1. Regulation der Transkription

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1 1. Regulation der Transkription DIA 1 Regulation der Transkription Die Transkription von Genen wird in zwei Hauptstufen reguliert: (1) Regulierung auf der Chromatin - Stufe (anders ausgedrückt die epigenetische Regulierung) bedeutet Regulierung die Genexpression durch Histone und durch Methylierung der DNA. Die Dichte der Histone, die die DNA binden, und die Methylierung der DNA bestimmen die Intensität der Transkription. (2) Cis (Promotor, Silencer, Enahancer) und Trans Elemente (Transkriptionsfaktoren) und ihre Wechselwirkungen repräsentieren die andere Regulationsstufe der Genexpression. Die Expression eines Gens in einem bestimmten Zelltyp wird also von drei Faktoren bestimmt: (i) Die Anwesenheit der benötigten Regulatorsequenzen (ii) Die Anwesenheit der Transkriptionsfaktoren, die die Regulatorsequenzen erkennen (iii)die Zugänglichkeit der Regulatorsequezen für die Transkriptionsfaktoren. DNA muss also von Methylierung und von Histonen frei sein. DIA 2 Promotor (Slides: 10-11) Regulation der Transkription ist mit Abstand der wichtigste Modus zur Kontrolle der eukaryotischen Genexpression. Die Cis-Regulatorsequenzen bedeuten Regulator-DNA-Motive, die durch spezifische Transkriptionsfaktoren erkannt werden. Basale Promoterelemente, genannt TATA-Boxen, befinden zwischen 20 und 30 Basen stromaufwärts der transkriptionalen Startsstelle der eukaryotischen Gene. Zur einigen Genen gehören keine TATA-Boxen, sondern sogenannte Inr-Sequenzen (initiator sequences). Proximale (upstream) Promotorelemente, wie z.b. CAAT-Box und GC-Box, befinden sich innerhalb 30 bis 250 Basen stromaufwärts der Transkriptionsstartstelle. Die unterschiedlichen Boxen sind sogenannte Konsensussequenzen, d.h. das diese sich nicht oder nur leicht über große evolutionäre Distanzen unterscheiden. Vermischen wir die transkriptionelle und translationelle Start-Seite nicht miteinander! Transkriptionsstart und stopsequenzen sind die Beginn- und Endseite der mrna, die translationsstart (AUG) und stopsequenzen (UAA, UGA, UAG) sind die Start und Stopkodone der mrna. DIA 3 Die Tabelle zeigt unterschiedliche Promotormodule mit den dazugehörigen Transkriptionsfaktoren. Die Expression eines Gens (sie zeigt ein Expressionprofil = wie viele mrna, in welchen Zellen, wann exprimiert) wird durch eine Kombination von Modulen bestimmt. Anmerkung: Die Anwesenheit eines Moduls reicht für die Expression nicht aus, es muss für die Transkriptionsfaktoren zugänglich sein. Dasselbe Gen wird in verschiedenen Geweben verschiedene Modulen verwenden, nämlich die regulatorische DNA Sequnzen erkennende Transkriptionsfaktoren unterschiedlich sind. Symbolen in der Tabelle: N: A, G, T, C W: A oder T DIA 4 Enhancer und Silencer Die Enhancer/Silencer-Regulatorsequenzen sind in der Regel stromaufwärts des jeweiligen Gens lokalisiert, obwohl es auch einige Elemente stromabwärts oder innerhalb der Introns geben kann. Enhancersequenzen können bis zu Basenpaare von der eigentlichen kodierenden Region entfernt sein. Die Regulatorsequenzen eines durchschnittlichen Gens befinden sich innerhalb von Basenpaaren. Die Anzahl

2 und Typen der Regulatorelemente variieren in jedem Gen. Die Grenzen der Gene werden durch Insulatorsequenzen bestimmt, deren Funktion die Einschränkung des Effektes der Regulatorsequenzen der Gene ist. Wie ist es möglich, dass Enhancer-Elemente weit entfernt von den regulierten Genen liegen und trotzdem die Genexpression beeinflussen? Die Regulierung wird durch Schleifenbildung der DNA ermöglicht, wodurch, die Enhancer-gebundene Transkriptionsfaktoren, in nächster Nähe des Promotorgebundene Transkriptionsfaktoren gebracht werden. Enhancer können manchmal die gleichen motive enthalten, als die