Der Einfluss von Pioglitazon auf den Lipoproteinstoffwechsel bei Patienten mit arterieller Hypertonie und normalem Glukose-Haushalt

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1 Aus dem Institut für Klinische Chemie der Albert-Ludwigs-Universität Freiburg i. Br. Der Einfluss von Pioglitazon auf den Lipoproteinstoffwechsel bei Patienten mit arterieller Hypertonie und normalem Glukose-Haushalt I N A U G U R A L D I S S E R T A T I O N zur Erlangung des Medizinischen Doktorgrades der Medizinischen Fakultät der Albert-Ludwigs-Universität Freiburg i. Br. Vorgelegt 2005 von Ramadan Destani geboren in Stolberg

2 Dekan: Prof. Dr. med. Josef Zentner 1. Gutachter : PD Dr. med. Karl Winkler 2. Gutachter : PD Dr. med. Stephan Sorichter Jahr der Promotion: 2005

3 Meinen Eltern gewidmet

4 Lebenslauf Ramadan Destani, geboren am 08. Mai 1974 in Stolberg. Schulbildung Grundschule Reichertsberg, Trier Friedrich-Spee-Gymnasium, Trier Abschluss: Allgemeine Hochschulreife Studium April März 1998 März 1997 April März 2004 März 1999 März 2003 April März 2004 Mai 2004 Studium der Humanmedizin/ Johannes-Gutenberg-Universität Mainz Ärztliche Vorprüfung Studium der Humanmedizin/ Albert-Ludwigs-Universität Freiburg 1. Staatsexamen 2. Staatsexamen Praktisches Jahr 1. Tertial: Innere Medizin/ Klinikum Lahr 2. Tertial: Gynäkologie/ Klinikum Lahr 3. Tertial: Chirurgie/ Centre Hospitalier Universitaire (CHU) de Tours, Frankreich 3. Staatsexamen Famulaturen: Aug März 2000 Aug Sept Famulatur Chirurgie/ Marienkrankenhaus Trier Famulatur Allgemeinmedizin/ Dr. Emurlai, Tetovo, Mazedonien Famulatur Chirurgie/ Medizinisches Zentrum Tetovo, Mazedonien Mai 2001 Beginn der Dissertation am Institut für Klinische Chemie bei Herrn PD Dr. med. Karl Winkler

5 Teile dieser Arbeit wurden veröffentlicht in: Winkler K, Konrad T, Füllert S, Friedrich I, Destani R, Baumstark MW, Krebs K, Wieland H, März W (2003): Pioglitazone reduces atherogenic dense LDL particles in nondiabetic patients with arterial hypertension. Diabetes Care 26:

6 Verzeichnis der Abkürzungen ABC1 ATP-binding cassette transporter ALP Atherogener Lipoprotein-Phänotyp AP Alkalische Phosphatase Apo Apolipoprotein BMI Body mass index (Körpermassenindex) = Körpergewicht / (Körpergröße) 2 [kg/m 2 ] CE Cholesterinester CETP Cholesterin-Ester-Transfer-Protein CH Cholesterin CK Creatinkinase DBP diastolischer Blutdruck EDRF Endothelium derived relaxing factor EDTA Ethylendiamintetraacetate (Aethylendiamintetraessigsäure) EMM Estimated marginal mean FC Freies (unverestertes) Cholesterin FDA Federal Drug Administration FFS Freie Fettsäuren GLM General linear model γ-gt γ-glutamyl-transferase HDL High density lipoprotein HTGL Hepatische Triglyzeridlipase IDL Intermediate density lipoprotein KHK Koronare Herzkrankheit LCAT Lezithin-Cholesterin-Azyltransferase LDH Laktat-Dehydrogenase LDL Low density lipoprotein LPL Lipoproteinlipase PL Phospholipide PPAR Peroxisom Proliferator-aktivierter Rezeptor PR Protein RR Blutdruckmessung nach der Methode von Riva-Rocci [mmhg]

7 SBP SD SEM S-GOT S-GPT TG TZD U VLDL WHO Systolischer Blutdruck Standard deviation (Standardabweichung) Standard error of the mean Serum-Glutamat-Oxalacetat-Transaminase Serum-Glutamat-Pyruvat-Transaminase Triglyzeride Thiazolidindion Unit(s) (Einheit(en)) Very low density lipoprotein World Health Organisation

8 1. Einleitung Fettstoffwechsel Plasmalipide Lipoproteine Apolipoproteine Stoffwechsel der Plasmalipoproteine Atherosklerose ApoB-enthaltende Lipoproteine und Atherosklerose ApoA-enthaltende Lipoproteine und Atherosklerose Atherosklerose bei Diabetes mellitus Typ 2-Patienten Pioglitazon, ein neues orales Antidiabetikum in der Therapie von Diabetes mellitus Typ Die Wirkung von Pioglitazon auf den Lipid-Stoffwechsel bei nicht-diabetischen Patienten mit arterieller Hypertonie Material und Methoden Patienten und Studienprotokoll Studienparameter Probanden Studienablauf Analytische Techniken Lipoproteinseparation mittels Ultrazentrifugation Verwendete Materialien bei der Lipoproteinbestimmung Mittlerer LDL-Durchmesser Mittlere LDL-Dichte Statistische Analyse Ergebnisse Probanden... 30

9 3.2 Blutglukosekontrolle vor und während Behandlung mit Pioglitazon bzw. Placebo Blutbild Lipidparameter und Apolipoproteine Diskussion Blutglukose und Insulin Blutbild Lipoproteine und Apolipoproteine Zusammenfassung Verzeichnis der Tabellen und Abbildungen Tabellen Abbildungen Literaturverzeichnis Anhang der Originalarbeit... 53

10 1. Einleitung 1.1 Fettstoffwechsel Plasmalipide Die im Plasma vorkommenden Lipide sind mehr oder weniger schlecht wasserlöslich. Sie lassen sich in völlig unpolare Neutralfette und gut wasserlösliche polare Lipide wie Phospholipide einteilen (Tabelle 1) (Kostner et al. 1995). Tabelle 1: Plasmalipide und ihre Funktionen (Kostner et al. 1995) Lipide Neutrallipide Glyzeride (Mono-,Di-,Triglyzeride) Cholesterinester Polare Lipide Phospholipide (z.b. Lezithin, Sphingomyelin) Unverestertes Cholesterin Freie Fettsäuren Vitamine Funktionen Energieversorgung Transportform des Cholesterin Lösungsvermittler, Oberflächenlipide Baustein von Zellmembranen, metabolische Vorstufe von Gallensäuren und Steroidhormonen Bausteine zusammengesetzter Lipide, Energieversorgung A, D, E, K Lipoproteine Wegen ihrer geringen Wasserlöslichkeit werden die Lipide im Blut in Form von makromolekularen Lipid-Protein-Komplexen, den sogenannten Lipoproteinen, transportiert. Diese sphärischen Fetteiweißpartikel bestehen aus zwei Schichten: der Hülle aus polaren Phospholipiden, freiem, unverestertem Cholesterin sowie dem Proteinanteil, und dem Kern, in welchem sich die apolaren Cholesterinester und Triglyzeride befinden. Lipoproteine unterscheiden sich in ihrem Lipid- und Proteinanteil sowie ihren physikochemischen

