Systemische Applikation von autologen Knochenmarkzellen bei Patienten mit Morbus Parkinson aktueller Stand

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1 Systemische Applikation von autologen Knochenmarkzellen bei Patienten mit Morbus Parkinson aktueller Stand Stellungnahme der Sprecher der Arbeitsgruppe Zellersatz und Regeneration der Deutschen Parkinson Gesellschaft e.v. (DPG) abgestimmt mit Prof. Ehninger, Geschäftführender Vorsitzender der Deutschen Gesellschaft für Hämatologie und Onkologie e.v. (DGHO) Johannes Schwarz1 und Alexander Storch2 1Klinik und Poliklinik für Neurologie, Universität Leipzig, Leipzig 2Klinik und Poliklinik für Neurologie, Technische Universität Dresden, Dresden Trotz vieler therapeutischer Optionen bleibt die Therapie des Morbus Parkinson vor allem in fortgeschrittenen Stadien schwierig. Regenerative Strategien, die zu einer Funktionsverbesserung der betroffenen Zellen oder deren Ersatz durch Fremdzellen umfassen, haben großes Potential hierbei gravierende Veränderungen herbeizuführen. Der Transplantation von Neuronen bei Morbus Parkinson liegt ein klar definierter biologischer Mechanismus zu Grunde: Die funktionelle Verbesserung durch Wiederherstellung der dopaminergen Übertragung im Striatum (Storch et al. 2003). Erste Transplantationsexperimente begannen Anfang der 70er Jahre, als neue immunzytochemische und bildgebende Methoden es ermöglichten, neuronale Transplantate zu untersuchen. Seit 1987, als die ersten klinischen Studien mit Neuronen des vorderen Mittelhirns aus menschlichen Embryonen begannen, wurden weltweit etwa 350 Patienten transplantiert. In zwei kontrollierten, doppelblinden klinischen Studien zeigte allerdings nur Stellungnahme zur autologen Knochenmarkstammzellapplikation beim Mb. Parkinson ein Teil der Patienten eine signifikante Verbesserung ihrer motorischen Funktion (Olanow et al. 2003), (Freed et al. 2001). Da auch Nebenwirkungen, wie medikamentenunabhängige Dyskinesien auftraten, wird die Transplantation von fetalem Mittelhirngewebe heute nicht mehr empfohlen. Auch die kürzlich berichtete kontrollierte doppelblinde klinische Studie zur intrastriatalen Transplantation von Levodopa-produzierenden retinalen Pigmentepithelzellen (RPE-Zellen; Spheramine ) konnte keine klinisch relevante Verbesserung der motorischen Funktion von Parkinson-Patienten gegenüber Plazebo zeigen. Es wird erwartet, dass die Stammzellbiologie für die eine entscheidende Wende in der regenerativen Therapie sorgen wird. Im Labor können bereits aus einer Vielzahl verschiedener Stamm- oder Progenitorzellen Zellen gewonnen werden, die viele Charakteristika dopaminerger Neuronen zeigen. Zunächst müssen wir verschiedene Stammzellen unterscheiden:

2 1. Embryonale Stammzellen (ES-Zellen) Diese werden aus der Blastozyste zum Zeitpunkt des 8-16-Zell-Stadiums gewonnen. Das Proliferationspotential dieser Zellen ist unter Zugabe spezifischer Faktoren nahezu unbegrenzt. ES-Zellen sind (wahrscheinlich) totipotent und können dementsprechend nicht nur in jeden Zelltyp des jeweiligen Organismus ausdifferenziert, sondern auch in funktionsfähige Organismen (Individuen) überführt werden. In der Mausgenetik werden diese Zellen benutzt, um Knock-out- oder Knock-in-Mäuse zu generieren. Neben dem unbegrenzten Teilungspotential haben ES-Zellen den Vorteil, dass sie sehr stabil sind und gut reproduzierbar ausdifferenziert werden können. Die therapeutische Nutzung der ES-Zellen ist allerdings wegen ethischer und biologischer Probleme zumindest in den kommenden Jahren wenig wahrscheinlich. ES-Zellen könnten missbraucht werden, um genetisch modifizierte Lebewesen zu erstellen ( reproduktives Klonen ). Daher muss die Forschung mit diesen Zellen strengen Auflagen unterliegen. Andererseits haben diese Zellen ein hohes Potential zur Entartung und nach Transplantation in Ratten wurden häufig Teratokarzinome beobachtet (Bjorklund et al. 2002). Im Tiermodell konnte mit ES-Zellen mehrfach ein Dopaminmangel erfolgreich behandelt werden. 