Promotoren, aber in anderen Kombinationen. Die Enhancer steigern die Transkription auf die 100-fache. Die Enhancer und die Transkriptionsfaktoren, die an die Enhancer gebunden sind können in drei Gruppen geteilt werden: 1 allgemein (funktioniert in jeder Zelle) 2, zelltyp-spezifisch 3, induzierbar Die Silencer hemmen die Transkription. Sie können entweder (1) die Kompaktierung des Chromatins durchadas Anlocken von Histon-Deacethylasen verursachen oder (2) hemmen die RNA-Polymerase. Der Pro-Initiationskomplex: Der Pro-Initiationskomplex erleichtert das Anheften der RNA Polymerase II zu dem Promoter, und damit die Transkription. Die RNA Polymerase besteht aus 12 Untereinheiten. Die Befestigung verschiedener Transkriptionsfaktoren an den Promoter oder an die Polymerase selbst muss der Bindung der RNA Polymerase an den Promoter vorausgehen. Der Pro-Initiationskomplex kann nur ein basales Expressionslevel eines spezifischen Gens initiieren. DIA 5 Transkriptionsfaktoren Die Trans- Faktoren der Transkription beeinflussen direkt die Genexpression, diese Faktoren sind die folgenden: RNA Polymerase, Transkriptionsfaktoren, Transkriptions-Kofaktoren. Fünf bis zehn Prozent der Gene der Eukaryoten kodiert Transkriptionsfaktoren, was die Wichtigkeit der genetischen Regulation zeigt. In den Eukaryoten gibt es drei Typen von RNA Polymerasen. RNA PolymeraseI transkribiert rrnas, RNA PolymeraseII transkribiert mrnas, RNA PolymeraseIII transkribiert trnas. Manche Transkriptionsfaktoren binden direkt an das TATA-Box (zb. TFIID), andere binden es indirekt (z.b TFIIA). Andere Transkriptionsfaktoren binden an RNA PolymeraseII. Das C/EBP Protein bindet an CAAT- Box, das SP1 Protein an das GC-Box. Viele Transkriptionsfaktoren erkennen die Enhancer-Elemente. Verschiedene Zellen haben eine Kombination von verschiedenen Transkriptionsfaktoren, die Zelltyp-spezifische Transkription ermöglichen. Transkriptionsfaktoren bestehen aus mehreren Untereinheiten, die sind meistens Homo- oder Heterodimäre. Heterodimäre ermöglichen eine weitere Möglichkeit der Regulation, da jede Kombination von Transkriptionsfaktoren unterschiedliche Folgen für die Transkription eines Gens hat. Die Aktivität der Transkriptionsfaktoren wird durch Kofaktoren beeinflusst. Posttranslationale Modifikationen (zb. Phosphorylierung) beeinflussen auch die Aktivität der Transkriptionsfaktoren. Viele Transkriptionsfaktoren sichern die Bindung des weit entfernten Enhancers an den Promotor. (Siehe Bild)

3 DIA 6 Transkriptionsfaktoren: DNA-Erkennungsmotive: Transkriptionsfaktoren binden das DNA durch verschiedene DNA-bindende Motive: (1) Helix-loop-helix (z.b. solche Transkriptionsfaktoren die die Gene des Immunsystems regulieren) (2) Zn-Finger (z.b. die Steroid Hormone, die alstranskriptionsfaktoren auch funktionieren) (3) Leuzin-Zipper (z.b. die Zellteilung regulierende Transkriptionsfaktoren) (4) Helix-turn-helix (z.b. die Faktoren die in der Ontogenese wichtige Rolle spielen) Diese Transkriptionsfaktoren interagieren miteinander und mit dem DNA als Dimäre. DIA 7 DNA-bindende und Aktivator-Domäne: Transkriptionsfaktoren binden das DNA und andere Transkriptionsfaktore und Kofaktore. Die meisten Transkriptionsfaktoren haben nicht nur ein DNA-bindende Domäne, sondern auch eine Transkriptionsaktivatordomäne. Eine Ausnahme ist Oct1. Es hat nur ein DNA- Bindungsdomäne, aber kann die Transkription selbst nicht aktivieren. Dazu ist VP16 Transkriptionsfaktor notwendig (es ist ein virales Protein von Herpes simplex), das aber alleine kein DNA binden kann. Oct1 und VP16 ergänzen also einander und können nur zusammen die Transkription bestimmter Gene aktivieren: entweder die Zusammensetzung, oder die Funktionierung des Pre-Initiationskomplexes. Andere Transkriptionsfaktoren die Transkription nicht aktivieren