11 Eigenschaften. Eine Einteilung ist anhand ihrer unterschiedlichen Dichte, ihrer elektrischen Ladung, sowie anhand ihrer Proteinkomponente möglich (Kostner et al. 1995) (Tabelle 2). Auf Grund ihrer unterschiedlichen Dichte erfolgt durch Ultrazentrifugation die Trennung der Lipoproteine. Hierbei können die Lipoproteine in fünf Hauptfraktionen aufgetrennt werden: Chylomikronen, VLDL (Very Low Density Lipoprotein), IDL (Intermediate Density Lipoprotein), LDL (Low Density Lipoprotein) und HDL (High Density Lipoprotein). Zusätzlich ist eine Subfraktionierung der einzelnen Hauptklassen in weitere Unterklassen möglich. Die elektrische Ladung der Lipoproteine spielt eine Rolle bei ihrer Trennung durch die Lipid-Elektrophorese. Auf diese Weise lassen sich die Lipoproteine in Chylomikronen, die am Auftragungsort verbleiben, α-lipoproteine, die am weitesten wandern, β- Lipoproteine, deren Wanderungsstrecke am kürzesten ist, und prä-β-lipoproteine, die zwischen den α- und β-lipoproteinen zu liegen kommen, auftrennen. Hierbei entsprechen die prä-β-lipoproteine den VLDL, die β-lipoproteine den LDL und die α-lipoproteine den HDL (Kostner et al. 1995). Tabelle 2: Lipoprotein-Klassen und deren Eigenschaften Dichte Elektrophoret. Partikel- Zusammensetzung [% Masse] [kg/l] Beweglichkeit Radius[nm] TG FC CE PL PR Chylomikronen < keine > VLDL < Prä-beta IDL Prä-beta bis beta LDL beta HDL alpha TG: Triglyzeride; FC: freies (unverestertes) Cholesterin; CE: Cholesterinester; PL: Phospholipide; PR: Protein

12 1.1.3 Apolipoproteine Dem Konzept der Lipoproteinfamilien nach Alaupovic (Alaupovic et al. 1972) liegen die unterschiedlichen Proteinkomponenten zugrunde. Dabei werden die Lipoproteine nach ihrem Hauptproteinanteil eingeteilt. Die Hauptkomponente der α-lipoproteine wird ApoA genannt, die der prä-β-lipoproteine und β-lipoproteine ApoB. Die Funktion der Apolipoproteine beschränkt sich jedoch nicht nur auf den Transport von Lipiden im Blut. Sie dienen darüber hinaus auch als Liganden für Rezeptoren an Zelloberflächen und aktivieren bzw. regulieren Enzyme, weshalb ihnen eine Schlüsselrolle im Fettstoffwechsel und damit auch bei der Entwicklung der Atherosklerose zukommt (Roheim et al. 1986). In Tabelle 3 sind die verschiedenen Funktionen einzelner Apolipoproteine und ihr Vorkommen innerhalb der verschiedenen Dichteklassen zusammengefaßt.

13 Tabelle 3: Apolipoproteine Apo MW [kd] Synthese Funktion A-I 28.3 Darm, Leber LCAT-Aktivierung, Bindung an HDL- Rezeptoren A-II 8.7 Leber Kofaktor der HTGL und LCAT (?) A-IV 46 Darm LCAT-Aktivierung, Appetitregulation (?) (a) Bestandteil von Lp(a) Regulation der Fribrinolyse (?) B Leber Strukturprotein, Rezeptorbindung B Darm Resorption von Lipiden, Strukturprotein C-I 6.6 Leber Kofaktor der LCAT, hemmt Bindung von Lipoproteinen an LDL-Rezeptoren C-II 8.9 Leber Aktivierung der LPL C-III 8.2 Leber Inhibition der LPL und Remnant- Clearance E 34 Leber Rezeptorbindung, Ausschleusung aus extrahepatischen Zellen LCAT: Lecithin-Cholesterin-Acyl-Transferase; HTGL: Hepatische Triglyzerid Lipase; LPL: Lipoproteinlipase

14 1.1.4 Stoffwechsel der Plasmalipoproteine Man unterscheidet zwischen exogenem und endogenem Lipoproteinsystem. Der exogene Weg transportiert Lipide, die mit der Nahrung aufgenommen wurden. Der endogene Weg transportiert Lipoproteine hepatischen Ursprungs. Exogener Weg Endogener Weg Intestinum Intestinum Galle Leber LDL Endotheliale Makrophagen Chylomikronen Remnants VLDL IDL CE HDL CH LPL FFS Kapillaren LPL FFS Abbildung 1: Stoffwechsel der Plasmalipoproteine (Winkler, Habilitationsschrift 2004) CH: Cholesterin; CE: Cholesterinester; FFS: Freie Fettsäuren; LPL: Lipoproteinlipase

15 Die mit der Nahrung zugeführten Lipide werden im Darm resorbiert und mit dem Struktur- Apolipoprotein ApoB-48, das von den Enterozyten synthetisiert wird, komplexiert. Die so entstandenen Lipoproteine werden Chylomikronen genannt und unter Umgehung der Leber über das Lymphsystem (Ductus thoracicus) in den Blutkreislauf eingeschleust. Auf diese Weise werden die resorbierten Nahrungslipide zunächst den peripheren Geweben wie Muskulatur und Fettgewebe zur Verfügung gestellt. Die Lipoproteinlipase (LPL), ein kapillarwandständiges Enzym, hydrolisiert die im Inneren der Chylomikronen befindlichen Triglyzeride in freies Glyzerin und freie Fettsäuren, die dann vom Fettgewebe und der Muskulatur gespeichert bzw. metabolisiert werden können. Schließlich entstehen triglyzeridabgereicherte und relativ cholesterinreiche Partikel, die als Chylomikronen-Remnants (Remnant: Rest) bezeichnet werden (Assmann et al. 1982) und letztendlich durch Bindung ihrer ApoE-Komponente an Remnant-Rezeptoren von den Hepatozyten aufgenommen werden (Abbildung 1). Beim endogenen Weg sezerniert die Leber Triglyzeride und Cholesterin in Form von VLDL, die mit dem Struktur-Apolipoprotein ApoB-100 ausgestattet sind (Mahley et al. 1984). Bei der intravasalen Lipolyse von VLDL-Partikeln entstehen zwischen der VLDL- und der LDL-Fraktion Lipoproteine von intermediärer Dichte. Sie werden als IDL (Intermediate Density Lipoprotein) oder Remnant-Lipoproteine bezeichnet (Schmitz et al. 1995). Unter Einwirkung der Lipoproteinlipase entstehen aus diesen durch weitere Hydrolyse von Triglyzeriden die LDL (Abbildung 1). Diese LDL-Partikel binden über ihren ApoB-Anteil an die LDL-Rezeptoren der Leber und des peripheren Gewebes, werden mittels Endozytose aufgenommen und beliefern diese Zellen mit Cholesterin und Triglyzeriden (Brown et al. 1981, Brown et al. 1986). Die intrazelluläre Cholesterinkonzentration wird überwiegend durch die Aktivität des LDL-Rezeptors bestimmt. Etwa 90% der LDL werden spezifisch über LDL-Rezeptoren und nur etwa 10% über die sogenannten Scavenger-Rezeptoren (Scavenger: Straßenkehrer) aufgenommen (Siekmeier et al. 1997). Dieser Scavenger-Rezeptor ist vor allem auf Makrophagen, kupfferschen Sternzellen und Endothelzellen lokalisiert (Kostner et al. 1995) und bindet bevorzugt zum Beispiel durch Oxidation modifizierte LDL-Partikel. Er ist im Gegensatz zum LDL-Rezeptor nicht sättigbar, wodurch bei hohen Konzentrationen an extrazellulärem Cholesterin die Gefahr einer Cholesterinüberladung dieser Zellen steigt (Seidel et al. 1985). Die LDL-Fraktion stellt ihrerseits keine homogene Lipoproteindichteklasse dar, sondern läßt sich mittels Ultrazentrifugation in sechs weitere Subfraktionen (LDL-1 bis LDL-6) auftrennen. Die LDL-1 sind große, leichte Partikel mit einem hohen Triglyzeridanteil und