2. Adulte/fetale Stammzellen (Vorläufer- oder Progenitorzellen). Dies sind Organbzw. Gewebe-spezifische Vorläuferzellen, die sowohl aus dem embryonalen/fetalen als auch aus adulten Geweben gewonnen werden können. Leider ist nicht nur das Proliferationspotential dieser Zellen begrenzt, sondern auch das Überleben solcher Zellen im Labor scheint begrenzt zu sein (Milosevic et al. 2004). Dennoch ist es möglich, eine Expansion dieser Stammzellen über viele Monate durchzuführen. Neurale Stammzellen differenzieren dabei ausschließlich in Neuronen oder Glia. Ein Missbrauch ist daher nicht möglich. Das Wachstum (Proliferation) ist wie bei den ES- Zellen von der Zugabe externer Faktoren, insbesondere Mitogenen, abhängig. Zellen aus fetalem Gewebe sind sehr viel potenter als Zellen aus dem adulten Gehirn. In Letzterem finden sich Stammzellen nur noch in den neurogenen Zonen und können wahrscheinlich nur in wenige Zelltypen ausdifferenzieren. Im Gegensatz dazu können die Stammzellen aus praktisch allen Teilen des fetalen Gehirns gewonnen werden. Diese Zellen können je nach Ursprung mit hoher Wahrscheinlichkeit auch in alle Nervenzellen der jeweiligen Region differenzieren. Diese Zellen sind ebenfalls schon erfolgreich im Tiermodell der Parkinson-Erkrankung eingesetzt worden, allerdings scheinen diese Ergebnisse variabler zu sein als bei der Verwendung von ES-Zellen. Wegen der guten Sicherheit und geringen ethischen Bedenken, ist der klinische Einsatz dieser Zellen eher denkbar.

3 3. Induzierte pluripotente Stammzellen (ips-zellen). In den vergangen Monaten haben die ips-zellen erhebliche Aufmerksamkeit in der Fach- aber auch der Boulevardpresse erhalten. Shinya Yamanaka gelang es als erstmals 4 Gene zu identifizieren, die adulte somatische Zellen (Haut- oder Leberzellen) in quasi-es- Zellen transformieren können (Aoi et al. 2008, Yamanaka 2008, Takahashi & Yamanaka 2006). Allerdings muss erwähnt werden, dass diese Gene auch Eigenschaften von Onkogenen besitzen und somit die generierten ips-zellen ebenfalls ein hohes Entartungspotential aufweisen. Dennoch bieten die ips-zellen enorme Möglichkeiten. Sollte das Entartungspotential durch eine partielle Reprogrammierung gebannt werden, könnten für jeden Patienten individuelle Ersatzorgane generiert werden. Schon heute können aber von allen Patienten solche Zelllinien angelegt werden, und somit die Entstehung von bisher unerklärten Erkrankungen (wie auch dem Morbus Parkinson) in der Zellkultur ( Reagenzglas ) simuliert werden. Dies sollte helfen, viele neue Krankheitsmechanismen zu erkennen. 4. Adulte mesenchymale Stammzellen. Stammzellen aus dem adulten Knochenmark bieten ebenfalls die Möglichkeit der autologen Transplantation. Dies bedeutet, dass diese Zellen einem Patienten selbst entnommen, und retransplantiert werden können, ohne dass Immunreaktionen zu befürchten sind. Sollte es also gelingen, aus diesen Zellen funktionale dopaminerge Neuronen zu generieren, hätten diese Zellen ein enormes therapeutisches Potential. Bereits im Jahre 2000 wurden erste Ergebnisse berichtet, die eine Transdifferenzierung solcher aus dem Knochenmark gewonnenen Zellen in Gehirnzellen zumindest in Mäusen berichtet (Brazelton et al. 2000). Grundsätzlich sind im Knochenmark zwei verschiedene Stammzellpopulationen vorhanden: Die hämatopoetischen Stammzellen und