RIDA QUICK Legionella

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1 RIDA QUICK Legionella Art. No.: N8003 R-Biopharm AG, An der neuen Bergstraße 17, D Darmstadt, Germany Tel.: +49 (0) / Telefax: +49 (0) C

2 1. Anwendungsbereich Für die in vitro Diagnostik. Der RIDA QUICK Legionella ist ein immunchromatografischer Schnelltest zum qualitativen Nachweis von Legionella pneumophila-antigen in Urinproben. 2. Zusammenfassung und Erklärung des Tests Die Gattung Legionella gehört zur Familie der Legionellaceae und wird in über 40 Spezies mit mehr als 70 Serogruppen unterteilt. Legionellen sind fakultative, intrazelluläre gram negative Bakterien und haben ihren Infektionspeak in den Sommer- und frühen Herbstmonaten. Bei Legionellenerkrankungen unterscheidet man zwischen ambulant erworbenen, reisebedingten und nosokomialen Infektionen. In den USA liegt die Mortalitätsrate nosokomialer Infektionen zwischen 15-20%. 1,2 In Europa verlaufen 12% aller Legionellen-Infektionen tödlich. Unter der großen Anzahl an Legionellen-Spezies sind zwei wichtige humanpathogene Spezies. Eine Infektion mit L. pneumophila führt hauptsächlich zur Legionärskrankheit (auch Legionellose genannt) und L. longbeachae verursacht Pontiac-Fieber. Pontiac-Fieber ist eine akute, selbst-limitierende Influenza-ähnliche Erkrankung, jedoch ohne das Auftreten einer Lungenentzündung. Ungefähr 7% der an Legionellen erkrankten Patienten entwickelt das Pontiac-Fieber. 3 L. pneumophila wird in 16 Serogruppen unterteilt, wobei mehr als 70% der Legionellen- Infektionen in Europa durch L. pneumophila Serogruppe 1 verursacht werden. Andere Spezies, die zu einer Legionellen-Infektion führen, sind unter anderem L. micdadei, L. bozemanii, L. dumoffii und L. longbeachae. 4 Die Legionärskrankheit ist eine akute, respiratorische Infektion, die hauptsächlich durch L. pneumophila verursacht wird. Sie wurde erstmals 1976 in Philadelphia während einer Tagung der Amerikanischen Legion beschrieben. Dadurch erhielt die Legionärskrankheit ihren Namen. Zwei aktuellere Legionellose-Ausbrüche mit insgesamt 6 Toten wurden 2013 in Brisbane, Australien und Reynoldsburg, Ohio gemeldet. Die Symptome sind Fieber, Husten (trocken oder sputum-produzierend) und Schüttelfrost. Andere, weniger häufig vorkommende Symptome sind Diarrhoe, Erbrechen, Bradykardie und Hyponatriämie. 3 Menschen in jedem Alter können sich mit Legionellen infizieren, aber ältere Menschen, sowie Raucher und Patienten mit chronischer Lungenerkrankung, sind vermehrt anfällig für solch eine Infektion. Selbst in Ländern mit effektivem Gesundheitssystem werden bis zu 90% der Fälle von Legionärskrankheit nicht diagnostiziert, da die klinische Präsentation sehr breit gefächert ist und die Erkrankung insgesamt selten auftritt. Außerdem ist es schwer, die Legionärskrankheit nur durch Symptome oder radiologische Untersuchungen von anderen Pneumonien zu unterscheiden. Die schon sehr frühe Nachweisbarkeit Legionellen-spezifischer löslicher Antigene im Urin von Patienten mit Legionärskrankheit machen Urin zur idealen Untersuchungsmatrix früher aber auch später Krankheitsstadien einer Legionellose 5,6. Der RIDA QUICK Legionella Schnelltest eignet sich besonders zur Detektion von löslichem Legionellen-Antigen im Urin von Patienten mit Infektionen mit Legionella pneumophila der Serogruppe 1, aber auch zur Detektion seltener vorkommender Serogruppen von Legionella pneumophila. RIDA QUICK Legionella

