Vorlesung Zellbiologie und Physiologie der Pflanzen. Teil 1. Epigenetische Phänomene. Mechanismen und Funktionen. Heute:

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1 Vorlesung Zellbiologie und Physiologie der Pflanzen AG Kudla Oliver Batistič Heute: Epigenetische Phänomene & RNA Silencing Zielstellungen der heutigen Vorlesung : - Die RNA- Welt - epigenetische Phänomene - RNA interference (RNAi) - Grundlegende Mechanismen und Gemeinsamkeiten - unterschiedliche Resultate - mirnas - sirnas - trans-sirnas - Vergleich der Prozesse und Enzyme - Systemische Ausbreitung von RNAi - Anwendungen von RNAi Teil 1 Epigenetische Phänomene Blütenpigment Biosynthesein Petunia Key enzyme: chalconesynthase Mechanismen und Funktionen Dihydroflavonol 4-reductase Hypothese: Überexpression von CHS soll Anthocyanbildung verstärken CHS Überexpression in Petunie Endogenous gene PRO ORF mrna Protein translatiert mrna Transgene Sense construct: PRO ORF Sense RNA Extra protein translated mrna mrna 1

2 Epigenetische Phänomene Transkriptionelle Gen-Inaktivierung (TGS) DNA-Methylierung verursacht Chromatinkondensierung Epigenetische Phänomene: Jede stabile und vererbbare Veränderung der Genexpression (und damit auch eines Phänotypes) die nicht auf einer Änderung der DNA- Sequenz (also nicht auf einer Mutation) beruht! Epigenetische Phänomene sind prinzipiell reversibel. Epigenetische Phänomäne werden molekular reguliert durch DNA Methylierung Histon Modifikationen RNAi Prozesse (Teil 2) Epigenetische Regulation in Pflanzen: Blühinduktion (Entwicklungsprozesse) Umweltanpassung Transposon silencing Paramutationen (Gene silencing in trans) Kontrolle von Imprinted Genes DNA Methylierung und Histon Modifikationen zusammen beeinflussen Chromatin Struktur kondensiertes Heterochromatin (Inaktiv) lockere Euchromatin (Aktiv) DNA Methylierung von Cytosin durch Methyltransferasen behindert Bindung DNA bindender Proteine DNA Methylierungen können vererbt werden und sind reversibel Inhibition der Transkription Methylierungsmuster werden durch ubiquitin like containing PHD and ring finger domain (UHRF) Proteine erkannt, rekrutiert DNA-Methyltransferases 2

3 Histon Modifikationen beeinflussen Chromatinstruktur N-terminale Schwänzeder Histone können unterschiedliche Modifikationen aufweisen Der Histon Code Histonmodifikation H4: K8 Acetylierung Aktivierung H3: K14 Acetylierung Aktivierung H3: K27 einfache Methylierung Aktivierung H3: K27 dreifache Methylierung Repression H2B: Ubiquitinierung Aktivierung H2B: S14 Phosphorylierung DNA-Reparatur Modifikationen von Lysin Resten beeinflussen direkt den Grad der Chromatin Kondensation Methylierte Histonerekrutieren Proteine die weiter die DNA/Chromatin Struktur und Transkription beeinflussen -Polycombproteine(PC) (inhibierentranskription) werden durch Histon Methylierungen rekrutiert + TATA-Box bindende Proteine (aktivierentranskription) werden durch Histonacetylierungen rekrutiert Vererbung von Histonmodifizierungen semikonservativ (Modell 1) vs. Nachbarschaftsmodell (2) Histonmodifikationen sind reversibel HAT: HistonAcetyl Transferase DHAC: Histon Deacetylase 3

4 Konstitutive Funktion der Heterochromatinbildung Fakultative Heterochromatinbildung beeinflusst Pflanzenentwicklung Epigenetische Kontrolle der Blühinduktion Mutanten im FLOWERING LOCUS C (FLC) blühen ohne Vernalisation FLC inhibiert Flowering Locus T - einen Aktivator der Blühinduktion FTwird in Blättern gebildet, und wandert dann zum meristematischen Gewebe FT = Florigen 4