die mesenchymalen Stammzellen. Während die hämatopoetischen Stammzellen für die Blutbildung notwendig sind, können die mesenchymalen Stammzellen z. B. in Knorpel, Fettgewebe, Muskel oder Gefäße ausdifferenzieren. Beiden Stammzellpopulationen wurde aber in diesen frühen Arbeiten die Kapazität zugeschrieben, in Zellen des Gehirns (Neuronen, Glia) transdifferenzieren zu können. Wir selbst haben in einer frühen Arbeit solche Phänomene in der Zellkultur beschrieben (Hermann et al. 2004). Ob ein vergleichbares Potential auch im lebenden Tier nachgewiesen werden kann, ist sehr umstritten. Neuere Arbeiten legen nahe, dass die Möglichkeiten der Transdifferenzierung sehr begrenzt sind. Hämatopoetische Stammzellen scheinen praktisch kein Potential zu besitzen, in Neuronen oder Glia zu differenzieren (Roybon et al. 2006). Mesenchymale Stammzellen scheinen andererseits bereits spontan einige

4 neuronale Marker zu exprimieren (Deng et al. 2006). Aber auch bei diesen Zellen ist die Möglichkeit in Neuronen zu transdifferenzieren sehr begrenzt. Der Nachweis eines funktionalen Neuronen mit Generierung von Aktionspotentialen ist kürzlich mit dem von uns entwickelten Protokoll gelungen (Hermann et al. 2004, Fu et al. 2008, Hermann et al. 2006). Eine Differenzierung in neuronale Subtypen wie die dopaminergen Neuronen ist bisher nicht gelungen. In einer jüngsten Studie zur Knochenmarktransplantation konnte in einem Parkinson-Tiermodell ebenfalls keine in dopaminerge Neuronen transdifferenzierten Knochenmarkstammzellen beobachtet werden (Keshet et al. 2007). Insgesamt muss also die erfolgreiche Transdifferenzierung angezweifelt werden. Darüberhinaus stellt sich die Frage, ob solche Zellen im Gehirn auch zu anderen Zellen als Neuronen oder Glia ausdifferenzieren können. Hier fehlen entsprechende Daten. Zellen aus dem Knochenmark werden aber auch in vielen verschiedenen Tiermodellen und bei Patienten mit Myokardischämie untersucht. Nach lokaler Applikation von Knochenmarkzellen in die Herzkranzgefässe konnten diese Zellen erfolgreich im Herzmuskel wieder gefunden werden. Allerdings differenzierten diese Zellen entsprechend Ihrer Determination und bildeten Knochenmark statt Herzmuskel (Balsam et al. 2004, Murry et al. 2004). Eine solche Bildung von Knochenmark im Zielorgen (z. B. Gehirn) könnte kaum abschätzbare unerwünschte Wirkungen bei Patienten hervorrufen. Bezüglich der Transplantation von Knochenmark liegen langjährige Erfahrungen mit der autologen und allogenen Transplantation vor allem bei Patienten mit hämatologisch-onkologischen Erkrankungen vor. Insbesondere bei allogener Transplantation mit gegengeschlechtlichen Spendern konnte über die Analyse der Geschlechtschromosomen das Schicksal der transplantierten Zellen im Gehirn von verstorbenen Patienten untersucht werden. Sehr wenige dieser Zellen (~0.01 % aller Neurone) exprimieren neuronale Marker, was aber noch nicht als Nachweis eine funktionellen Neurons gewertet werden kann (Sostak et al. 2007). Zusätzlich traten solche Zellen nur in der Nähe von entzündlichen Infiltraten und bei einer Graft-versus- Host Reaktion auf. Zudem konnte in dieser Studie die Fusion von Spenderzellen mit den Neuronen des Patienten nicht ausgeschlossen werden. Auch wenn dieser Nachweis schwierig sein dürfte, scheint die angesprochene Fusion aber häufiger als eine Transdifferenzierung vorzukommen. Unabhängig von der Art der Zellen werden insgesamt nur extrem wenige transplantierte oder fusionierte Zellen im Gehirn gefunden, so dass eine Wirkung dieser Zellen auf den Krankheitsverlauf oder die Symptomatik einer neurologischen Erkrankung nach derzeitigem Kenntnisstand sehr unwahrscheinlich ist.