3 3. Testprinzip Der vorliegende Schnelltest ist ein einstufiger immunchromatografischer Lateral-Flow Test, bei dem sowohl biotinylierte als auch goldmarkierte Anti-Legionella- Antikörper eingesetzt werden. Sobald in einer positiven Probe Legionellen-Antigene vorhanden sind, bilden sich Immunkomplexe mit den markierten Anti-Legionella - Antikörpern aus, die dann durch die Membran laufen. Das an der Testlinie T befindliche Streptavidin bindet die heranfließenden Immunkomplexe über das an die Anti-Legionella-Antikörper gekoppelte Biotin und führt so zu einer rot-violetten Färbung der T-Linie. An der nachfolgenden Kontrolllinie C werden durchlaufende nicht komplexierte goldmarkierte Antikörper gebunden. Bei negativen Proben erfolgt demnach keinerlei Bindung goldmarkierter Immunkomplexe an der T-Linie, sondern nur an der C-Linie. Die rote C-Linie zeigt stets an, ob der Testverlauf valide war. 4. Packungsinhalt Die Reagenzien einer Packung reichen für 25 Bestimmungen Cassette 25 Best 25 einzeln verpackte Testkassetten Reagent A 13,5 ml Spezifische Anti-Legionella-Antikörper; enthält 0,05 % Azid, gebrauchsfertig blau gefärbt Reagent B 13,5 ml Spezifische Anti-Legionella-Antikörper; enthält 0,05 % Azid, gebrauchsfertig, gelb gefärbt Pipet 25 Stck Beutel mit 25 Einwegpipetten Reagent vial 25 Stck Beutel mit 25 Reaktionsgefäßen Pipet Tip 100 Stck 4 Beutel mit je 25 Pipettenspitzen Microlit Pipet 1 Stck Pipette für 100 µl - Volumen 5. Reagenzien und ihre Lagerung Die Packung kann bei 2-25 C gelagert werden und ist bis zum aufgedruckten Verfallsdatum verwendungsfähig. Nach Erreichen des Verfallsdatums kann keine Qualitätsgarantie mehr übernommen werden. Ebenso kann eine Verwendungsfähigkeit von Kassetten dann nicht mehr gewährleistet werden, wenn die Kassettenverpackung beschädigt ist. 6. Zusätzlich benötigte Reagenzien erforderliches Zubehör - Vortexmischer (optional) - Abfallbehälter mit einer 0,5 %igen Natrium-Hypochloritlösung 7. Vorsichtsmaßnahmen Nur für die in vitro Diagnostik. RIDA QUICK Legionella

4 Dieser Test ist nur von geschultem Laborpersonal durchzuführen. Die Richtlinien zur Arbeit in medizinischen Laboratorien sind zu beachten. Die Gebrauchsanweisung zur Durchführung des Tests ist strikt einzuhalten. Die Reagenzien enthalten als Konservierungsmittel Natriumazid. Eine Berührung mit der Haut oder Schleimhaut ist zu vermeiden. Proben oder Reagenzien nicht mit dem Mund pipettieren. Kontakt mit verletzter Haut oder Schleimhäuten vermeiden. Während des Umgangs mit Proben Einmal-Handschuhe tragen und nach Abschluss des Tests die Hände waschen. In Bereichen, in denen mit Proben gearbeitet wird, nicht rauchen, essen oder trinken. Sämtliche Reagenzien und Materialien, die mit potentiell infektiösen Proben zusammenkommen, müssen genau wie diese mit geeigneten Desinfektionsmitteln (z.b. Natrium- Hypochlorit) behandelt oder mindestens eine Stunde bei 121 C autoklaviert werden. 8. Sammlung und Lagerung der Proben Urinproben sind in sauberen Standardbehältern zu sammeln und können bis zur Verwendung im Test 24 Stunden bei Raumtemperatur oder auch 2-8 C gelagert werden. Darüber hinaus ist die Lagerung bei 2-8 C für weitere 3 Tage möglich. Sollte vor Verwendung eine noch längere Lagerung notwendig sein, müssen die Urinproben bei -20 C gelagert werden. Mehrfaches Einfrieren und Auftauen der Probe ist zu vermeiden. Die Urinproben dürfen nicht in Transportbehältern gesammelt werden, die Transportmedien mit Konservierungsstoffen, tierischen Seren, Metall-Ionen, oxidierenden Agenzien oder Detergenzien enthalten, da Interferenzen mit dem RIDA QUICK Legionella-Test auftreten können. 9. Testdurchführung 9.1. Allgemeines Vor Verwendung sind die Proben, die Reagenzien sowie die Testkassetten auf Raumtemperatur (20-25 C) zu bringen. Die Testkassetten sollen erst kurz vor Verwendung der Umverpackung entnommen werden. Einmal benutzte Kassetten dürfen nicht wiederverwendet werden. Direkte Sonneneinstrahlung während der Testdurchführung ist zu vermeiden. Überschüssiges Reagenz darf nicht wieder in die Gefäße zurückgegeben werden, da dies zu einer Kontamination führen kann Vorbereitung der Proben Grundsätzlich sind alle Urine vor Verwendung gründlich zu mischen und können dann unverdünnt im Test eingesetzt werden. Die während der Lagerung der Urinproben eventuell entstandenen Salzkristalle müssen durch Erwärmen auf 37 C vollständig aufgelöst werden, bevor die Urine im Test eingesetzt werden können. Urine, die aus unterschiedlichen Gründen große Partikel aufweisen, müssen vor Verwendung gefiltert werden. RIDA QUICK Legionella

