Abbildung 6: Mechanismus der Cyclooxygenase in der Entstehung der einzelnen Prostaglandine. Darstellung der chemischen Strukturformeln der Arachidonsäure, verschiedener Prostaglandine (PGD 2, PGE 2, PGF 2α, PGG 2, PGH 2), Prostacyclin und Thromboxan A 2 (TXA 2) (nach Dogné [72]). Im ersten Schritt wird mittels der Cyclooxygenase-Reaktion, einer Bisoxygenierung, Prostaglandin G 2 gebildet. In der anschließenden Peroxidase-Reaktion wird Prostaglandin G 2 in das Hydroxy-Endoperoxid Prostaglandin H 2 umgewandelt, welches die Ausgangssubstanz für die biologisch aktiven Eicosanoide, wie Prostaglandine, Prostacycline und Thromboxane, bildet [116]. 23

27 Cyclooxygenase-System Die Cyclooxygenase (COX)-Aktivität beruht auf zwei Isoformen, COX-1 und COX-2. Es handelt sich bei beiden Isoformen um glykosylierte, integrale Membranproteine, die in der luminalen Oberfläche des endoplasmatischen Retikulums und in der inneren und äußeren Kernmembran lokalisiert werden können. Die COX-2 ist vor allem in der perinukleären Hülle zu finden [188, 245]. Beide Isoformen sind funktionell wie auch strukturell gesehen Homodimere, wobei jedes Monomer aus drei strukturellen Domänen besteht: der Epidermal-Growth-Factor (EGF) Domäne, der benachbarten membranbindenden Domäne (MBD) und der großen, globulären katalytischen Domäne. Die COX-Isoenzyme interagieren mit der Membran durch das Eindringen der membranbindenden Domäne in nur eine Schicht der Lipiddoppelschicht. Sie werden daher als monotopische integrale Membranproteine bezeichnet [91]. Die funktionelle Bedeutung dieser monotopischen Natur der Cyclooxygenasen wird bei der Substratbindung deutlich. Die bifunktionellen Isoenzyme besitzen für die Katalyse der Cyclooxygenase- und Peroxidase- Reaktion zwei räumlich voneinander getrennte katalytische Zentren. Die membranbindende Domäne ist nicht nur für die Verankerung des Enzyms in der Lipiddoppelschicht verantwortlich, sondern sie formt auch den Eingang des katalytischen Zentrums für die Cyclooxygenase-Reaktion. Diese so genannte COX-aktive-Seite ist ein langer, hydrophober Kanal mit wenigen polaren Resten. Die strukturellen Merkmale der MBD gestatten es der Arachidonsäure, dieses katalytische Zentrum direkt vom hydrophoben Teil der Lipiddoppelschicht aus zu erreichen. Das in der COX-aktiven-Seite aus Arachidonsäure gebildete Prostaglandin G 2 wandert dann zum zweiten katalytischen Zentrum, in dem die Peroxidase-Reaktion von Prostaglandin G 2 zu Prostaglandin H 2 stattfindet. Diese ist auf der luminalen Seite des Enzyms lokalisiert [91]. 24

28 Unterschiede in der sterischen Struktur des katalytischen Zentrums sowie in der Größe des durch die MBD gebildeten hydrophoben Kanals bewirken eine unterschiedliche Substratspezifität der beiden Isoenzyme. Während COX-1 spezifisch nur Arachidonsäure und Dihomo-γ-Linolensäure umsetzt, wird durch COX-2 ein größeres Spektrum an Fettsäuren (zusätzlich Linolsäure, α/γ-linolensäure und Eicosapentaensäure) metabolisiert [116]. Dies verleiht den COX-Hemmern die Möglichkeit zur Spezifität [95, 110, 152, 166]. Grundlegende Differenzen bestehen zwischen den beiden Isoformen auch in Verteilung und physiologischer Funktion im Organismus [246]. Die 1976 von Miyamoto et al. isolierte COX-1 wird von fast allen Geweben, zum Beispiel in der Niere, im Magen und von Thrombozyten konstitutiv exprimiert und ist ständig aktiv [181]. Diese Isoform ist unter anderem an der Regulation des Gefäßtonus, der Zytoprotektion und an der Aufrechterhaltung der zellulären Hämostase beteiligt [86, 116, 241, 298]. Die 1989 durch Simmons et al. entdeckte COX-2 kommt nur in einigen Zellen, bevorzugt in Leukozyten und Makrophagen, vor [264]. Neuere Studien belegen, dass auch in Thrombozyten eine COX-2 Aktivität nachweisbar ist [285]. Die Expression von COX-2 wird unter anderem über den Einfluss von Endotoxinen, Zytokinen und Wachstumsfaktoren induziert, wie sie zum Beispiel bei inflammatorischen Ereignissen vorkommen [56, 76, 243]. Aufgrund dessen hat die COX-2 eine überragende Bedeutung sowohl für Entzündungsprozesse und in der Infektabwehr, als auch in der Zelldifferenzierung und Mitogenese [51, 76, 167, 220, 235, 264, 262]. Zwar haben neuere Arbeiten die Hypothese der physiologischen und pathophysiologischen Arbeitsteilung zwischen COX-1 und COX-2 widerlegt, zum grundlegenden Verständnis kann die folgende Abbildung trotz der zahlreichen funktionellen Überschneidungen der beiden Isoformen dennoch dienen: 25

