Katalytische Enzym-Konzentration

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1 Institut für Mikrobiologie, Immunologie und Krankenhaushygiene Städtisches Klinikum Braunschweig ggmbh Teil 1 (11:00-11:40 Uhr) LEBERDIAGNOSTIK I & Teil 2 (11:50-12:30 Uhr) Therapeutisches Drug Monitoring MHH Katalytische Enzym-Konzentration Substrat (Art, Konzentration) Kofaktoren (Art, Konzentration) Kofaktoren (Art, Konzentration) In Puffer In-house (Art, Methoden Konzentration) Konventionelle Temperatur Standardmethoden Optimierte ph-wert Standardmethoden der DGKC IFCC Hilfs-, IFCC-Methoden, Indikatorreaktion (International Federation of Clinical and Laboratory Medicine) Wellenlänge nge der Messstrahlung Probe-,, Endvolumen U/l x = µkat/l linical Chemistry

2 Messung im Fließgleichgewicht Michaeliskonstante Auswertung der Enzymkinetik t [min] 4 Start der Reaktion E [S] >> K m [E] v max 3 t 2 α Tangens (α)( ) = E/ t 1 Ausgangswert Ext.

3 Ermittlung der Reaktionsgeschwindigkeit Absorptions-Zeit Zeit-Kurve Kontinuierliche Aufzeichnung Diskontinuierliche Aufzeichnung Zweipunktkinetik (z.b. gestoppter Test) Ggf. Leerwert-Reaktion γgt (Aminosäure ure-γ -Glutamytransferase,, EC ) Chromogenes Substrat (5-Amino Amino-2-Nitrobenzoat, Absorptionszunahme) AP Chromogenes Substrat (4-Nitrophenolat Nitrophenolat,, Absorptionszunahme) GLDH Einfacher optischer Test (NADH, Absorptionsabnahme) ALT Gekoppelter optischer Test (NADH, Absorptionsabnahme) AST Gekoppelter optischer Test (NADH, Absorptionsabnahme)

4 Messung der ALT: gekoppelter optischer Test ALT Alanin + 2-Oxoglutarat 2 Pyruvat Pyruvat + Glutamat Messreaktion LD Pyruvat + NADH + H + Lactat + NAD + Indikatorreaktion Messung der LD: einfacher optischer Test Reaktionsablauf bei der Bestimmung der ALT

5 Isoenzyme Isoenzyme sind gekennzeichnet durch gleiche Substrat-Spezifit Spezifität gleiche enzymatische Wirkung verschiedene Gene unterschiedliche Primärstruktur rstruktur unterschiedliches physikochemisches Verhalten

6 Multiple Formen von Enzymen Isoenzyme Genetisch unabhängige ngige Enzyme verschiedener Gene Verschiedene Allele eines Gens (Allelozyme( Allelozyme) Heteropolymere (Hybride) Alloenzyme Unterschiede im Nicht-Proteinanteil (Kohlenhydrat) Spaltung eines Proenzyms an verschiedenen Stellen Polymere aus identischen Untereinheiten Unterschiedliche räumliche r Anordnung Komplexbildung mit Immunglobulinen Klinische Konsequenzen nicht erkannter Makroenzyme Makro-Amylase Röntgenuntersuchungen, Szintigramme, Sonographien, Gastroskopien, u.a. Makro-AST Leberbiopsien Makro-AP Makro-SP Prostata-Biopsien, Antiandrogen-Therapie

7 Verfahren zur Isoenzymbestimmung Elektrophoretische Trennung Chromatographie Immuninhibition Isoenzymspezifische Substrate Selektive Inhibition Thermische Inaktivierung Immunologische Massen-Bestimmung CK, AP Makroamylase CK, Amylase LDH SP, Amylase AP CK, AP AP-Aktivitäten Isoenzyme der im Alkalischen Serum Phosphatase Plazentare AP Intestinale AP Gesamtaktivität ( 100 %) Unspezifische AP Leberfraktion ( 50 %) Knochenfraktion ( 70 %) Intestinalfraktion Niere ( 20 %) Keimzellvariante

8 Erhöhte Aktivität der Alkalischen Phosphatase Knochenumbauprozesse M. Paget Skelettmetastasen, Primärtumoren rtumoren Rachitis, Osteomalazie (Frakturen, Hyperparathyreoidismus) NICHT bei Osteoporose, Zysten, Myelom Hepato-bili biliäre Prozesse Intra- und extrahepatische Gallengangsprozesse Hepatitis, Zirrhose Lebertumoren Andere Karzinome, Kollagenosen (Amyloidose), Medikamente Ursachen für erhöhte Aktivitäten der Gamma-Glutamytransferase im Serum Hepato-bili biliäre Prozesse Intra- und extrahepatische Gallengangsverschlüsse sse Lebermetastasen und tumoren Hepatitis, Zirrhose (Alkohol) Andere Alkohol Medikamente (Enzyminduktion) Diabetes mellitus, Hypertonie, koronare Herzkrankheit

9 Charakteristische Organ-Muster? Relative Enzym-Konzentrationen der Organe AP GLDH ALT AST [%] Duodenum Knochen Pankreas Lunge Gehirn Niere Herz Muskel Leber