5 FLCwird durch Vernalisierungtranskriptionellinaktiviert FLC wird durch HistonModifikation und Assoziation von Polycombproteine reguliert Besonderheit: Inaktivierung von FLC ist quantitativ Zusammenfassung Teil 1 Chromosomenstruktur und transkriptionelle Aktivität von Genen kann durch DNA Methylierung und Histon-Modifikationen beeinflusst werden Methylierungsmuster und Histonmodifikationen können vererbt werden, und sind reversibel Methylierungsmuster und Histonmodifikationen können z.b. Blühinduktion beeinflussen Teil 2 RNA silencing und Epigenetische Phänomene RNA silencing: RNA silencing verschiedene RNA-basierende Prozesse die alle zur Sequenz-spezifischen Inhibierung der Gen-Expression führen. (Transkription, mrna-stabilität, Translation) Mechanismen und Funktionen 5

6 Post-transkriptionelle Gen-Inaktivierung (PTGS) RNAsilencing erfolgt mittels kleiner einzelsträngiger RNASpezies (21-24 nt Länge): je nach Herkunft und Funktion unterscheidet man: small interfering RNAs (sirna) micro RNAs (mirna) trans-acting sirna(ta-sirna) natural-cis sirna(nat-sirna) repeat-associated sirna/cis-acting sirna(rasirna, casirna) Allen gemeinsam ist eine Funktion beim Gene Silencing! Was sind small interfering RNAs? Gene targeting durch antisense-rna 3 5 antisense-dna LB T- DNA RB vir-gene ori noc tra Im Genom der Pflanze 2 Kopien: Endogenes Gen: sense Transgen: antisense Transkription von mrna und anti-sense RNA in planta 3 5 Annealing mrna? anti-sense Silencing 5 3 Grundprinzipien des RNA silencing(rna interference) dsrna RNA silencing: Die Rolle von Dicer (bzw. Dicer like [DCL]) Dicer small dsrna (ca nt mit 2 Nucleotid Überhang) Dicer schneidet dsrna-vorläufer Durch die Endonuklease Aktivität der RNaseIII Domänen. PAZ Domände bindet am Ende der dsrna Abstand der RNAseIII Domänen bestimmt nt Fragmentgröße Grundprinzipien des RNA silencing (RNA interference) RNA silencing: Die Rolle von Argonaute dsrna Dicer small dsrna (ca nt mit 2 Nucleotid Überhang) RISC (RNA Induced Silencing Complex) mit Argonaute Protein Arabidopsis ago1 octopus Argonauta argo small ssrna (sirna) mit RISC Argonaute: silencing effectorprotein, die gebundene Einzelstang RNA führt den Komplex zum Ziel, Ziel-RNAbindet 5 an Mid und 3 an PAZ Domäne Schnitt der Target RNA im katalyt. Zentrum der Piwi Domäne 6

7 Grundprinzipien des RNA silencing (RNA interference) Weitere Post Transkriptionelle Silencing(PTGS) Effekte dsrna Dicer small dsrna (ca nt mit 2 Nucleotid Überhang) RISC (RNA Induced Silencing Complex) mit Argonaute Protein small ssrna (sirna) mit RISC mrna Silencing Targeting Komplexbindung an endogene, komplementäre mrna Abbau der mrna nächste mrna Die Funktion von sirnas Virus-induziertes gene silencing (VIGS) Abbau und Silencing unerwünschter Transkripte Gene Silencing von Transposonsoder repetitiver Elemente Epigentik Bekämpfung von Virusinfektion sirna Mutanten besitzen eine verminderte Viren-Resistenz Systemische Resistenz durch Virus-induziertes gene silencing(vigs) WT Arabidopsis +TRV Double mutant dcl2-dcl4 +TRV Tobacco Rattle Virus (TRV) silencing in wild-type Arabidopsis plants prevents disease symptoms. Mutants deficient in Dicer activity are unable to suppress viral infection. 7