29 Abbildung 7: Regulation der Prostaglandinbiosynthese über COX-1 und COX-2 (modifiziert nach Vane [272]). Zudem scheint die Expressionsrate der COX-2 zumindest in Tumorgewebe mit einem Anstieg des Vascular Endothelial Growth Factor (VEGF) und der Angiogenese zu korrelieren [304, 173, 267, 306]. Die COX-2 ist nicht nur, wie anfänglich angenommen, ein rein induzierbares Enzym. Mittlerweile konnte auch im Gehirn, in den Nieren, in der Schilddrüse und Magenschleimhaut eine konstitutive Expression von COX-2 nachgewiesen werden [80, 107, 117, 134, 192, 308]. Ebenso haben aktuelle Untersuchungen belegt, dass nicht nur die COX-2 induzierbar ist, sondern dass die Expression von COX-1 in inflammatorischen Prozessen ebenfalls erhöht sein kann [58]. 26

30 Funktion der Eicosanoide Die biologisch aktiven Eicosanoide stellen funktionell eine sehr heterogene Gruppe dar. Durch die folgende Darstellung der Endprodukte des Arachidonsäurestoffwechsels im Einzelnen werden nicht nur die Wirkungsweisen der jeweiligen Eicosanoide aufgezeigt. Zugleich wird indirekt ein Ausblick auf die Folgen einer Hemmung der Cyclooxygenase gewährt, durch welche die Synthese der Eicosanoide und deren physiologischen Effekte entfallen: Abbildung 8: Chemische Formel von Prostacyclin (PGI 2). Prostacyclin (PGI 2 ) entsteht im Gefäßendothel aus PGF 2a [183, 194, 297]. Durch eine PGI 2 -vermittelte Aktivierung der Adenylatcyclase steigt die Konzentration des cyclischen AMP an und es kommt zu einer Vasodilatation durch eine Relaxation der glatten Gefäßmuskulatur. Weitere Wirkungen des Prostacyclins sind eine Inhibition der Thrombozytenaggregation und Dilatation der Bronchien [183]. Zudem gibt es tierexperimentelle Hinweise auf einen antiarteriosklerotischen Effekt von PGI 2 [66]. 27

31 Abbildung 9: Chemische Formel von Thromboxan A 2 (TXA 2). Thromboxan A 2 (TXA 2 ), in Blutplättchen und Makrophagen synthetisiert, bewirkt, wie auch Prostaglandin H 2 und Prostaglandin F 2α, unter anderem eine Plättchenaggregation und glattmuskuläre Kontraktion in Gefäßen und Bronchien [20, 185, 255, 309]. Es kann als Gegenspieler des Prostacyclin angesehen werden. Thromboxan A 2 soll an der konsekutiven Tachykardie bei Entzündungsreaktionen beteiligt sein [256]. Abbildung 10: Chemische Formel von Prostaglandin D 2 (PGD 2). Prostaglandin D 2 (PGD 2 ), Produkt von Mastzellen, führt zu einer Histaminfreisetzung aus basophilen Granulozyten. Histamin bewirkt unter anderem Juckreiz, Schmerz, Erhöhung der Gefäßpermeabilität, Kontraktion der Bronchialmuskulatur, vermehrte Magensäuresekretion und Vasodilatation [134, 230, 282]. Damit kommt Prostaglandin D 2 eine Schlüsselrolle in der Genese von Asthma und Allergien zu [134, 186, 282]. 28