16 einem eher geringen Anteil an Cholesterinestern. Unter Einwirkung der Lipoproteinlipase werden im weiteren Verlauf immer mehr Triglyzeride hydrolisiert, so daß der Anteil der Triglyzeride in den Partikeln zunehmend sinkt und im Gegensatz dazu der relative Anteil der Cholesterinester steigt. Die schließlich resultierenden LDL-6-Partikel sind klein und haben eine hohe Dichte. Derartig modifizierte LDL können durch verlängerte Zirkulationsdauer, Einwirkung chemischer Noxen sowie durch krankhafte Stoffwechselsituationen wie Diabetes mellitus entstehen (Brown et al. 1980;Yokode et al. 1988).Da sie schlechter an den LDL- Rezeptor binden können, verbleiben diese LDL-6-Partikel länger in der Blutbahn. Durch die dadurch entstehende verlängerte Zirkulationszeit sind sie vermehrt oxidativen Einflüssen ausgesetzt. Auf diese Weise modifizierte LDL-Partikel können an Scavenger-Rezeptoren binden, die von Makrophagen exprimiert werden. Durch Phagozytose dieser veränderten LDL können die Makrophagen in Schaumzellen transformiert werden und so die Entstehung atherosklerotischer Läsionen begünstigen (Kostner et al. 1995). Cholesterin kann nur über die Leber und die Gallenwege ausgeschieden werden (Kostner et al. 1995). Den reversen Cholesterintransport, d.h. den Rücktransport des Cholesterins aus der Körperperipherie zurück zur Leber, vermitteln HDL-Partikel (Abbildung 1). Auch diese Fraktion stellt eine heterogene Lipoproteinfraktion dar, die sowohl in der Leber als auch im Darm synthetisiert werden kann. Die wichtigsten Apolipoproteine der HDL sind ApoA-Ι und ApoA-ΙΙ. Es wird angenommen, daß die Aufnahme des zellulären Cholesterins in die HDL durch den zellulären Cholesteringehalt reguliert wird und dieser Cholesterin-Efflux über HDL-Rezeptoren erfolgt. Das für diesen Cholesterin-Efflux verantwortliche Protein ist der ATP-binding cassette transporter 1 (ABC1), der auf der Plasmamembran lokalisiert ist (Orso et al. 2000, Rust et al 1999) (Abbildung 2). Nach Aufnahme von freiem Cholesterin in die HDL wird es mit Hilfe der Lezithin- Cholesterin-Acyltransferase (LCAT) verestert. Diese hydrophoben Cholesterinester werden nun entweder im Kern der HDL-Partikel angereichert (Kostner et al. 1995) oder im Austausch gegen Triglyzeride mit Hilfe des Cholesterinester Transfer Proteins (CETP) an ApoBenthaltende Lipoproteine, vorzugsweise VLDL-Remnants (IDL), übertragen (Assmann et al. 1993), wodurch eine Endprodukthemmung der LCAT umgangen wird (Eisenberg et al. 1984). Das als Cholesterinester auf triglyzeridreiche IDL oder LDL übertragene Cholesterin kann nun wie das gesamte Lipoprotein über hepatische LDL-Rezeptoren (auch ApoB/E-Rezeptor genannt) verstoffwechselt werden. Andererseits können cholesterinbeladene HDL auch ApoE anreichern und zur Leber gelangen, wo sie von den LDL-Rezeptoren erkannt werden (Assmann et al. 1993). Das Cholesterin wird von Hepatozyten aufgenommen, wo es entweder

17 direkt oder nach Umbau zu Gallensäuren mit der Galle in den Darm ausgeschieden wird, während die HDL-Partikel erneut Cholesterin aus der Peripherie zur Leber transportieren können. Das HDL übernimmt somit eine wichtige Funktion in der Cholesterinhomöostase des Organismus. Leber IDL CETP TG HDL 2 HTGL CE LCAT HDL 3 CH ABC1 Endotheliale Makrophagen Abbildung 2: Reverser Cholesterintransport (Winkler, Habilitationsschrift 2004) CH: Cholesterin; CE: Cholesterinester; TG: Triglyzeride; ABC1: ATP-binding cassette transporter 1; LCAT: Lezithin-Cholesterin-Acyltransferase; CETP: Cholesterinester Transfer Protein; HTGL: Hepatische Triglyzerid Lipase 1.2 Atherosklerose Unter Atherosklerose versteht man einen komplexen, multifaktoriellen Prozeß, der aus einer entzündlichen bzw. fibroproliferativen Reaktion der Gefäßwand auf verschiedene schädigende Stimuli entsteht (Corsini et al. 1995). Als Folge der Freisetzung chemotaktischer Substanzen durch die geschädigten Endothelzellen kommt es zu einer Adhäsion von Monozyten, Granulozyten und Lymphozyten an die Endotheloberfläche und deren Migration in die Gefäßintima. Dort erfolgt die Umwandlung

18 der Monozyten zu Makrophagen. Im Bereich zerstörter Endothelzellen findet eine Adhäsion und Aggregation von Thrombozyten statt. Cytokine und Wachstumsfaktoren, welche von den aktivierten Makrophagen, Endothelzellen und Thrombozyten freigesetzt werden, führen zu einer Einwanderung von glatten Muskelzellen aus der Media in die Intima. Durch die Proliferation und Umwandlung der Myozyten vom kontraktilen in den synthetischen Phänotyp, sind diese zur Synthese von Kollagen, Elastin und Proteoglykanen fähig (Basha et al. 1995) ApoB-enthaltende Lipoproteine und Atherosklerose Im Gegensatz zur Response-to injury Theorie, die eine primäre Verletzung des Endothels mit sekundärer Einlagerung von Lipiden für die Atherosklerose verantwortlich macht (Ross et al. 1977), geht die Lipidhypothese davon aus, daß erhöhte Lipoproteine im Blut, speziell LDL, direkt zur Entstehung der Atherosklerose führen (Stehbens et al. 1990). In Studien an Tieren konnte der Nachweis erbracht werden, daß LDL-Partikel in der Lage sind, intakte Endothelzellen zu überwinden und sich im subendothelialen Raum der Intima anzusammeln (Nievelstein et al. 1991; Nievelstein et al. 1994). Dort findet die Modifikation der LDL-Partikel durch Freisetzung von oxidierenden Substanzen aus Endothelzellen, Makrophagen und glatten Muskelzellen statt (Selwyn et al. 1997; Steinberg et al. 1997; Steinberg et al. 1989). Abbildung 2 zeigt verschiedene Mechanismen, über die oxidierte LDL-Partikel zur Atherogenese beitragen können. Abbildung 3: Die Rolle oxidativ modifizierter LDL-Partikel in der Entwicklung atherosklerotischer Läsionen (Steinberg et al. 1989). 1: Rekrutierung zirkulierender Monozyten, 2: Hemmung der Motilität ortsständiger Makrophagen, 3: gesteigerte Aufnahme oxidierter LDL-Partikel durch Makrophagen und Entwicklung von Schaumzellen, 4: Läsion des Endothels durch die zytotoxische Wirkung oxidierter LDL-Partikel

