K3: Bestimmung der Michaelis-Menten-Kinetik von Urease

Transkript

1 K3: Bestimmung der Michaelis-Menten-Kinetik von Urease Einleitung: In diesem Versuch soll die Umsetzung von Harnstoff durch das Enzym Urease beobachtet werden. Fast alle Enzyme sind Proteine, manche bestehen auch aus katalytischer RNA. Sie werden für den Zellstoffwechsel benötigt und ihre Aktivität ist stark vom vorherrschenden ph-wert als auch der Temperatur abhängig. Enzyme sind Biokatalysatoren, sie binden Substrate im aktiven Zentrum; durch die Ausbildung von intermolekularen Anziehungskräften (H-Brücken, Ionische Wechselwirkungen etc.) bildet sich ein Enzym-Substrat-Komplex, dadurch wird die Aktivierungsenergie der Reaktion herab gesetzt. Nach Ablauf der Reaktion werden die Produkte aus dem aktiven Zentrum entlassen. Das Enzym liegt dann wieder frei vor, es wird nicht verbraucht! Des Weiteren haben Enzyme keinen Einfluss auf das Reaktionsgleichgewicht, sie beschleunigen lediglich die Einstellung dieses Gleichgewichts! Urease Urease ist ein nickelhaltiges Enzym, das die Hydrolyse von Harnstoff in CO 2 und Ammoniak katalysiert. In wässriger Lösung bilden diese Produkte Ionen, deren Konzentrationen sich mittels Leitfähigkeitsmessung bestimmen lassen. Urease wurde erstmals aus Schwertbohnen extrahiert und war eines der ersten Enzyme, die bereits 1930 kristallisiert werden konnten. Das Enzym taucht in der Bruttoreaktionsgleichung (Schema 1) zwar nicht auf, jedoch ist die Reaktionsgeschwindigkeit stark von der Enzymkonzentration abhängig. Schema 1: Bruttoreaktionsgleichung Die Michaelis-Menten-Gleichung (1) beschreibt die Abhängigkeit der Reaktionsgeschwindigkeit v von der Konzentration des Enzyms und der Substratkonzentration [S]. Bei einer enzymatischen Reaktion nimmt die Reaktionsgeschwindigkeit durch den Verbrauch des Substrats allmählich ab, bis sich ein Gleichgewicht zwischen Hin- und Rückreaktion einstellt oder die Reaktion selbst zum Erliegen kommt. S e i t e 1

2 ( ) (1) v 0 : Reaktionsgeschwindigkeit zum Zeitpunkt t = 0; v max : Maximale Reaktionsgeschwindigkeit; [P]: Produktkonzentration; [S]: Substratkonzentration; K M : Michaeliskonstante Die Michaeliskonstante K M ist definiert als die Substratkonzentration, bei der die Reaktionsgeschwindigkeit v der halbmaximalen Reaktionsgeschwindigkeit entspricht. v 0 beschreibt die Anfangsgeschwindigkeit der Umsetzung für eine bestimmte Substratkonzentration und entspricht der gebildeten Produktmenge pro Zeiteinheit zum Zeitpunkt t = 0. v max beschreibt die maximal erreichbare Reaktionsgeschwindigkeit. Schema 2 zeigt die Umsetzung von Harnstoff durch Urease; zu Beginn liegen Enzym und Substrat frei vor, sie bilden einen Enzym-Substrat-Komplex (ES) mit der Geschwindigkeitskonstante k 1. Dabei handelt es sich um eine Gleichgewichtsreaktion, da auch die Rückreaktion, d.h. der Zerfall des Komplexes, mit der Geschwindigkeitskonstante k -1 möglich ist. Im geschwindigkeitsbestimmenden, zweiten Schritt wird mit der Geschwindigkeitskonstante k 2 der Harnstoff zu den Produkten umgesetzt, dieser Schritt ist nicht reversibel! Letztendlich werden die Produkte (P; Ammoniak und CO 2 ) freigesetzt und das Enzym liegt nach Ablauf der Reaktion wieder in seiner Ausgansform vor. Schema 2: enzymatische Umsetzung von Harnstoff Durch graphische Auftragung der Reaktionsgeschwindigkeit v gegen die Substratkonzentration [S] entsteht ein typisches Michaelis-Menten-Diagramm. Aus diesem lassen sich v max und v ma jedoch nur grob abschätzen, da es sich um eine Sättigungskurve handelt (Abb. 1: ). Die Michaelis-Konstante K M ist ein Maß für die Affinität des Enzyms zum Substrat. Ein kleiner K M -Wert ist ein Zeichen für eine hohe Affinität zwischen Enzym und Substrat und die halbe Maximal-geschwindigkeit wird schon bei einer niedrigen Substratkonzentration erreichet. S e i t e 2