8 Wie kann sich sirna systemisch ausbreiten? Systemische Ausbreitung RNAi vermittelter Signale Systemische Ausbreitung RNAi vermittelter Signale - kleine RNAs können symplastisch weitergegeben werden - oder über Phloem transportiert - die effektive, systemische Ausbreitung erfordert eine Amplifikation des silencing Effekts mittels RDR RNA silencing: Verstärkung des silencing Effekts durch RNA abhängige RNA Polymerasen durch Argonaut geschnittene mrnadient als Matritze für RNA-abhängige RNA Polymerase (RNA-dependentRNA polymerase, RDR) in Komplex mit SGS3 (supressor of gene silencing) doppelsträngigerna wird durch DCL4 prozessiert Amplifikation ermöglicht systemische Ausbreitung Virale Proteine können die Funktion von sirna aufheben Das 19K Protein (P19) ein viraler Suppressor Tabakpflanze mit GUS Gen, mittels RNAi gesilenced. Kein viraler Suppressor: GUS Gen inaktiv Mutierterviraler Suppressor: GUS Gen inaktiv Viral suppressor: GUS gene expressed Viral suppressor RNA Silencing wird durch virale Proteine inhibiert. Dabei kann jeder Schritt beeinflusst werden. sirna sirna sirna Transcription z.b. Tomato Bushy Stunt Virus: - Dimer bindet dsrna(21nt) kein Einbau in RISC - Transkriptionelle Regulation von AGO1 8

9 RNA silencing: Vergleich sirna und micro RNA mirna Reifung in Pflanzen und Tieren sirna: small interfering RNA - wird aus dsrna gebildet -Strang und Gegenstrang bilden perfekte Paarung - Ursprung-RNA wird abgebaut (cis) mirna: microrna - werden von Genen kodiert -Bilden Stamm-Loop-Struktur, keine perfekte Paarung - Vorläufer mirna wird von DCL1 prozessiert (Nucleus), mirna duplex wird in Cytoplasma transportiert -guidernawird in RISC eingebaut - endogene mrna wird abgebaut (trans) mirtron RNA silencing: welcher RNA Strang bleibt übrig? Funktion von mirnas dsrna bindet in pre-risc, -guide Strang: Bindetan Ziel-RNA mitago und vermittelt Ziel-RNA Abbau - passenger Strang: wird durch AGO abgebaut - pre-risc wird zum aktiven RISC Unterschiede am 5 Ende bestimmen guide und passenger: Strang mit weniger stabilen 5 -Ende verbleibt im RISC (guide), Strang mit stabilem 5 -Ende (passenger) wird abgebaut Funktion von mirnas bei der Blattbildung Phabulosa wird durch mir165/6 reguliert Funktion mir165/6 bei der Wurzelanatomie mir165/6 PHB Wildtyp PHB PHB mit mutierter mirna target site Transkriptverteilung wird durchmirna reguliert adaxial(hoch) abaxial(niedrig) Transkriptverteilung nicht mehr regulierbar durch mirnas lokale PHB Expression globale PHB Expression mir165/6 werdenin der Endodermis exprimiert und smyplastisch verteilt Konzentrationsgradientvon mirna begrenztdie Expression von PhabulosaimzentralenBerreichdes Zentralzyllinders 9