32 Abbildung 11: Chemische Formel von Prostaglandin E 2 (PGE 2). Prostaglandin E 2 (PGE 2 ) vermittelt eine Erhöhung des cyclischen AMP, wodurch eine Relaxation der glatten Muskulatur an Gefäßen, der Bronchialmuskulatur und des Uterus resultiert [40, 194, 307]. Zusätzlich schützt PGE 2 die gastrale Schleimhaut durch eine Erhöhung der Schleim- und Bikarbonatsekretion. In den Nieren führt Prostaglandin E 2 zu einer Vasodilatation und Hemmung der tubulären Natriumrückresorption. Ein Mangel an PGE 2 scheint aufgrund der Verminderung dessen vasodilatatorischer Eigenschaften zu einer konsekutiven Hypertonie zu führen [297]. Abbildung 12: Chemische Formel von Prostaglandin F 2α (PGF 2α). Prostaglandin F 2α (PGF 2α ), oft als Antagonist zu Prostaglandin E 2 angesehen, verursacht durch eine Kontraktion der Gefäßmuskulatur eine Erhöhung des Gefäßwiderstandes und des systemischen Blutdrucks. Zusätzlich induziert PGF 2α im Respirationssystem eine Kontraktion der Bronchialmuskulatur [194, 293]. Im Genitaltrakt führt PGF 2α zu einer Uterusund Tubenkontraktion [35]. 29

33 1.8. Einfluss von COX-Inhibitoren auf die endotheliale Funktion Acetylsalicylsäure Nach ersten Erfahrungen mit Weidenrindenextrakten zur Schmerzbekämpfung wurde 1828 daraus der Wirkstoff Salicin extrahiert, in dem 1839 Salicylsäure als Bestandteil des Salicin nachgewiesen werden konnte. Im Jahr 1897 synthetisierte der Bayer -Chemiker Dr. Felix Hoffmann erstmals Acetylsalicylsäure (ASS) in chemisch reiner Form. Bei konsequenter Weiterentwicklung und Forschung konnte Acetylsalicylsäure unter dem besser bekannten Handelsnamen Aspirin im Jahr 1899 auf dem pharmazeutischen Markt eingeführt werden. Dessen analgetische, antipyretische und antiinflammatorische Eigenschaften wurden von Hoffmanns Kollegen Heinrich Dreser im gleichen Jahr veröffentlicht [74]. Die Hemmung der Thrombozytenaggregation, die in der heutigen medikamentösen Prophylaxe der KHK, des Myokardinfarktes, Apoplex und anderer thromboembolischer Gefäßerkrankungen unverzichtbar geworden ist, wurde erst 1950 durch Craven beschrieben [57]. Die Erforschung des Wirkmechanismus der Acetylsalicylsäure und anderer nichtsteroidaler Antiphlogistika (NSAID) erforderte weitere 20 Jahre. Im Jahr 1971 entdeckten John Vane et al. eine dosisabhängige Hemmung der Prostaglandinbildung mittels Acetylsalicylsäure [271]. Abbildung 13: Chemische Formel von Acetylsalicylsäure (C 9H 8O 4). 30

34 Acetylsalicylsäure ist ein nicht selektiver Inhibitor beider COX-Isoformen. Durch eine irreversible Acetylierung eines Serin-Restes am aktiven Zentrum der Cyclooxygenasen ist die Bindung des Substrates Arachidonsäure an dieser Region nicht mehr möglich [177, 206, 225]. Folglich kommt es auch zu einer Abnahme der oben beschriebenen biologisch aktiven Endprodukte des Arachidonsäurestoffwechsels. Diese Reduzierung ermöglicht der medikamentösen Therapie mit ASS ihre thrombozytenaggregationshemmende, analgetische, antipyretische und antiphlogistische Wirkung, sowie auch deren unerwünschten Nebenwirkungen, wie gastrointestinale Beschwerden, erhöhte Blutungsneigung oder Aspirin-Asthma. Diese Wirkungen des ASS sind dosisabhängig: In niedriger Dosierung, 75 mg/ Tag und weniger, hemmt Acetylsalicylsäure vornehmlich die COX-1 und weniger die COX-2 [50, 81, 138, 164, 206, 286]. Dadurch kommt es zu einer Verschiebung des Gleichgewichts zwischen Thromboxan A 2 und Prostacyclin zu Gunsten des Prostacyclin. Die Folge ist eine gesteigerte Vasodilatation und Thrombozytenaggregationshemmung. Der Grund hierfür liegt in der Möglichkeit des Gefäßendothels, Cyclooxygenase, und damit Prostacyclin, neu zu synthetisieren. Aufgrund der irreversiblen Inhibition und des limitierten eigenen Proteinsyntheseapparates ist es den Thrombozyten dagegen kaum möglich, Cyclooxygenase und somit auch Thromboxan A 2 während ihrer sieben- bis zehntägigen Lebensdauer nachzuproduzieren [27]. Bei einer höheren Dosis, mehr als 75 mg, hemmt ASS auch zunehmend die COX-2 [61]. Die abnehmende Aktivität der COX-2 in Entzündungszellen führt zu einem Wegfall der proinflammatorischen Mediatoren und bewirkt damit die zusätzliche analgetische, antipyretische und antiphlogistische Komponente von Acetylsalicylsäure. 31