5 Indirekte Effekte einer Knochenmarkstransplantation auf dopaminergen Neuronen konnten in einer jüngeren Arbeit nachgewiesen werden (Keshet et al. 2007). Diese Effekte werden auf die immunsuppressive Wirkung dieser Therapie zurück geführt (Details siehe unten). Neben der Transplantation und dem Ersatz der verlorenen Zellen steht aber auch die Regeneration der erkrankten Zellen im Zentrum der Forschung. Damit ist eine endogene, d.h. aus dem adulten Gehirn bzw. dort vorhandener Stamm- oder Vorläuferzellen heraus entstehende Regeneration der dopaminergen Nervenzellen beim Morbus Parkinson gemeint. Ausführliche wissenschaftliche Arbeiten der letzten Jahre haben jedoch gezeigt, dass eine spontane Regeneration im dopaminergen System des erwachsenen Gehirn in Säugetiermodellen des Morbus Parkinson und auch beim Morbus Parkinson selbst nicht auftritt. Auch eine exogene, z.b. pharmakologische Stimulation einer solchen endogenen Regeneration erscheint gerade im dopaminergen System aufgrund der derzeitigen Datenlage nur sehr schwer möglich und ist in den nächsten Jahren bzw. Jahrzehnten in der klinischen Anwendung mit an Sicherheit grenzender Wahrscheinlichkeit nicht zu erwarten. Es wird jedoch spekuliert, dass systemisch applizierte Stammzellen eher protektive oder antiinflammatorische Effekte ausüben als eine Restauration zu bewirken. Beim Morbus Parkinson werden seit langer Zeit immunologische Mechanismen für die Neurodegeneration der dopaminergen Nervenzellen diskutiert. Diese könnten durch eine solche Stammzellbehandlung moduliert werden. Z.B. zeigt eine allogene Knochenmarktransplantation nach letaler Bestrahlung des Knochenmarks (vergleichbar einer Behandlung bei Leukämien) positive Effekte auf dopaminerge Neuronen in einem Parkinson- Modell (Keshet et al. 2007). Die Effekte sind nach heutigem Kenntnisstand am ehesten auf immunsuppressive Effekte zurückzuführen. Trophische Effekte der transplantierten Stammzellen sind jedoch auch möglich. Eine solche Knochenmarktransplantation zur Behandlung des Morbus Parkinson ist natürlich derzeit aufgrund der bekannten Komplikationen obsolet. Diese Studien dienen vielmehr der Konzeptbildung für die Pathogenese der Erkrankung und möglicher Auswirkungen einer immunsuppressiven Therapie auf den Krankheitsverlauf. Zusammenfassung Die Therapie neurologischer Erkrankungen mit Stammzellen aus dem Knochenmark kann nach heutigem Wissensstand keine Restauration der geschädigten Zellen im Gehirn bewirken. Eine Differenzierung in Knochenmarkzellen ist auch bei Einnistung in das Gehirn denkbar. Indirekte Effekte z. B. durch eine Modulation des Immunsystems werden angenommen, sind aber nicht ausreichend untersucht und können einen Einsatz von

6 autologen Stammzellen aus dem Knochenmark bei Patienten mit Morbus Parkinson außerhalb von kontrollierten klinischen Studien nicht rechtfertigen. Diese Sichtweise wird auch durch die aktuellen Richtlinien ( Guidelines for the Clinical Translation of Stem Cells ) der Internationalen Gesellschaft für Stammzellforschung ( International Society for Stem Cell Research ; gestützt. Literatur Aoi, T., Yae, K., Nakagawa, M., Ichisaka, T., Okita, K., Takahashi, K., Chiba, T. and Yamanaka, S. (2008) Generation of Pluripotent Stem Cells