3 Abb. 1: Michaelis-Menten-Diagramm. Im Bereich der Sättigung hat das Enzym seine maximal mögliche Umsatzgeschwindigkeit erreicht, d.h. diese lässt sich auch durch weitere Zugabe von Substrat nicht mehr steigern. Mathematisch gesehen bedeutet dies, dass sich die Kurve asymptotisch an v max annähert. Lineweaver-Burk-Plot Zur genaueren Auswertung der Versuchsergebnisse wird von Gleichung (1) der Kehrwert gebildet. Es resultiert die Lineweaver-Burk-Gleichung (Gleichung (2)). Hierbei handelt es sich um eine Geradengleichung und durch graphische Auftragung von v gegen lassen sich v max und K M mittels linearer Regression ermitteln (Abb. 2). ( ) (2) (3) S e i t e 3

4 Abb. 2: Lineweaver-Burk-Plot. v max lässt sich nun aus dem Schnittpunkt der Gerade mit der y-achse (b) berechnen (Gleichung (4)). Zur Bestimmung von K M gibt es zwei unterschiedliche Verfahren. Eine Möglichkeit ist die Berechnung aus dem Schnittpunkt der Gerade mit der x-achse (Schnittpunkt mit der x-achse; Gleichung (5)). Es ist jedoch auch möglich K M aus der Steigung (m) der Geraden zu berechnen (Gleichung (6)). (4) (5) (6) S e i t e 4

5 Versuchsdurchführung: Versuchslösungen vorbereiten: Man stellt eine Verdünnungsreihe aus einer Harnstofflösung frisch her. Hierfür wird zuerst eine 0.4 %-ige Stammlösung (w/v) hergestellt: In einen sauberen 100 ml Messkolben werden. Der Feststoff sollte sich vollständig lösen und keine chlieren mehr bilden. Tipp: Den Harnstoff in ein kleines Becherglas einwiegen, in wenig destilliertem Wasser lösen und in den Messkolben überführen. Das Becherglas zweimal mit wenig destilliertem Wasser nachspülen, um möglichst wenig Harnstoff zu verlieren. Anschließend den Messkolben auf 100 ml auffüllen. Im nächsten Schritt wird eine Verdünnungsreihe nach folgendem Schema hergestellt: Mit einer Vollpipette werden 50 ml der 0.4 %-igen Lösung aus dem Messkolben entnommen und in einen weiteren 100 ml Messkolben überführt. Dieser wird mit destilliertem Wasser bis zur Eichmarke aufgefüllt, es ergibt sich eine 0.2 %-ige Lösung. Nach dem gleichen Prinzip wird fortgefahren und es werden weitere Verdünnungen mit den Konzentrationen 0.1 %, 0.05 %, % und % hergestellt. Der Versuchsaufbau und die Durchführung: Abb. 3: Der Versuchsaufbau. S e i t e 5