sondern hemmen. DIA 8 Zelltyp-spezifische Genexpression Obwohl fast alle unserer Zellen über den gleichen genetischen Inhalt verfügen, gibt e seine Menge unterschiedlicher Zelltypen, und jeder dieser Typen exprimiert andere Gene. Die Frage ist, wie die unterschiedlichen Zelltypen entstehen und wieso sie ihre spezifische Proteine exprimieren. Die verschiedenen Zelltypen entwickelten sich durch Differenzierung. Die genetische Basis der Differenzierung ist die Entstehung von unterschiedlichen epigenetischen Prozessen, wie Chromatinmethylierung- und Acetilierungsmustern in den einzelnen Geweben. Das Histonmuster bestimmt somit den Typ der exprimierten Transkriptionsfaktoren in der jeweiligen Zelle und eben diese Transkriptionsfaktoren bestimmen, ob eine Gen ein- oder ausgeschaltet wird. Normalerweise benötigt man mehrere Transkriptionsfaktoren und Kofaktoren zur Genkontrolle. Wenn einer dieser Faktoren fehlt, gibt es keine Transkription! Weiterhin findet keine Genexpression statt, obwohl der passende Transkriptionsfaktor anwesend ist, aber die Regulatorregion durch Histone blockiert wird. Induzierte Genexpression Äußere Wirkungen können die Expression bestimmter Gene auslösen. Signalwege, Stressfaktoren, Onthogenese usw. haben eine wichtige rolle in der Regulierung der Genexpression. DIA 9 Transkriptionsfabriken (Extra) In den nicht-teilenden Zellen ist der Chromatin nicht zufälligerweise verteilt, und die Transkription findet im Kern an bestimmten Stellen statt. Die Heterochromatin zb. ist dicht an der Oberfläche der inneren Kernmembran und in der Nähe des Nucleolus zu finden. Die DNA-Abschnitte von Genen die aktiv transkribiert werden, sind in der Nähe der Kernporen. Dies bedeutet, dass durch die Aktivierung eines Gens die Verteilung des Chromatins im Zellkern umgeordnet wird. Interessanterweise, die Gene die in den gleichen Prozessen involviert sind, liegen im Zellkern dicht nebeneinander obwohl sie auf verschiedenen Chromosomen lokalisiert sind. Im Kern existieren eine Art

4 Transkriptionsfabriken, in denen die aktiven Gene verschiedener Chromosomen und die Regulatorproteine in einem definierten Ort des Kerns nahe beieinander befinden. zb. TFF1 Gen befindet sich auf Chromosom 21 und GREB1 Gen auf dem Chromosom 22 aber wenn die Zelle mit Östrogen Hormon stimuliert wird, sie werden an gleicher Stelle im Zellkern transkribiert. Die biologische Bedeutung dieser Erscheinung ist, dass die transkribierten mrnas so schnell wie möglich Zugang aus dem Zellkern in das Zytoplasma haben. DIA 11 Koordination der Replikation und der Transkription. Die Replikation der DNA begint an mehreren Stellen des Chromosoms. DNA-Polimerase bindet an die Replikationorigos (ori) der DNA. Der DNA-Abschnitt zwischen zwei Origos heisst Replikon. Es gibt zwei Möglichkeiten die Replikation und die Transkription zu koordinieren. (1) Das Entfernen der Nukleosomen. In der S-Phase werden die Nukleusomen von der Umgebung der Replikationorigos entfernt. Das ermöglicht eine ungestörte Replikation, aber auch die Transkriprion kann in diesen Regionenungestört stattfinden. Gene, die in der Nähe der ori-regionen liegen, können in der frühen S- Phase transkibiert werden. Gene in der Nähe der Mitte des Replikons können in der späten S-Phase transkibiert werden. Eine nächste Stufe der Komplexität bedeute, dass sie verschiedene ori-regionen eines Chromosomes nicht gleichzeitig aktiviert werden. Ein bestimmtes ori bindet die DNA-Plymerase in verschiedenen Zelltypen in verschiedenen Zeitpunkten der S-Phase, was wegen der Koordiniertheit der Transkrition un der Translation zu zelltyp-spezifischen Expression führt. (2) Kollision der Transkription und der Replikation. Die Replikation geht von einer ori-region gleichzeitig in beide Richtungen los. DIA 12 Fakulultatives Material