35 Einfluss der COX-Hemmung durch Acetylsalicylsäure auf die Endothelfunktion Eine Vielzahl von Untersuchungen belegen ein Vorhandensein der Cyclooxygenase (COX-1 und COX-2) in Endothelzellen [190, 213]. Aus diesem Grund wurde eine Interaktion zwischen Cyclooxygenase- Hemmstoffen, wie Acetylsalicylsäure, und der endothelialen Funktionen angenommen. Diese These wurde durch Untersuchungen bestätigt, die bei Patienten mit arterieller Hypertonie eine Verbesserung der Endothelvermittelten Vasodilatation nach Acetylsalicylsäuregabe beobachtet haben [124, 187, 170, 302]. Der schützende Effekt von ASS auf das Endothel scheint in seinen antioxidativen und antiarteriosklerotischen Eigenschaften begründet zu sein [124, 210, 219, 227, 239, 250, 266, 279]. Ranke et al. entdeckten bei einer kleinen Patientengruppe, dass unter 900 mg ASS pro Tag die Progression arteriosklerotischer Veränderungen in den Carotiden verlangsamt wurde [219]. So verhindert Acetylsalicylsäure die proatherogenen Modifikationen von LDL und Fibrinogen an Gefäßen [250, 266]. Zusätzlich wird durch die von ASS herbeigeführte Hemmung der Thromboxan-Biosynthese das durch arteriosklerotische Modifikationen zugunsten des Thromboxans verschobene Gleichgewicht zwischen Prostacyclin und Thromboxan angeglichen, durch die irreversible Hemmung der Thrombozytenfunktion die Plättchenaggregation vermindert und konsekutiv die Fluidität des Blutes erhöht [27, 33, 66]. Auch bei Patienten mit manifester Arteriosklerose konnte durch ASS-Gabe eine signifikante Besserung der Acetylcholin-induzierten Vasodilatation, als Maß für die Funktion des Endothels, nachgewiesen werden [124]. Ähnliche Befunde wurden bei Patienten mit arterieller Hypertonie erhoben [187]. Diese Beobachtungen werden für die Prognoseverbesserung unter ASS- Therapie bei Patienten mit kardiovaskulären Erkrankungen mitverantwortlich gemacht. 32

36 1.9. Problemstellung Arteriosklerotische Gefäßerkrankungen, wie die koronare Herzkrankheit, gehören in Deutschland zu den häufigsten Ursachen für vorzeitigen Tod, Minderung der Leistungsfähigkeit und Reduzierung der Lebensqualität [244]. Viele Patienten zeigen die für die Arterioskleroseentstehung typischen Risikofaktoren wie arterielle Hypertonie, Diabetes mellitus, Hyperlipoproteinämie oder schädlicher Konsum von Nikotin. Diese Risikofaktoren manifestieren sich in einer endothelialen Dysfunktion, einer funktionellen Vorstufe der Arteriosklerose. Konsekutiv führt die endotheliale Dysfunktion zu einer Verminderung der Endothel-vermittelten Vasodilatation und somit zu einer Zunahme des Gefäßwiderstands und des systemischen Blutdrucks. Für die Aufrechterhaltung einer morphologisch und funktionell intakten Endothelschicht reicht oft die Einwanderung und Proliferation von benachbarten Endothelzellen nicht aus. Zusätzlich wird eine Zellpopulation mit einem hohen Regenerationspotential für das Endothel benötigt, die anscheinend in den so genannten endothelialen Progenitorzellen (EPC) zu finden ist. So korreliert die endotheliale Funktion mit der Anzahl zirkulierender EPC und letztlich mit der Prognose der Patienten [151, 171, 180, 288]. Die verschiedenen Messtechniken (wie zum Beispiel die Verschlussplethysmographie) zur Bestimmung der Endothel-vermittelten Vasodilatation als Surrogatmarker für die endotheliale Funktion sind bislang oft ungenau und untersucherabhängig. Die Bestimmung der EPC kann jedoch standardisiert und reproduzierbar genaue Werte angeben. Dies würde eine zusätzliche Möglichkeit der Risikostratifizierung eines Patienten aufgrund des vorbeschriebenen Zusammenhangs von reduzierter Anzahl von zirkulierenden EPC als unabhängiger Prädiktor für die schlechte Prognose von kardiovaskulären Patienten bedeuten [171, 234, 288, 291]. Der therapeutische Einsatz von Acetylsalicylsäure zeigt eine sowohl akute als auch langfristige Besserung der endothelialen Dysfunktion, eine Reduzierung proatherogener Modifikationen am Endothel und somit prospektiv eine prognoseverbessernde Wirkung für den Patienten. Unklar ist jedoch die Auswirkung einer ASS-Therapie auf die Anzahl zirkulierender 33