5 9.3. Vorbereitung der Probentestung Bitte beachten: Für jeden Pipettierschritt ist eine neue Pipettenspitze Pipet Tip zu verwenden. In ein gekennzeichnetes Reaktionsgefäß Reagent vial werden je 100 µl Reagenz A Reagent A und Reagenz B Reagent B vorgelegt. Danach werden 2 x 100 µl der zu untersuchenden und gemäß 9.2. vorbereiteten Urinprobe zum Reagenzienmix aus Reagenz A und Reagenz B ins Reaktionsgefäß Reagent vial hinzugeben. Das Reaktionsgefäß Reagent vial fest verschließen und den Inhalt gut mischen (optional: vortexen). Danach das Reaktionsgefäß Reagent vial in den im Testkit befindlichenreagenzieneinsatz stellen und das Gemisch für 10 min bei RT reagieren und eventuell vorhandene Feststoffe sedimentieren lassen Proben -Testung Die der Umverpackung entnommene Testkassette Cassette wird auf eine ebene Unterlage gelegt. Danach wird eine unbenutzte Pipettenspitze Pipet Tip auf die Microlitpipette Microlit Pipet gesetzt und 100 µl Überstand aus dem Urin-Reagenzienmix entnommen und in das Applikationsfeld der Testkassette pipettiert. Es ist darauf zu achten, dass die Flüssigkeit ungehindert durch die Membran läuft. Bei richtiger Durchführung erscheint die Kontrollbande an der Kontrolllinie C nach etwa 1,5 Minuten. Sollte die Kontrolllinie nicht nach 1,5 Minuten sichtbar sein, so muss die Probe vor Zugabe in ein neu herzustellendes Gemisch aus Reagenz A und Reagenz B für 5 min bei 5000 g zentrifugiert werden um eventuell störende Festpartikel in der Probe zu sedimentieren. Das Testergebnis ist immer nach 10 Minuten abzulesen. Die Färbung der Banden und deren Intensität kann sich während der Gesamtentwicklungszeit und nach Trocknung des Streifens verändern von rot-violett nach blau- bis grau-violett. 10. Qualitätskontrolle Anzeichen für Reagenzienverfall Der Test ist nur auszuwerten, wenn die Testkassette vor dem Einpipettieren der Probensuspension unversehrt ist und keine farbigen Veränderungen oder Banden darauf zu sehen sind. Ferner muss nach der 10-minütigen Inkubationszeit mindestens die rotviolette Kontrollbande sichtbar sein. Erscheint diese nicht, ist vor einer Testwiederholung folgendes zu prüfen: - Haltbarkeit der Testkassetten und der verwendeten Reagenzien - Korrekte Testdurchführung - Kontamination der Reagenzien Ist danach bei Wiederholung des Tests mit einer neuen Testkassette die Kontrollbande wiederum nicht sichtbar, wenden Sie sich bitte an den Hersteller oder Ihren lokalen R-Biopharm Distributeur. 11. Auswertung und Interpretation Es dürfen maximal zwei Banden erscheinen, vom Probenapplikationsfeld aus gesehen in fol RIDA QUICK Legionella