Transkriptioneller Interferenz Netzwerk (Transcription Intereference Network; TIN) Es ist ein wichtiger Teil unserer Forschungsthemen im Institut Zusammenfassung 1. Regulation des Chromatins durch - Methylierung - Acetylierung - Histone-repulsing sequences =Histon-abstoßende Sequenzen 2. Interaktionen zwischen Regulatorelementen Cis-Elemente: Promotor, Enhancer und Silencer Trans-Elemente: RNA Polymerase, Transkriptionsfaktoren und Cofaktoren Glossar Cis-Elemente: Strang wie das Gen) Promotor, Enhancer und Silencer (befinden sich auf dem gleichen DNA Chromatin ist ein Komplex aus DNA und Protein, den man im Inneren des Nukleus einer eukaryotischen Zelle findet. Die meisten Proteine, die im Chromatin vorkommen, sind Histonproteine. Die Funktionen des Chromatins sind das Packen von DNA in ein kleineres Volumen, die Verstärkung der DNA um Mitose und Meiose zu ermöglichen und ein Kontrollmechanismus für

5 die Expression. Veränderungen in der Chromatinstruktur werden hauptsächlich durch Methylierung und Acetylierung beeinflusst. Einfach betrachtet, gibt es drei Ebenen der Chromatinorganisation: 1. DNA Wicklung um Nukleosome. 2. Eine 30 nm kondensierte Chromatinfaser besteht aus Nukleosomen in ihrer kompaktesten Form. 3. H DNA Kondensation auf hoher Ebene in ein metaphasen Chromosom. DNA Chips: Wissenschaftler verwenden DNA Microarrays, um das Expressionslevel einer grossen Menge Gene simultan zu messen. Epigenetische Vererbung: der gleiche genetische Inhalt kann mehr als einen Phenotyp als Folge des z.b. maternalen Effekts bestimmen. Exon shuffling(mixen): Gewinn neuer Proteindomänen durch Erhalt eines neuen Exons von einem anderen Gen, das sich an einer anderen Stelle des Genoms befand. Forward genetics: Die experimentelle Prozedur, die mit einer Zufallsmutation beginnt und zu einer anschließenden Suche zur Bestimmung des veränderten Phenotypen bzw. mutierten Gens wird. Funktionelle Genomik nützt hohe Durchsatztechniken wie z. B. DNA microarrays* und Proteomik* um die Funktion und Interaktion der Gene zu beschreiben. Diese Techniken ermöglicht die gleichzeitige Analyse des Expressionslevels einer gewaltigen Menge Gene. Genexpression ist ein vielschrittiger Prozess, der mit der Transkription beginnt und von posttranskriptionaler Modifikation und Translation gefolgt wird. Gennetzwerke sind genetische Module und bestehen aus funltionell verbundenen Genen, welche die Entwicklung und Funktion bestimmter Merkmale, physiologischer Prozesse oder Verhalten beeinflussen. Das Genom eines Organismus ist die gesamte Erbinformation des Organismus, die in der DNA kodiert wird (oder, bei einigen Viren, RNA). Dies schließt sowohl die Gene als auch nichtkodierende Sequenzen ein. Genomik ist die Erforschung eines Genoms eines(r) Organismus/Spezies. Ein knockout Tier ist ein genetisch verändertes Tier (Maus), bei dem ein oder mehrere Gene zerstört wurden. Dabei können wir lernen, welche Funktion/-en die jeweiligen Gene haben, die ausgeschaltet wurden. Phenotyp: alles, was wir an Struktur, Funktion oder Verhalten an einem Organismus beobachten können. Protein chips (= protein microarrays) sind Messeinrichtungen, mit denen wir bei biomedizinischen Anwendungen den Proteingehalt bestimmen können. Proteom: Die Gesamtheit der Proteine, die in einem Organismus existieren. Besonders wichtig ist, dass, während das Genom* eher eine konstante Größe ist, das Proteom von Zelle zu Zelle variiert und andauernd während der biochemischen Interaktionen mit dem Genom und der Umwelt sich verändert. Proteomik ist eine großangelegte Studie von Proteinen (simultane Analyse einer großen Anzahl Proteinen). Dieser Begriff wurde als Analogie zur Genomik* eingeführt. Proteomik scheint deutlich komplizierter als Genomik zu sein und wird als nächstes Level nach der Genomik betrachtet.