from Adult Mouse Liver and Stomach Cells. Science. Balsam, L. B., Wagers, A. J., Christensen, J. L., Kofidis, T., Weissman, I. L. and Robbins, R. C. (2004) Haematopoietic stem cells adopt mature haematopoietic fates in ischaemic myocardium. Nature, 428, Bjorklund, L. M., Sanchez-Pernaute, R., Chung, S. et al. (2002) Embryonic stem cells develop into functional dopaminergic neurons after transplantation in a Parkinson rat model. Proc Natl Acad Sci U S A, 99, Brazelton, T. R., Rossi, F. M., Keshet, G. I. and Blau, H. M. (2000) From marrow to brain: expression of neuronal phenotypes in adult mice. Science, 290, Deng, J., Petersen, B. E., Steindler, D. A., Jorgensen, M. L. and Laywell, E. D. (2006) Mesenchymal stem cells spontaneously express neural proteins in culture and are neurogenic after transplantation. Stem Cells, 24, Freed, C. R., Greene, P. E., Breeze, R. E. et al. (2001) Transplantation of embryonic dopamine neurons for severe Parkinson's disease. N Engl J Med, 344, Fu, L., Zhu, L., Huang, Y., Lee, T. D., Forman, S. J. and Shih, C. C. (2008) Derivation of neural stem cells from mesenchymal stemcells: evidence for a bipotential stem cell population. Stem Cells Dev, 17, Hermann, A., Gastl, R., Liebau, S. et al. (2004) Efficient generation of neural stem cell-like cells from adult human bone marrow stromal cells. J Cell Sci, 117, Hermann, A., Liebau, S., Gastl, R., Fickert, S., Habisch, H. J., Fiedler, J., Schwarz, J., Brenner, R. and Storch, A. (2006) Comparative analysis of neuroectodermal differentiation capacity of human bone marrow stromal cells using various conversion protocols. J Neurosci Res, 83, Keshet, G. I., Tolwani, R. J., Trejo, A., Kraft, P., Doyonnas, R., Clayberger, C., Weimann, J. M. and Blau, H. M. (2007) Increased host neuronal survival and motor function in BMT Parkinsonian mice: involvement of immunosuppression. J Comp Neurol, 504, Milosevic, J., Storch, A. and Schwarz, J. (2004) Spontaneous apoptosis in murine free-floating neurospheres. Exp Cell Res, 294, Murry, C. E., Soonpaa, M. H., Reinecke, H. et al. (2004) Haematopoietic stem cells do not transdifferentiate into cardiac myocytes in myocardial infarcts. Nature, 428,

7 Olanow, C. W., Goetz, C. G., Kordower, J. H. et al. (2003) A double-blind controlled trial of bilateral fetal nigral transplantation in Parkinson's disease. Ann Neurol, 54, Roybon, L., Ma, Z., Asztely, F., Fosum, A., Jacobsen, S. E., Brundin, P. and Li, J. Y. (2006) Failure of transdifferentiation of adult hematopoietic stem cells into neurons. Stem Cells, 24, Sostak, P., Theil, D., Stepp, H., Roeber, S., Kretzschmar, H. A. and Straube, A. (2007) Detection of bone marrow-derived cells expressing a neural phenotype in the human brain. J Neuropathol Exp Neurol, 66, Storch, A., Lester, H. A., Boehm, B. O. and Schwarz, J. (2003) Functional characterization of dopaminergic neurons derived from rodent mesencephalic progenitor cells. J Chem Neuroanat, 26, Takahashi, K. and Yamanaka, S. (2006) Induction of pluripotent stem cells from mouse embryonic and adult fibroblast cultures by defined factors. Cell, 126, Yamanaka, S. (2008) Induction of pluripotent stem cells from mouse fibroblasts by four transcription factors. Cell proliferation, 41 Suppl 1,