10 Leber Lokalisation & Organspezifität AST ALT GLDH Lokalisation & Organspezifität AST Mitochondrien (70%), Zytoplasma (30%) ALT Zytoplasma GLDH Mitochondrien-Matrix, Matrix, zentrolobulär γgt AP Zellmembran Zellmembran-gebunden, löslichl Herz, Leber, Muskel Thrombozyten Leber Leber Leber Leber, Knochen, Plazenta, (Tumor)

11 Hohe GLDH-Aktivität Leberdystrophie Hepatitis Lebermetastasen Verschlussikterus Abstoßungsreaktion Hypoxische Leberschäden (Rechtsherzversagen, resp. Insuffzienz, Kreislaufversagen) Halbwertzeit [h] CHE AP LDH 1 GGT ALT GLDH Amylase AST CK Lipase LDH 5

12 Akute Virushepatitis Alkoholhepatitis

13 Chronische Hepatitis, Zirrhose

14 Verschlussikterus Toxische Leberschäden: Beispiele

15 Herzinfarkt

16 Schock

17 Schock vs. Leberstauung vs. Herz-Kreislauf Kreislauf- Insuffizienz Zusammenfassung: Klinisch-chemische chemische Diagnostik bei V.a. Lebererkrankung Screening ALT Leberzellschädigung γ-gt Gallengangsbeteiligung CHE Synthesekapazität Weiterführende Diagnostik AST, GLDH, AP, Bilirubin, Albumin, Gerinnungsfaktoren, etc.

18 10 min Pause Teil 2: Therapeutisches Drug Monitoring (TDM) Bestimmung der Serumkonzentration verschiedener Pharmaka, die zu therapeutischen Zwecken eingesetzt wird

19 Allgemeine Auswahlkriterien zum TDM hohes Wirkpotential, gefährliche Toxizität enger therapeutischer Bereich, steile Dosis-Wirkungskurve keine definierte (biologische) Zielgröße (RR, Quick, Glucose) hohe (biologische) Variabilität der Pharmakokinetik nicht-lineare Pharmakokinetik prophylaktische Anwendung (Asthma, Epilepsie) Compliance Kontrolle Zuverlässige Nachweisverfahren

20 Proteinbindung Albumin sauresα1-glykoprotein Lipoproteine Freie Konzentration Freie Fraktion

21 Pharmakokinetik & Pharmakodynamik Faktoren, die die Wirkung von Digoxin beeinflussen Pharmakokinetik (Absorption, Verteilung, Clearance) Bioverfügbarkeit Aufsättigungskinetik Verstärkung der Wirkung Hypokaliämie Pharmakodynamik Hypomagnesiämie (pharmakologischer Effekt) Hyperkalzämie Begriffe: Hypothyreose Therapeutische Breite Therapeutischer Bereich Myokardiale Ischämie Störungen des Säure-Basen-Haushalts etc. Therapeutischer Bereich: empirisch

22 Erreichen des Plateauwertes Gleichgewichtskonzentration Digoxin Digitoxin Phenytoin Phenobarbital Gentamicin Vancomycin Salizylsäure Halbwertzeit [h] Zeit bis Steady State [d]

23 Verteilungs- und Eliminationsphase K = / t 1/2 linear Halblogarithmisch Kinetik 1.Ordnung Zusammenhang: Dosis vs. Konzentration

24 Beispiel: Ethylalkohol Lineare Auftragung (Reaktion 0. Ordnung) Reaktion 0. Ordnung Ethanol: bis 20 mg/dl = 200 mg/l = 0.2 g/l 0.2 /oo Reaktion erster Ordnung ab >0.2 /oo Reaktion nullter Ordnung Männer: 16 (10-25) mg/dl/h Frauen: 10-20% niedriger Bei Werten über 3.0 /oo ergeben sich durch Aktivierung eines zweiten, induzierbaren Abbauweges in der Leber unvorhersehbare Abbauraten.

25 Biologische Variabilität: CL, Vd Zunahme des Verteilungsraums für f Aminoglykoside bei kritisch Kranken

26 Verfahren zur Dosisvorhersage Empirische Verahren Nomogramme Tabellen Einfache pharmakokinetische Methoden Ein-Punkt Punkt-Methoden Zwei-Punkt Punkt-Methoden Drei-Punkt Punkt-Methoden Bayes-Verfahren Theophyllin-Nomogramm

27 Regeln für die Blutabnahme bei der Anforderung von Pharmakaspiegel Dauertherapie Im Steady-State, State, d.h. nach 4-55 Halbwertzeiten abnehmen Intravenöse Gabe Nach der Verteilungsphase abnehmen, d.h. ca h nach Beendigung der Infusion. Ausnahmen Digoxin/Digitoxin Digitoxin: : h Messung der maximalen Plasmakonzentration Zeit ist vom Pharmakon abhängig ( h) Messung der minimalen Plasmakonzentration In der Regel vor der nächsten n Einnahme TDM in der Praxis

28 TDM in der Praxis Digoxin therapeutic drug monitoring: : an audit and review Sidwell et al. 2003, N Z Med J 116:U708 53% der Messungen ohne klare Indikation 32% der Messungen innerhalb der Verteilungsphase 19% der Messungen nicht im steady state 5% der Messungen resultierten in falschen Konsequenzen In 29% der Fälle F korrekte Indikation, Probennahme,, Interpretation Danke für die Aufmerksamkeit!