6 Regulator RNAs ein weitverbreitetes Synonym ist non-coding RNA, RNA Moleküle, die, ohne transliert werden zu müssen, funktionieren. Ihre Funktionen beinhalten die Regulation der Genexpression auf dem Level der Transkription (Chromatin Modifikation) und Translation. Reverse genetics (Rückwärts Genetik) Der experimentelle Ansatz, der mit einem geklonten DNA- Segment beginnt und anschließend in ein Hostgenom eingefügt wird. Die fremde DNA kann sowohl als Transgen, welches in Wirtstieren überexprimiert ist, als auch als knock out Werkzeug genutzt werden, um ein endogens Wirtsgen auszuschalten. Das Ziel der reversen Genetik ist, einen veränderten Phenotype durch Genmanipulation zu erforschen. Ribonuklease (RNase) ist ein Enzym, das den Abbau der RNA in kleinere Bestandteile katalisiert. Signaltransduktion: ist jeder Vorgang, bei dem eine Zelle einen Stimulus in einen anderen umwandelt. Prozesse, die als Signaltransduktion bezeichnet werden, umfassen oft eine Sequenz von biochemischen Reaktionen innerhalb der Zelle, welche durch Enzyme und andere Proteine über einen Second messenger miteinander verbunden sind. Stille Kodonpositionen. Der genetische Kode ist redundant, was in den meisten Fällen bedeutet, dass mehr als ein Kodon eine einzelne Aminosäure bestimmt. Solch Basenersatz, der nicht in eine Änderung der Aminosäuren resultiert, wird stiller Wechsel genannt Die Positionen der Kodone (i.d.r. das dritte), welche ersetzbare Basen enthalten nennt man stille Kodonpositionen. Small interfering RNA (sirna), bilden eine Klasse von Nukleotide-langen RNA Molekülen, die die Genexpression stören. Diese werden auf natürlichem Wege produziert als Teil der RNA Interferenz (RNAi) durch das Enzym Dicer. Diese können auch exogen (künstlich) eingebracht werden, um eine Gen absichtlci auszuschalten. sirnas haben eine ganz bestimmte Struktur. Es ist eine kurze (für gewöhnlich 21-Nukleotide) doppelsträngige RNA (dsrna) mit 2-Nukleotid Überhang an ihrem jeweiligen Ende, einschließlich eine 5' Phosphatgruppe und eine 3' hydroxy (-OH) Gruppe. Spliceosom ist ein Komplex aus RNA und vielen Proteinuntereinheiten, die die nichtkodierenden Introns aus der Pro-mRNA entfernen. Die RNAs, aus denen die Spliceosome bestehen, werden als U1, U2, U4, U5, und U6 bezeichnet, und partizipieren in mehreren RNA-RNA und RNA-Protein Verbindungen Trans-Elemente: sich im Zytoplasma) RNA Polymerase, Transkriptionsfaktoren und Cofaktoren (befinden Transkriptionsfaktor: Ein Protein, das an die DNA bindet mithilfe eines Promoters und Enhancers oder anderen Transkriptionsfaktoren und dabei direct die Transkription kontrolliert. Transkriptionsfaktoren können selektiv aktiviert werden bzw. durch andere Proteine deaktiviert werden, was oft als letzter Schritt in der Signaltransduktion* geschieht. Transgenischer Organismus: ein Organismus, der über integrierte fremde DNA verfügt, die in seine Keimbahn durch experimentelle DNA-Einfügung gelangte. Rekombinante DNA Techniken werden oft verwendet, um transgenische Organismen zu produzieren. Ubiquitin ist ein Polypeptid, der aus 76 Aminosäureresten besteht, und an verschiedene spezifische Proteine konjugiert werden kann durch Mitglieder einer komplexen Familie von Enzymkaskadensystemen, wobei signalisiert wird, dass das betroffene Protein für den Abbau bestimmt ist.

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