19 Folge der Oxidation kann die Modifikation des ApoB-100-Proteins mit gestörter Bindung an den klassischen LDL-(ApoB/ApoE-) Rezeptor und vermehrter Bindung an den Scavenger- Rezeptoren sein. Wie schon in Abschnitt erwähnt, unterliegt der Scavenger-Rezeptor im Gegensatz zum LDL-Rezeptor keiner Feedback-Regulation durch die intrazelluläre Cholesterinkonzentration, was bei einer vermehrten LDL-Aufnahme zu einer Akkumulation von Cholesterinestern führt (Steinberg et al. 1997). Cholesterin kann nicht von Makrophagen abgebaut werden und wird in Fettvakuolen gelagert. Durch die große Anzahl von Fettvakuolen innerhalb der Makrophagen, entsteht das Bild der Schaumzelle (Quinn et al. 1987; Steinberg et al. 1989). Frühe atherosklerotische Läsionen, die sogenannten fatty streaks, bestehen aus einer Ansammlung solcher fettgefüllter Schaumzellen unter einer verdickten Intima (Kockx et al. 1998). Wie schon eingangs erwähnt, ist die LDL-Fraktion nicht homogen. Anhand ihrer physikochemischen Eigenschaften läßt sich die LDL in große, leichte (large, buoyant) und kleine, dichte (small, dense) LDL mit unterschiedlicher biologischer Wertigkeit auftrennen. Hierzu können sowohl Elektrophorese (Größe) als auch Ultrazentrifuge (Dichte) verwendet werden. Zahlreiche Studien haben eine Assoziation zwischen den erhöhten Konzentrationen der Plasma-Triglyzeride, den kleinen, dichten LDL und dem erniedrigten HDL-Cholesterin gezeigt (Austin et al. 1990; Krauss et al. 1991; McNamara et al. 1992). Diese Stoffwechsellage wird als sogenannter atherogener Lipoprotein Phänotyp (ALP) bezeichnet (Austin et al. 1990). Allerdings können kleine, dichte LDL auch unabhängig von Triglyzeriden und HDL-Cholesterin eine endotheliale Dysfunktion verursachen (Vakklianen et al. 2000). Eine Verbindung zwischen kleinen, dichten LDL und erhöhtem Risiko für die KHK wurde erstmals von Austin und Mitarbeitern vorgeschlagen (Austin et al. 1988). Nachfolgende Fallkontroll-Studien und prospektive Studien haben gezeigt, daß bei Vorliegen eines kleinen, dichten LDL-Profils das Risiko für die Entstehung einer KHK um bis zu 7-fach erhöht sein kann (Austin et al. 1990; Campos et al. 1992; Coresh et al. 1993; Griffin et al. 1994; Gardner et al. 1996; Stampfer et al. 1996; Lamarche et al. 1997; Gray et al. 1997). Im Vergleich zu großen LDL-Partikeln zeigen kleine, dichte LDL-Partikel eine verminderte Aufnahme durch den LDL-Rezeptor (Nigon et al. 1991), sind anfälliger für oxidative Modifikation (Dejager et al. 1993) und zeigen eine erhöhte Affinität für Proteoglykane der Gefäßwand (Anber et al. 1996) sowie die Fähigkeit zur verstärkten Penetration der Gefäßintima (Nordestgaard et al. 1994).

20 Eine Assoziation der LDL-Unterfraktionen mit dem Schweregrad angiographischer Veränderungen konnte an Koronarpatienten mit Ein-, Zwei- oder Dreigefäßerkrankungen gezeigt werden. Hierzu wurden die Lipoproteine zunächst durch sequentielle präparative Ultrazentrifugation voneinander getrennt (Havel et al. 1995) und dann die gesamte LDL in 6 LDL-Subfraktionen aufgetrennt (Baumstark et al. 1990). Je stärker die Koronargefäße atherosklerotisch verändert waren, um so höher war auch der Anteil der kleinen, dichten LDL (LDL-5 und LDL-6) (Baumstark et al. 1994) (Abbildung 4). Abbildung 4: Koronare Herzkrankheit und LDL-Subfraktionen (Baumstark et al. 1994) Anzahl der Gefäße mit Stenose >50% ApoB [mg/dl] ** ** 10 5 ** p < 0,01 0 V I L-1 L-2 L-3 L-4 L-5 L-6 Dichte V: VLDL (Dichte < 1,006 [kg/l]); I: IDL (Dichte 1,006 1,019 [kg/l]); L-1: LDL-1 (Dichte 1, [kg/l]); L-2: LDL-2 (Dichte 1,031 1,034 [kg/l]); L-3: LDL-3 (Dichte 1,034 1,037 [kg/l]); L-4: LDL-4 (Dichte 1,037 1,040 [kg/l]); L-5: LDL-5 (Dichte ,044 [kg/l]) und L-6: LDL-6 (Dichte ,063 [kg/l]) (Baumstark et al. 1990).

21 Ein weiterer Mechanismus, der zu den klinischen Symptomen einer myokardialen Ischämie führen kann, ist die endotheliale Dysfunktion. Intakte Endothelzellen sind in der Lage, vasoaktive Substanzen wie EDRF (endothelium derived relaxing factor = NO) über die endothelständige NO-Synthase (enos) freizusetzen (Ganz et al. 1996). Hypercholesterinämie (Ganz et al. 1996; Vita et al. 1990), hohe LDL-Konzentrationen (Liao et al. 1995) und niedrige HDL-Konzentrationen (Kuhn et al. 1991; Zeiher et al. 1994) beeinflussen die endothelabhängige Vasodilatation, indem sie die Produktion der endothelialen vasoaktiven Substanzen reduzieren. Daraus kann eine paradoxe Konstriktion mit Zunahme des Gefäßwiderstandes und Ischämie resultieren (Ganz et al. 1996; Vita et al. 1990). Auch für die ApoB-enthaltenden VLDL und IDL wurden atherogene Eigenschaften nachgewiesen (Grundy et al. 1995). Durch die Inkubation von VLDL mit Makrophagen konnte eine Akkumulation von Cholesterinestern in Makrophagen erreicht und dadurch das Erscheinungsbild der Schaumzelle erzeugt werden (Goldstein et al. 1980; Mahley et al. 1980). Außerdem sind hohe Konzentrationen von VLDL-Triglyzeriden mit dem Auftreten von kleinen, dichten LDL-Partikeln assoziiert (Grundy et al. 1995). Des weiteren können hohe VLDL-Triglyzeridspiegel die Ursache für verringerte HDL-Konzentrationen (Grundy et al. 1995) und damit ein erhöhtes Atheroskleroserisiko sein ApoA-enthaltende Lipoproteine und Atherosklerose Hohe HDL-Spiegel wirken sich hemmend auf die Atherogenese aus (Rubin et al. 1991), wohingegen verringerte HDL-Konzentrationen die Entwicklung der Atherosklerose fördern (Ordovas et al. 1989). Somit besteht eine inverse Beziehung zwischen HDL-Konzentrationen und Atheroskleroserisiko (Gordon et al. 1989; Rubin et al. 1991). Der Schutzfunktion der HDL-Partikel können verschiedene Mechanismen zugrunde liegen: mittels des reversen Cholesterintransports wird Cholesterin aus den Zellen, unter anderem der Gefäßwand, entfernt, zur Leber gebracht und über diese in den Darm ausgeschieden (Grundy et al. 1995; Roheim et al. 1986). Darüber hinaus hemmen HDL-Partikel die Aggregation von LDL (Khoo et al. 1990) und die Oxidation der LDL-Partikel (Parthasarathy et al. 1990) in der Gefäßwand, so daß die Entwicklung von fatty streaks behindert wird. Aus oben beschriebenen Mechanismen läßt sich ableiten, daß es das Ziel einer lipidsenkenden Therapie sein sollte, neben dem Gesamtcholesterinspiegel vor allem die Konzentration der ApoB-enthaltenden Lipoproteine wie VLDL und LDL zu senken, die der ApoA-enthaltenden Lipoproteine wie HDL jedoch zu steigern.