10 Blätter: niedrige Expression von (kann über Phloem transportiert werden; Target von ist PHO2 -wird in der Wurzel exprimiert) wenige Moleküle erreichen Wurzel, kein Einfluss auf PHO2 Wurzel: hohe Expression von PHO2 (vermittelt die Degradation von Proteinen notwendig für Phosphataufnahme) Funktion von bei der Phosphataufnahme Phosphat + - PHO2 P i PHO2 P i Blätter: hohe Expression von und erreicht über das Phloem die Wurzel negativer Einfluss auf PHO2 Wurzel: niedrige Expression von PHO2 (Proteinen notwendig für Phosphataufnahme werden stabilisiert - Phosphataufnahme) Funktion von mirna168 Feedback-Regulation von AGO1 durch virale Suppressoren AGO1 Transkript wird selbst durch mirna168 gesteuert Die Menge an mirna168 kann durch virale Proteine wie P19 erhöht werden verstärkte Suppression von AGO1 Bildung von trans-acting-sirnas erfolgt mit Hilfe von mirnas TAS Gen im Genom kodiert: -Transkript des TAS-Gens wird durch mirna gebunden -TAS-Gen Transkript wird mittels RISC geschnitten - verkürztes Transkript wird durch RNA-abhängige RNA Pol. kopiert - doppelstrang RNA wird durch DCL4 mehrfach geschnitten (tasirna Duplexe) - tasirna bindet an Ziel-mRNA, Abbau durch RISC Hitzeschock Toleranz in Arabidopsis wird durch TAS1 reguliert HEAT-INDUCED TAS1 TARGET TAS Gene in Arabidopsis: TAS1/TAS2, Ziel: pentatricopeptide repeat genes und HTTs TAS3, Ziel: ARF transcription factor TAS4, Ziel: MYB transcription factor Die Länge der mirnasteuert mrnaabbau oder RNA Kopierung 21ntmiRNA: 22-24ntmiRNA: RNA Schnitt mittels AGO Degradation RNA Schnitt mittels AGO Zweitstrangsynthese mittels RDR Bildung von Natural antisense-sirnas(nat-sirna) - sense Gen wird konstitutiv exprimiert -antisense Gen wird stress-induziert exprimiert (z.b. Salzstress) - Transkripte von sense und antisense Gen binden im überlappenden Bereich -komplementärer Überlapp wird durch DCL2 geschnitten, nat-sirna Duplexe werden gebildet - nat-sirna bindet an die ursprüngliche Transkripte -Ursprung-RNA wird durch RISC geschnitten, und durch RDR kopiert, doppelsträngige RNA wird durch DCL1 geschnitten - nat-sirna bildet mit RISC Komplex, bindet an Ziel-mRNA - Ziel-mRNA wird geschnitten 10

11 repeat-associatedsirna/cis-actingsirnavermittelt transkriptionelles gene silencing (TGS) DNA-abhängige RNA Polymerasen IV und V sind pflanzenspezifisch transkriptionell inaktiver Bereich der DNA wird von RNA-Polyermase IV abgelesen (reich an repetitiven Elementen) Transkript dient als Matrize für RDR doppelsträngigerna wird durch DCL3 zu kurzen RNA-Duplexen prozessiert rasi/casirna komplexiert mit AGO RNA-AGO Komplex interagiert mit RNA- Polymerase V und bindet an komplemtären DNA -Strang Komplex vermittelt die Bindung von DNA- Methyltransferasen und Histonmodifizierenden Proteinen - Heterochromatinbildung Überblick: Unterschiedliche Funktionen verschiedener Argonaute Proteine TranskriptionellesSilencing von FLC erfolgt vielleicht durch FLC Antisense RNA RNAi vermittelte Paramutationen am booster1 Lokus in Mais? RNAi vermitteltes silencing von Transposons B /B + B-I/B-I Transposons = springende Gene (erstmals Beschrieben in Mais von Barbara McClintock, 1948) 75% des Maisgenoms besteht aus Transposon DNA + B /B-I B-I/B-I 100% B Erwartet: 50% 50% Nach Mendel erfolgt eine Aufspaltung 50%:50% durch das B Allel bilden 100% der Nachkommen weniger Anthocyane Allel B überträgt Eigenschaften auf B-I (paramutiert) mit Hilfe von RNA-abhängigen RNA Polymerasen 11

12 RNAi vermitteltes silencing von Retrotransposons Virus-induziertes transkriptionelles gene silencing Genomstabilität wird durch RNAi gewährleistet 1. post-transkriptionelles silencing 2. transkriptionell inaktiv durch RNAi vermittelte DNA methylierung und Histonmodifizierung Biotechnologische Anwendung: Gene silencing mit Hilfe artifizieller mirna (amirna) Online Tools helfen beim Design der artificial mirna Intron LB T- DNA RB Transkription in planta Annealing vir-gene noc tra Splicing ori Targeting Gene targeting durch mirna induced gene silencing (MIGS) Vorteile: - kein Design der mirna - mirna-target Sequenz kann leicht mittels PCR Primer angebracht werden - PCR Fragment leicht klonierbar 12