37 EPC und ob unter einer solchen Therapie eine Messung der EPC zur Risikoabschätzung sinnvoll erscheint. Daher soll in der hier vorliegenden Arbeit, als Pilotprojekt, untersucht werden, ob eine Therapie mit ASS zunächst akut einen Anstieg der EPC und deren Proliferation bewirken kann. Dies könnte theoretisch die unter ASS beobachtete Prognoseverbesserung erklären und die Frage beantworten, ob die Bestimmung der EPC unter dieser Behandlung zur Prognoseabschätzung kardiovaskulärer Patienten einen Nutzen hat. 34

38 2. Patienten & Methoden 2.1. Isolierung & durchflusszytometrische Messung der EPC Patienten Im ersten Arm der hier vorliegenden Untersuchung erfolgte die durchflusszytometrische Quantifizierung von endothelialen Progenitorzellen aus peripherem Venenblut vor und einen Tag nach Gabe von 500 mg Acetylsalicylsäure. Die Studienpopulation bestand aus 24 Patienten, die zur diagnostischen Abklärung unklarer Brustschmerzen in die Klinik aufgenommen wurden. Zudem war allen Patienten gemeinsam, dass die arterielle Hypertonie das führende Krankheitsbild darstellte. Einen Überblick über die Charakteristika der Patienten gibt Tabelle 3: Tabelle 3: Patientencharakteristika (Werte sofern nicht anders angegeben als Mittelwert ± Standardabweichung). Anzahl (n) Männlich n/ weiblich n Alter in Jahren Hypertonie n (%) Hyperlipidämie (unbehandelt) n (%) Diabetes mellitus n (%) Raucher n (%) Hyperuricämie n (%) Body mass index kg/m / 9 68,38 ± 2,54 24 (100%) 12 (50%) 18 (75%) 10 (41,67%) 1 (4,17%) 28,4 ± 4,4 35

39 Einen Überblick über die Medikation der Patienten veranschaulicht Tabelle 4: Tabelle 4: Medikation der Patienten (nur Angabe der Stoffklassen). ASS Betablocker ACE-Hemmer AT1-Antagonisten Diuretika Schleifendiuretika Thiaziddiuretika Ca 2+ -Antagonisten Nifedipin-Typ Verapamil-Typ 17 (70,83%) 18 (75%) 13 (54,17%) 5 (20,83%) 8 (33,33%) 4 (16,67%) 4 (16,67%) 7 (29,17%) 6 (25%) 1 (4,17%) Alle ausgewählten Patienten wurden mittels eines Aufklärungsbogens sowie eines persönlichen Aufklärungsgespräches über Ablauf und Risiken dieser Untersuchungsreihe sorgfältig informiert. Hierzu zählen die möglichen Folgen einer venösen Blutentnahme (Blutung, Hämatom, Gefäß- und Nervenverletzung) und die pharmakologischen Wirkungen der Acetylsalicylsäure (Verlängerung der Blutungszeit, gastrointestinale Beschwerden, allergische Reaktionen, Störungen der Nierenfunktion, Schwindel, Kopfschmerzen, Ohrensausen und Bronchokonstriktion mit möglichen asthmaähnlichen Anfällen). Als Ausschlusskriterien galten klinische oder laborchemische Anhalte für entzündliche Geschehen, koronarangiographisch-relevante Stenosen der Koronararterien > 50%, renale Insuffizienz (Serum-Kreatinin 1,3 mg/dl), angeborene oder erworbene Herzklappenfehler, Linksherzinsuffizienz (Ejektionsfraktion 50%), bekannte Unverträglichkeit gegenüber ASS, Autoimmunerkrankungen, maligne tumoröse Erkrankungen, Vorhofflimmern, erhöhte Blutungsneigung (Thrombozytenanzahl < /µl, iatrogen: Therapie mit Phenprocoumon mit INR > 1,5), Anämie (Hämoglobin < 11,0 g/dl), bekannter Alkoholismus und ein Lebensalter von > 90 Jahren. 36