6 gender Reihenfolge: Eine rotviolette Reaktionsbande an der Testlinie T und eine rotviolette Kontrollbande an der Kontrolllinie C. Fehlt die Kontrollbande ist der Test nicht auswertbar und ungültig! Folgende Interpretationen sind möglich: - Legionella positiv: beide Banden sind sichtbar. - Legionella negativ: nur die Kontrollbande ist sichtbar. - Ungültig: keine Bande ist sichtbar oder eine andere Konstellation als oben beschrieben. Ebenso sind Banden-Verfärbungen, die erst deutlich später als nach 10 Minuten auftreten, ohne diagnostischen Wert und nicht zu beurteilen. 12. Grenzen der Methode Der RIDA QUICK Legionella weist spezifisch lösliches Antigen von Legionella pneumophila in Urinproben nach. Ein Zusammenhang zwischen der Intensität der sichtbaren spezifischen Bande und dem Auftreten oder der Schwere klinischer Symptome kann hieraus nicht abgeleitet werden. Die erzielten Ergebnisse sind immer in Verbindung mit dem klinischen Bild zu interpretieren. Ein positives Ergebnis schließt die Anwesenheit anderer infektiöser Erreger oder Ursachen nicht aus. Ein negatives Ergebnis schließt eine mögliche Infektion mit Legionella nicht aus. Es kann durch intermittierende Ausscheidung des löslichen Antigens oder durch eine zu geringe Menge in der Urinprobe verursacht sein. Besteht anamnestisch der begründete Verdacht auf eine Infektion mit dem gesuchten Erreger, sollte eine weitere Urinprobe des Patienten untersucht werden. 13. Leistungsmerkmale 13.1 Klinische Sensitivität und Spezifität In einer Validierungsstudie mit dem RIDA QUICK Legionella wurden retrospektiv 100 Proben untersucht. Diese Proben waren im Rahmen der Routinediagnostik des Legionellen Referenzlabors in Dresden gesammelt und anschließend bei -20 C asserviert worden. Nach Auftauen wurden die Proben vergleichend im RIDA QUICK Legionella und einem weiteren kommerziellen Schnelltest untersucht. Die Ergebnisse der Untersuchung sind in Tabelle 1 zusammengefasst. Tab. 1: Korrelation zwischen dem RIDA QUICK Legionella und einem weiteren kommerziellen Schnelltest Schnelltest RIDA QUICK Legionella positiv negativ positiv 44 7 negativ 1 44 Positive Übereinstimmung: 91,7% Negative Übereinstimmung: 91,7% RIDA QUICK Legionella

7 13.2 Präzision Zur Bestimmung der Präzision des RIDA QUICK Legionella Tests wurden die Intra-Assay- Reproduzierbarkeit (10 Replikate / 1 Tag / 1 Operator / 1 Lot), die Inter-Day-Reproduzierbarkeit (3 Replikate / 10 Tage / 1 Operator / 1 Lot), die Inter-Operator-Reproduzierbarkeit (3 Replikate / 1 Tag / 3 Operatoren / 1 Lot) und die Inter-Lot-Reproduzierbarkeit (3 Replikate / 1 Tag / 1 Operator / 3 Lots) untersucht. Für jede Untersuchung wurden 5 Referenzen gemessen: eine negative, zwei schwach positive und zwei mittelstark positive. Der RIDA QUICK Legionella Test zeigte in 100% der Messungen das erwartete Ergebnis Kreuzreaktivität Verschiedene pathogene Keime des Intestinaltraktes wurden mit dem RIDA QUICK Legionella Test untersucht und zeigten bis auf Staphylococcus aureus (eingesetzt in einer Konzentration von 1,6x 10 7 KBE/ml) keine Kreuzreaktivität. Durchgeführt wurden die Untersuchungen mit Bakteriensuspensionen (10 6 bis 10 9 KBE/ml), mit Zellkulturüberständen virusinfizierter Zellen und mit Antigenpräparationen für den Einsatz im ELISA. Die Ergebnisse sind in Tabelle 2 aufgelistet. Tab. 2: Potentiell kreuzreaktive Keime im RIDA QUICK Legionella Testkeim Herkunft Ergebnis Adenovirus Zellkulturüberstand negativ Bacillus cereus Kultur negativ Campylobacter coli Kultur negativ Campylobacter jejuni Kultur negativ Candida albicans Kultur negativ Candida glabrata Kultur negativ Chlamydia pneumoniae Kultur negativ Citrobacter freundii Kultur negativ Enterobacter cloacae Kultur negativ Enterococcus faecalis Kultur negativ Escherichia coli Kultur negativ Haemophilus influenza Kultur negativ Influenza A/Beijing AG für ELISA negativ Influenza A/Sydney AG für ELISA negativ Influenza B/Harbin AG für ELISA negativ Klebsiella pneumoniae Kultur negativ Mycoplasma pneumoniae AG für ELISA negativ Parainfluenzavirus AG für ELISA negativ Proteus mirabilis Kultur negativ Proteus vulgaris Kultur negativ RIDA QUICK Legionella