22 1.3 Atherosklerose bei Diabetes mellitus Typ 2-Patienten Diabetes mellitus Typ 2-Patienten haben auf Grund einer Störung des Fettstoffwechsels ein erhöhtes Risiko für die Entwicklung einer koronaren Herzkrankheit (KHK) (Stamler et al. 1993; Turner et al. 1996), mit einem Risiko, welches dem von nicht-diabetischen Infarktpatienten entspricht (Haffner et al. 1998). Mitverantwortlich für das hohe Atheroskleroserisiko von Typ 2 Diabetikern ist eine Dominanz kleiner, dichter LDL bei diesen Patienten, welche meistens im Rahmen des atherogenen Lipoprotein Phänotyps auftritt. Die Dominanz kleiner, dichter LDL scheint darüber hinaus aber auch ihrerseits für die Enstehung eines Diabetes mellitus Typ 2 zu prädisponieren (Austin et al. 1995), was für einen engen Zusammenhang zwischen dem atherogenen Lipoprotein Phänotyp und der Enstehung eines Diabetes mellitus Typ 2 spricht. 1.4 Pioglitazon, ein neues orales Antidiabetikum in der Therapie von Diabetes mellitus Typ 2 Pioglitazon ist eine antidiabetische Thiazolidindion (TZD)-Verbindung. Die TZDs fungieren als Peroxisom Proliferator-aktivierter Rezeptor Gamma (PPAR-γ)-Agonisten. Pioglitazon und andere TZDs erhöhen die Transkription der für die Insulinproduktion verantwortlichen Gene (Fuchtenbusch et al. 2000) und reduzieren sowohl die periphere als auch die hepatische Insulinresistenz bei Patienten mit Diabetes mellitus Typ 2 (Miyazaki et al. 2001; Yamasaki et al. 1997). Die verbesserte Insulinsensitivität resultiert aus einer Erniedrigung der Blutglukoseund der Plasma-Insulin-Konzentration (Miyazaki et al. 2001; Aronoff et al. 2000). Wie die anderen TZDs Troglitazon und Rosiglitazon, verbessert Pioglitazon die Insulinresistenz bei Diabetes mellitus Typ 2, ohne die Insulinsekretion in pankreatischen Betazellen zu stimulieren, was das Risiko einer Hypoglykämie verringert (Eckland et al. 2000). In einer Studie bei einer limitierten Zahl von Patienten wurde die Wirkung von Troglitazon, Rosiglitazon und Pioglitazon auf den Lipid-Stoffwechsel verglichen (King et al. 2000). Änderungen in HbA1c waren bei allen 3 Wirkstoffen ähnlich, wohingegen sich die Auswirkungen auf den Lipoprotein-Stoffwechsel unterschieden. Pioglitazon reduzierte das Serum-Triglyzerid und erhöhte das HDL-Cholesterin stärker als Troglitazon und Rosiglitazon. Zusätzlich erhöhten Troglitazon und Rosiglitazon das LDL-Cholesterin, was beim Pioglitazon nicht der Fall war (Aronoff et al. 2000; King et al. 2000). Außerdem führte

23 Pioglitazon zu einer Erniedrigung kleiner, dichter LDL, was auch bei Troglitazon trotz einer Erhöhung des LDL-Cholesterins zu beobachten war. 1.5 Die Wirkung von Pioglitazon auf den Lipid-Stoffwechsel bei nicht-diabetischen Patienten mit arterieller Hypertonie Insulinresistenz tritt oftmals bei nicht-diabetischen Patienten mit arterieller Hypertonie auf, wobei Hypertonie und Insulinresistenz eng miteinander verknüpft sind (Ferrannini et al. 1997; Osei et al. 1999). Der Fettstoffwechsel bei Insulinresistenz und Diabetes mellitus Typ 2 ist durch erhöhte Triglyzeride, niedrigem HDL-Cholesterin, nur mäßig erhöhtem LDL- Cholesterin (Haffner et al ), aber einer Dominanz kleiner, dichter LDL ( Reaven et al. 1993; Austin et al. 1996), dem atherogenen Lipoprotein Phänotyp (Austin et al. 1990), gekennzeichnet. In einer offenen multizentrischen Studie wurde gezeigt, daß Pioglitazon den Anteil kleiner, dichter LDL bei Patienten mit Diabetes mellitus Typ 2 reduziert (Winkler et al. 2002). Diese Studie war allerdings nicht Placebo- kontrolliert. Die hier vorliegende Studie soll den Effekt von Pioglitazon auf die LDL-Subfraktionen bei hypertensiven Patienten mit Insulinresistenz und hohem Anteil an kleinen, dichten LDL in einem doppelblind und parallelgruppenvergleichenden Ansatz zeigen.

24 2. Material und Methoden 2.1 Patienten und Studienprotokoll Die vorliegende Studie wurde 2003 veröffentlicht (Winkler et al Diabetes Care). Es handelt sich um eine monozentrische, doppel-blind, parallelgruppenvergleichende Medikamentenstudie. Zu Beginn der Studie wurden 60 Patienten rekrutiert und untersucht, wobei 4 Patienten die Einschlußkriterien nicht erfüllten und 2 Patienten auf Grund einer Hyperlipoproteinämie Typ 3 ausgeschlossen wurden. Es wurde der Effekt einer 16-wöchigen Monotherapie mit 45 mg Pioglitazon (n=26 (n=anzahl der Probanten)) und mit Placebo (n=28) auf die LDL-Subfraktionen bei nicht-diabetischen Patienten mit mäßiger arterieller Hypertonie bei Normolipidämie untersucht. Die Studie wurde von dem Ethikkomitee der Johann-Wolfgang-von-Goethe-Universität Frankfurt mit positivem Votum bewertet Studienparameter Für die Wirksamkeit von Pioglitazon wurden die Konzentrationen der folgenden lipidologischen Global-Parameter herangezogen: Gesamtcholesterin, Triglyzeride, LDLund HDL-Cholesterin, Apolipoprotein B-100, A-I, A-II, C-II, C-III und E. Während der Behandlungsdauer wurden unerwünschte Ereignisse sowie Sicherheitsparameter wie Differentialblutbild, Fibrinogen, klinische Chemie (Kreatinin, Harnstoff, Harnsäure, Bilirubin und Glukose) und die Aktivitäten verschiedener Enzyme (S-GOT, S-GPT, y-gt, CK, LDH und AP) erfaßt Probanden Die Auswahl der geeigneten Patienten erfolgte anhand vorgegebener Ein- und Ausschlußkriterien. Zu den Einschlußkriterien zählten folgende Merkmale: Alter zwischen 18 und 70 Jahren und eine mäßige arterielle Hypertonie nach der Definition der International Society of Hypertension/World Health Organisation Criteria (WHO 1999). Der systolische Blutdruck (SBP) musste zwischen 140 mm Hg und <180 mm Hg und der diastolische Blutdruck (DBP) zwischen 90 mm Hg und <105 mm Hg liegen. Der Mittelwert des SBP in einer 24-Stunden-Messung sollte > 135 mm Hg und der Mittelwert des DBP >85 mm Hg sein. Von der Studie ausgeschlossen wurden Patienten aufgrund folgender Faktoren: bekannter Diabetes mellitus, Einnahme von Medikamenten mit lipidsenkender Wirkung,