6 - Elektrode vom Assistenten aushändigen lassen - Elektrode mit der Messeinheit verbinden und mit der Halterung befestigen - Cobra3-Measure Programm in Windows starten - auf <Datei><neue Messung erstellen> gehen - Messparameter mit dem Anhang vergleichen - auf <weiter> klicken - mit Hilfe der 20 ml Vollpipette insgesamt 40 ml Lösung der geringsten Konzentration (0,0125%ige Harnstoff Lösung) entnehmen und in ein 50 ml Becherglas füllen - einen kleinen Rührfisch in das Glas geben und den Magnetrührer einschalten (max. mittlere Einstellung, falls ihr später im Leitfähigkeits-Zeitdiagramm keine ansteigende Linie sondern eine eher zackige Kurve seht, ist die Rührergeschwindigkeit zu hoch gewählt) - Elektrode in die Halterung stecken - Der Rührer darf die Elektrode nicht berühren und soll nur mit der Spitze in die Lösung eintauchen! - 50 μl Urease Lösung mit der Mikroliterpipette hinzufügen (Vorsicht, die Urease ist ziemlich zähflüssig, auf 50 μl aufziehen und warten bis Flüssigkeit nachzieht) und sofort die Messung starten (auf <Messung starten> klicken) - Am Ende der Messung sollen die Daten mit <Datei> <Messung speichern unter> in dem Ordner: Michaelis Menten/GruppeXX/0,0125.mrs gespeichert werden (XX ist die entsprechende Gruppennummer) - Die Lösung in einen Abfallbehälter schütten, den Erlenmeyerkolben, die Vollpipette, den Rührfisch und die Elektrode vorsichtig mit destilliertem Wasser reinigen und eventuell mit einem Papiertuch trocknen - analog für die restlichen Konzentrationen vorgehen (als nächstes 0,025 %-ig.) - Am Ende auch die Mikroliterspritze mehrmals mit dest. Wasser spülen - Elektrode beim Assistenten abgeben - Am Ende sämtliche Kolben mit destilliertem Wasser reinigen und die Urease in den Kühlschrank zurückstellen!!! S e i t e 6

7 Auswertung: Das Messprogramm erstellt ein Leitfähigkeitsdiagramm gegen die Zeit. Für die Auswertung wird nur die Steigung dieses Diagramms benötigt. Hierzu wird nach der Messung das Survey Tool verwendet. Man erhält ein Viereck, dessen Ecken jeweils bei 100 s und 200 s auf der Kurve stehen sollten. Somit entspricht Δ genau 00 s. Das Programm bestimmt dann automatisch Δy (siehe Anhang). Um auf die Reaktionsgeschwindigkeit (entspricht der Steigung Δy/Δ ) zu kommen, wird der Δy durch 100 s (= Δ ) geteilt. Man erstellt eine Tabelle (vier Spalten) mit der Konzentration in %, der Konzentration in mmol/l und der in Cobra3 ausgewerteten Steigung in μs*c -1 sowie der umgerechneten Reaktionsgeschwindigkeit v in μs*c -1 *s -1. Um die Konzentration in % in die Konzentration in mmol/l umzurechnen, wird Formel (7) verwendet. 0000) M (7) W = Konzentration in %; M = molare Masse von Harnstoff (60,06 g/mol) Nun wird ein Michaelis-Menten Diagramm erstellt (Reaktionsgeschwindigkeit (y-achse) gegen Substratkonzentration (x-achse) auftragen). Dieses Diagramm wird mithilfe von Nonlinear Fit, dort den Unterpunkt Growth/Sigmoidal -> und mit der Michaelis-Menten Fitfuktion gefittet. Bei den Parameter muss man einmal auf Bis fit konvergiert klicken um den besten Fit zu erreichen. Die Tabelle wird nun um zwei Spalten für und erweitert. Ein Lineweaver-Burk-Plot wird erstellt; anhand des Graphen werden v max v sowie K M bestimmt (zur Berechnung siehe Gleichung (2),(4), (5),(6)). Dieser Plot wird nun linear gefittet und wie in der Theorie beschrieben K m und v max bestimmt. Im Protokoll sollen beide Graphen beschrieben und die jeweils erhaltenen K m und v max diskutiert, sowie die unterschiede zwischen beiden Diagrammen genau beschrieben werden. S e i t e 7

8 Anhang: Auswertungstool Gesuchter Wert Einstellungen: S e i t e 8

9 S e i t e 9