8 Pseudomonas aeruginosa Kultur negativ Respiratory-Syncytial-Virus AG für ELISA negativ Serratia liquefaciens Kultur negativ Serratia marcescens Kultur negativ Staphylococcus aureus Kultur positiv Staphylococcus epidermidis Kultur negativ Staphylococcus saprophyticus Kultur negativ Streptococcus agalactiae Kultur negativ Streptococcus pneumoniae Kultur negativ 13.4 Interferierende Substanzen Die nachfolgend aufgeführten Substanzen zeigten keinen Effekt auf die Testergebnisse, wenn sie in Legionella positive und negative Urinproben in den angegebenen Konzentrationen eingemischt wurden: Amoxicillin (Antibiotikum; 0,72% w/v), Levofloxacin (Antibiotikum; 0,15% w/v), Erythromycin (Antibiotikum; 0,06% w/v), Humanblut (10% v/v), Acetaminophen (Analgetikum; 1,08% w/v), Albumin (0,5% w/v), Hustensaft (0,25% v/v), Glukose (2,0% v/v), Ascorbinsäure (Vitamin C; 0,1% v/v), Bilirubin (0,02% v/v), Borsäure (0,26% w/v) Analytische Sensitivität Die analytische Sensitivität von RIDA QUICK Legionella wurde von 2 Operatoren in 2 Lots des Produktes durch die Testung einer Verdünnungsreihe auf ca. 6,0 ng Legionella-Antigen/ml eingegrenzt. Die Detektionsgrenze wurde durch 60 Messungen über 5 Tage in 2 Lots von 2 Operatoren mit 6,0ng/ml mit 100% positiven Ergebnissen bestätigt. RIDA QUICK Legionella

9 Anhang Testspezifische Symbole: Cassette Reagent A Reagent B Reagent vial Pipet Tip Testkassette Reagenz A Reagenz B Reaktionsgefäß Pipettenspitze Microlit Pipet Mikropipette 100 µl RIDA QUICK Legionella

10 Literatur 1. Howden B.P. et al.: Treatment and outcome of 104 hospitalized patients with Legionnaires disease. Internal Medicine Journal (2003) 33 (11): Benin A.L. et al.: An outbreak of travel-associated Legionnaires disease and Pontiac fever: the need for enhanced surveillance of travel-associated legionellosis in the United States. Journal of Infectious Diseases (2002) 185(2): Bartram et al. Legionella and the prevention of Legionellosis. (2012) World Health Organisation (WHO). 4. Joseph C. et al.: Surveillance of Legionnaires disease in Europe. Legionella, Washington DC, ASM Press. (2002) Berdal B.P. et al.: Detectionof Legionella pneumophila antigen in urine by enzyme-linked immunospecific assay. J Clin Microbiol (1979) 9: Kohler R.B. et al.: Onset and duration of urinary antigen excretion in Legionnaires disease. J Clin Microbiol (1984) 20: RIDA QUICK Legionella