25 das Vorliegen einer Hyperlipidämie, eines Alkoholabusus, kardiovaskulärer Erkrankungen, signifikanter Lebererkrankungen, einer schweren Nierenerkrankung, einer chronischen Pankreatitis oder anderer schwerer gastrointestinaler Erkrankungen, einer allergischen Erkrankung bzw. Überempfindlichkeit gegenüber Medikamenten, einer malignen Erkrankung oder die Behandlung durch LDL-Apherese. Der BMI mußte zwischen 20 und 35 kg/m 2 liegen. Die weiblichen Patienten waren postmenopausal, hysterektomiert, sterilisiert oder unterzogen sich einer kontrazeptiven Therapie Studienablauf Nach einer einwöchigen Anpassungsphase wurde bei 19 Frauen und 35 Männern zwischen 34 und 67 Jahren zusätzlich zu der bereits bestehenden hypertensiven Medikation mit der Einnahme von Pioglitazon bzw. Placebo begonnen. Die Hypertensive Medikation bestand aus ACE-Hemmern, Diuretika oder Calcium-Antagonisten, wobei die Behandlung mit β-blockern ausgeschlossen war. Die Medikation wurde einmal täglich morgens eingenommen. Jeweils zu Beginn der Studie und nach 16-wöchiger Therapie wurde den Probanten nüchtern Vollblut entnommen und untersucht. 2.2 Analytische Techniken Lipoproteinseparation mittels Ultrazentrifugation Zu jedem Blutabnahmezeitpunkt wurden aus dem Plasma die Lipoproteinfraktionen durch Ultrazentrifugation gewonnen. Lipoproteine unterschieden sich aufgrund ihrer Größe, Dichte und elektrischen Ladung bei vorgegebenem ph-wert. Diese Unterschiede kann man sich bei ihrer Auftrennung in einzelne Fraktionen zunutze machen. Die Fettstoffwechselanalytik wurde an der Abteilung für Klinische Chemie der Universität Freiburg durchgeführt. Für die einzelnen Messungen wurden jeweils 5 ml EDTA-Plasma eingesetzt. Nach der Methode von Havel et al. (1955) wurden die einzelnen Lipoproteinfraktionen, ausgehend vom Gesamtplasma, mit Hilfe der sequentiellen Ultrazentrifugation in folgende Dichteklassen aufgetrennt: d < kg/l für VLDL, < d < für IDL, < d < kg/l für LDL und < d < 1.21 kg/l für HDL (Havel et al. 1955).

26 Die Auftrennung der LDL-Subfraktionen wurde nach einer von Baumstark et al. entwickelten Methode durchgeführt (Baumstark et al. 1990): Mit der Dichte-Gradienten- Ultrazentrifugation kann die LDL-Fraktion (1.019 < d < kg/l) nach Einstellung eines stabilen Dichtegradienten in sechs weitere Unterklassen aufgetrennt werden. Die Dichtebereiche der einzelnen Subfraktionen wurden mit der Präzisions-Refraktometrie von reinen Salzgradienten bestimmt: LDL-1: < kg/l; LDL-2: kg/l; LDL-3: kg/l; LDL-4: kg/l; LDL-5: kg/l; LDL-6: >1.044 kg/l. LDL-5 und LDL-6 wurden als kleine, dichte LDL zusammengefasst. Da die Dichte der Lipoproteine geringer ist als die aller anderen Serumproteine, verbleiben erstere nach Ultrazentrifugation konzentriert nahe der Plasmaoberfläche. Auch untereinander unterscheiden sich die Lipoproteine in ihrer Dichte. Durch weitere schrittweise Dichteerhöhung durch Salzzugabe in den einzelnen Zentrifugationsschritten flottieren die jeweiligen Lipoproteinfraktionen und können so abgetrennt werden. Die einzelnen Lipoproteinfraktionen wurden durch Bestimmung des Lipidanteils und ihrer Apolipoproteinkomponenten quantifiziert und charakterisiert. Es wurden die Konzentrationen des Gesamtcholesterins (Summe aus Cholesterinester und freiem Cholesterin), des freien Cholesterins und der Triglyzeride bestimmt. Das ApoB-100 ist das Strukturprotein der VLDL, IDL und der LDL. Jedes ApoB-100 enthaltende Lipoprotein besitzt nur ein einziges ApoB-100-Molekül. Somit repräsentiert die Konzentration des ApoB-100 in den verschiedenen Dichtefraktionen die Anzahl der in dieser bestimmten Fraktion vorhandenen Lipoproteinpartikel. Außerdem wurden ApoA-I und ApoA-II als Strukturproteine der HDL und das ApoE gemessen. Dichtelösungen Um die den einzelnen Lipoproteinfraktionen entsprechenden Dichtelösungen herzustellen, wurden bestimmte Salzmengen eingewogen und deren Dichten refraktometrisch durch Bestimmung der Brechungsindizes gemessen. Stammlösung n 26 = 1,3345 d 20 C = 1,007g/cm 3 11,45 g (0,2M) NaCl + 0,501 g (7,7mM) NaN 3 + 0,101 g (0,3 mm) Na 2 -EDTA ad 1000 g Aqua dest.

27 Lösung Ia n 26 = 1,3409 d 20 C = 1,0443 g/cm 3 101,210 g Stammlösung + 5,04 g (49 mm) NaBr Lösung Ib n 26 = 1,3585 d 20 C = 1,1468 g/cm 3 101,210 g Stammlösung + 19,802 g (0,19 M) NaBr Lösung II n 26 = 1,4121 d 20 C = 1,4744 g/cm g Stammlösung + 155,806 g (1,5 M) NaBr Lösung III n 26 = 1,3702 d 20 C = 1,2160 g/cm g Stammlösung + 60,964 g (0,59 M) NaBr Trennverfahren Das Gesamtplasma wurde maximal eine Woche bei 4 C aufbewahrt. Denn Voruntersuchungen haben ergeben, daß Lipoproteine durch Einfrieren deutlich verändert werden. Alle Zentrifugationsschritte wurden bei 18 C in Polykarbonat-Reagenzgläsern (6 ml) in einem 50Ti Rotor der Firma Beckmann (Beckmann, Palo Alto, CA, USA) durchgeführt. VLDL (d < 1,006 g/cm 3 ) 6 ml Plasma wurden in Polycarbonatröhrchen paarweise mit Stammlösung auf eine Genauigkeit von 0,001 g austariert. Nach 20-stündiger Zentrifugation bei rpm wurde die VLDL-Fraktion in einem Volumen von 2 ml in ein kalibriertes Glasröhrchen abgenommen.

28 IDL (d = 1,006 1,019 g/cm 3 ) Der Unterstand des VLDL-Laufes wurde mit Lösung Ia wieder auf 6 ml aufgefüllt und mit Stammlösung austariert, wodurch sich die Dichte auf d = 1,019 g/cm 3 änderte, und die IDL nach 23 Stunden bei rpm in 2 ml abpipettiert werden konnte. LDL (d = 1,019 1,063 g/cm 3 ) Der IDL-Unterstand wurde mit Lösung Ib auf 6 ml aufgefüllt und mit einem 3:1-Gemisch aus Stammlösung und Lösung Ia austariert. Dadurch wurde eine Dichte von d = 1,063 g/cm 3 für den LDL-Lauf erreicht. Die LDL wurden nach 25 Stunden bei rpm wiederum in 2 ml abpipettiert. HDL (d 20 C = 1,063 1,21 g/cm 3 ) Der Unterstand des LDL-Laufes wurde mit Lösung II auf 6 ml aufgefüllt und mit Lösung III austariert, woraus eine Dichte von d 20 C = 1,120 g/cm 3 resultierte. Das Abpipettieren der HDL in 1 ml erfolgte nach 20 Stunden bei rpm Verwendete Materialien bei der Lipoproteinbestimmung Das Gesamtcholesterin, das freie Cholesterin und die Triglyzeride wurden im Gesamtplasma und in den einzelnen isolierten Lipoproteinfraktionen enzymatisch mit der CHOD-PAP-, der GPO-PAP- und der PLD-PAP-Methode (Roche Diagnostics, Mannheim, Deutschland) bestimmt. Die Konzentration des veresterten Cholesterins (CE) wurde aus der Differenz von Gesamtcholesterin und freiem Cholesterin berechnet. Die Konzentrationen der Apolipoproteine wurden turbidimetrisch in einem Wako-30R- Analysegerät (Wako Chemicals, Japan) bestimmt Mittlerer LDL-Durchmesser Der mittlere LDL-Durchmesser wurde aus der Konzentration von freiem Cholesterin, Cholesterinester, Phospholipiden, Triglyzeriden und ApoB-100 in der LDL-Fraktion (1,019-1,063 kg/l) bestimmt (Baumstark et al. 1990). Der Abweichungs-Koeffizient des mittleren LDL-Durchmessers betrug ~5%.

29 2.2.4 Mittlere LDL-Dichte Die mittlere LDL-Dichte wurde nach folgender Gleichung aus den mittleren Dichten aller LDL-Subfraktionen bestimmt (Winkler et al ): Mittlere LDL-Dichte = ( ApoB in LDL- 1 1,025 + ApoB in LDL-2 1, ApoB in LDL-3 1, ApoB in LDL-4 1, ApoB in LDL-5 1,042 + ApoB in LDL-6 1,0535)/ (ApoB in Gesamt-LDL) [kg/l]. Der Abweichungs-Koeffizient der mittleren LDL-Dichte betrug ~5%. 2.3 Statistische Analyse Änderungen der Lipid- und Lipoproteinkonzentrationen während der Studie wurden zwischen den behandelnden Gruppen verglichen unter Zuhilfenahme des nicht-parametrischen Wilcoxon Signed Ranks Test for paired observations bzw. dem Mann-Whitney U-test für ungepaarte Vergleiche. Um festzustellen, ob Triglyzeride und HDL-Cholesterin den Effekt von Pioglitazon bzw. Placebo auf den LDL-Radius und die LDL-Dichte beeinflussen, wurde ein general linear model (GLM) benutzt. Alle Parameter wurden mittels logarithmischer Transformation normiert. Prozentuelle Änderungen des LDL-Radius und der Dichte wurden als abhängige Variablen, die behandelte Gruppe als fester Faktor und die Triglyzeride und das HDL-Cholesterin als Covarianten eingesetzt. Veränderungen wurden dann als statistisch signifikant bewertet, wenn der p-wert kleiner als 0,05 war. Alle Berechnungen wurden mittels SPSS für Windows (Version 11.0) durchgeführt.

30 3. Ergebnisse 3.1 Probanden Insgesamt nahmen 19 weibliche und 35 männliche Probanden mit arterieller Hypertonie an der Studie teil. Das Durchschnittsalter lag bei 53.7 Jahren und der body mass index (BMI) aller Studienteilnehmer lag durchschnittlich bei 28.3 kg/m Prozent der hypertensiven Patienten hatten zu Beginn der Studie eine nachweisbare Erhöhung der kleinen, dichten LDL, wobei kleine, dichte LDL vorliegen, wenn die Konzentration an LDL-5 plus LDL-6 über 25mg/dl liegt (Winkler et al. 2002). 3.2 Blutglukosekontrolle vor und während Behandlung mit Pioglitazon bzw. Placebo Nach einer Behandlungsdauer von 16 Wochen mit Pioglitazon kam es zu einer Reduzierung der Nüchtern-Glukosekonzentration um 6%, bei der Placebo-Gruppe kam es zu keiner Veränderung. Die Werte blieben damit in beiden Gruppen im Referenzbereich. In der Pioglitazon-Gruppe kam es auch zu einer Reduzierung der Insulin-Konzentration um 34%, was aber trotzdem keine Signifikanz gegenüber der Placebo-Gruppe zeigte. (Tabelle 4). Tabelle 4: Zusammenfassung der statistischen und klinischen Daten der hypertensiven Patienten (Mittelwert ± Standardabweichung) Pioglitazon (n=26) Placebo (n=28) Variable Ursprungs- Endwert Änderung Ursprungs- Endwert Änderung p- wert in % wert in % Wert Alter (Jahre) 52,7±8, ,6±9, Geschlecht (weiblich/männlich) 9/ / BMI (kg/m 2 ) 29,1±4,0 29,2±4,0-0 27,6 ± 3,4 26,5±5,0-4 NS Nüchtern-Glukose (mmol/l) 5,4±0,9 5,1±0,5-6 5,7 ± 0,9 5,7±0,6-0 0,049 Insulin (mu/ml) 13,0±11,0 8,6±4, ,0±4,0 11,4±6,0-5 NS Der p-wert wurde mittels Mann-Whitney U-test berechnet (Winkler et al. 2003)

31 3.3 Blutbild Obwohl im Normbereich, kam es trotzdem bei der Pioglitazon-Gruppe im Vergleich zur Placebo-Gruppe zu einer Reduzierung der Erythrozyten- und Hämoglobinkonzentration sowie des Hämatokrits (Tabelle 5). Tabelle 5: Effekt von Pioglitazon im Vergleich zu Placebo auf das Blutbild (Mittelwert ± Standardabweichung) Pioglitazon (n=26) Placebo (n=28) Variable Ursprungswert Endwert Änderung Ursprungswert Endwert Änderung p- in % in % Wert Leukozyten 6,9±2,2 6,3±2,2-9 6,8±1,9 6,4±1,4-6 NS (103/µL) Erythrozyten 4,7±0,4 4,4±0,3-6 4,7±0,4 4,7±0,4-0 0,001 (106/µL) Hämoglobin (g/l) 145±13 138± ±8 144±8-1 0,003 Hämatokrit (%) 42,2±3,7 40,2±3,0-5 42,2±2,3 41,8±2,3-1 0,009 Thrombozyten 251±56 238± ±49 238±57-4 NS (103/µL) Der p-wert wurde mittels Mann-Whitney U-test berechnet (Winkler et al. 2003). 3.4 Lipidparameter und Apolipoproteine Gesamtcholesterin, LDL-und HDL-Cholesterin änderten sich nicht. Die Konzentrationen von ApoA-II und ApoC-II stiegen an. Die ApoB-Konzentration in den LDL sank, zeigte aber keine Signifikanz zwischen den zwei Gruppen (Tabelle 6). Jedes ApoB-enthaltende Lipoprotein (VLDL, IDL, LDL) besitzt ein Molekül ApoB. Deshalb ist die ApoB- Konzentration in diesen Dichtefraktionen ein Maß für die Anzahl von Lipoproteinen in den jeweiligen Fraktionen. Pioglitazon reduzierte deutlich das ApoB in den kleinen, dichten LDL- Fraktionen (LDL-5 und LDL-6) und erhöhte leicht das ApoB in LDL-1 (Abbildung 5).Die absolute Konzentration von ApoB in LDL-5 und LDL-6 reduzierte sich um 22% (p=0.024,

32 verglichen mit Placebo) (Tabelle 6). Daraus resultierte ein Absinken der mittleren LDL- Dichte von ± kg/l auf ± kg/l (Placebo: von ± kg/l auf ± kg/l; p=0.005 versus Placebo). Der mittlere Durchmesser der LDL- Partikel stieg in der Pioglitazon-Gruppe von 19.83±0.30 nm auf 20.13±0.33 nm (Placebo: von 19.83±0.37 nm auf 19.79±0.47 nm; p<0.001 versus Placebo) (Abbildung 6). Daraus resultiert, daß unter Pioglitazon die Größe der LDL-Partikel zunahm, während ihre Dichte abnahm. Betrachtet man nur die Patienten mit einer Triglyzerid-Konzentration < 150mg/dL (n=18 in beiden Gruppen), so lag der mittlere Durchmesser der LDL-Partikel in der Placebo-Gruppe zu Beginn der Studie bei 19,93±0,33 nm und am Studienende bei 19,94±0,34 nm. In der Pioglitazon-Gruppe stieg dieser Wert von 19,90±0,30 nm auf 20,19±0,33 nm (p=0.014 versus Placebo). Der Effekt von Pioglitazon auf die LDL-Größe und -Dichte im Vergleich zu Placebo war somit unabhängig von den Triglyzerid- und HDL-Cholesterin-Konzentrationen zu Beginn der Studie und ebenso unabhängig von den Änderungen dieser Konzetrationen während der Studie. Zur Beurteilung wurde ein general linear model (GLM) benutzt (Tabelle 7). Bei der Untersuchung, ob das Geschlecht einen Einfluß auf den Effekt von Pioglitazon hat, verwendeten wir ebenfalls ein GLM. Die Unterschiede zwischen der Pioglitazon- und der Placebo-Gruppe waren auch dann noch signifikant, wenn das Geschlecht als Co-Faktor definiert wurde. Die Geschlechts-korrigierten p-werte zum Vergleich der beiden Gruppen lagen bezogen auf die prozentuale Änderung des LDL-Durchmessers bei <0,001 bzw. bezogen auf die LDL-Dichte bei 0,019. Somit konnte gezeigt werden, dass das Geschlecht keinen Einfluß auf den LDL-Durchmesser und die LDL-Dichte hatte.

33 Tabelle 6: Effekt von Pioglitazon auf die mittleren Lipoprotein- und Apolipoprotein-Konzentrationen bei hypertensiven Patienten Pioglitazon (n=26) Placebo (n=28) Variable Ursprungs- Endwert Änderung Ursprungswert Endwert Änderung p- wert in % in % Wert Gesamt- Cholesterol Gesamt Triglyzeride a (mmol/l) (mmol/l) 5,2±0,9 1,09 5,2±0,9 1, ,1±1,0 1,42 5,1±1,0 1, NS NS (Wertebereich) (0,58-7,13) (0,73-4,17) (0,54-5,64) (0,43-9,53) LDL-C HDL-C (mmol/l) (mmol/l) 2,8±0,8 1,2±0,3 2,8±0,6 1,3±0, ,8±0,8 1,1±0,3 2,6±0,8 1,1±0, NS NS Gesamt- ApoA Gesamt- ApoA-II Gesamt ApoB Gesamt ApoC-II Gesamt- ApoC-III Gesamt-ApoE (g/l) (g/l) (g/l) (mg/l) (mg/l) (mg/l) 1,44±0,22 0,49±0,10 1,09±0,23 40±17 120±40 29±8 1,36±0,24 0,51±0,11 1,00±0,26 47±19 126±36 29± ,30±0,38 0,46±0,09 1,03±0,33 46±20 129±46 32±9 1,34±0,30 0,45±0,08 1,06±0,25 46±22 125±49 34± NS 0,021 NS 0,010 NS NS ApoB in LDL ApoB in dldl b (mg/l) (mg/l) 824± ± ± ± ± ± ± ± NS 0,024 a Wertebereich und Durchschnitt. b LDL-5 plus LDL-6. Der p-wert wurde mittels Mann-Whitney U-test berechnet. (Winkler et al. 2003).

34 Tabelle 7: Einfluß von TG und HDL-CH auf Änderungen (%) des LDL-Radius und der LDL-Dichte (Pioglitazon vs. Placebo) ohne Eichung LDL-Radius (%Änderung) LDL-Dichte (%Änderung) Eichung auf die Ursprungswerte für HDL-CH & TG LDL-Radius (%Änderung) LDL-Dichte (%Änderung) Eichung auf die %-Änderung für HDL-CH & TG LDL-Radius (%Änderung) LDL-Dichte (%Änderung) Unterschied zwischen Ursprungswert und Endwert (EMM±SEM) Pioglitazon (n=26) Placebo (n=28) p-wert 1,498±0,280-0,134±0,029 1,498±0,279-0,130±0,29-0,227±0,270-0,0332±0,028-0,227±0,268-0,0366±0,028 <0,001 0,018 <0,001 0,025 1,523±0,289-0,123±0,026-0,251±0,278-0,04339±0,025 <0,001 0,036 TG: totales Serum-Triglycerid; HDL-CH: HDL Cholesterin; EMM: estimated marginal mean; SEM: standard error of the mean. Alle Parameter wurden normiert. TG und HDL-CH wurden als Kovariable in einem univariate general linear model (GLM) zur Korrektur ihres Einflusses auf Änderungen des LDL-Radius und der LDL-Dichte (abhängige Variablen) bei der behandelten Gruppe (feste Größe) definiert (Winkler et al. 2003).

35 Abbildung 5: Durchschnittliche Änderung in den LDL-Subfraktionen nach 16-wöchiger Behandlung mit Pioglitazon (45 mg/d). (Kreis = Ursprungswert; Dreieck = Werte nach 16-wöchiger Behandlung. * p<0.05, ** p<0.01, für Änderungen zwischen korrespondierenden Messwerten [Wilcoxon Signed Ranks Test]) (Winkler et al. 2003). 300 Placebo; n= Pioglitazone; n= ApoB [mg/l] * ** ** 0 V I L-1 L-2 L-3 L-4 L-5 L-6 0 V I L-1 L-2 L-3 L-4 L-5 L-6 Density Density

36 Abbildung 6: Durchschnittliche Änderung von LDL-Radius und LDL-Dichte nach 16-wöchiger Behandlung mit Pioglitazon (45 mg/d). P-Werte zum Vergleich zwischen Pioglitazon 45 mg und Placebo [Mann-Whitney U- test]) (Winkler et al. 2003). n = p<0.001 p= Mean Change (%) Mean Change (%) -0.4 Placebo Pioglitazone Placebo Pioglitazone Mean LDL-diameter Mean LDL-density

37 4. Diskussion Die Monotherapie mit 45 mg Pioglitazon täglich über einen Zeitraum von 16 Wochen zeigte in dieser Studie eine gute Verträglichkeit auf Seiten der Probanden. Allerdings wird empfohlen, prätherapeutisch und alle zwei Monate während des ersten Therapiejahres mit Pioglitazon und im Anschluß daran periodisch, die Leberfunktion zu überprüfen, weil kürzlich ein TZD auf Grund von Leberfunktionsstörungen und Lebertoxizität von der Federal Drug Administration (FDA) vom Markt genommen wurde (Watkins et al. 1998; Takeda et al. 1999). Die Werte für γ-gt, S-GOT, S-GPT und plasmatische CK blieben bei allen Patienten während der gesamten Studie deutlich unter dem oberen Grenzwert. Die Werte für γ-gt und S-GPT sanken sogar deutlich im Vergleich zur Placebo-Gruppe. 4.1 Blutglukose und Insulin Während der 16-wöchigen Behandlung mit Pioglitazon sanken die Blutzuckerwerte deutlich (Tabelle 4), blieben aber trotzdem während der gesamten Studie im Referenzbereich. Das zeigt, daß Pioglitazon die Insulin-Sensitivität verbessert, ohne die Insulin-Ausschüttung zu stimmulieren, was eine Hypoglykämie verhindert (Eckland et al. 2000). 4.2 Blutbild Erythrozyten, Hämoglobin und Hämatokrit zeigten einen leichten aber signifikanten Rückgang (Tabelle 5). Dies wurde kürzlich auch in einer anderen Studie gezeigt (Winkler et al. 2002; Belcher et al. 2000). Dieser Effekt wurde durch Hämodilution erklärt, welche während der Therapie mit Pioglitazon auftrat und teilweise durch Flüssigkeitsretention verursacht wurde, wie schon bei anderen TZDs und Insulin beobachtet (Belcher et al. 2000; Hirshberg et al. 2000). 4.3 Lipoproteine und Apolipoproteine Die aktuelle Studie führt zu zwei grundlegenden Ergebnissen. Erstens: nicht diabetische Patienten mit Normolipidämie und Hypertonie haben die gleiche Prävalenz für kleine, dichte

38 LDL wie neu-diagnostizierte Patienten mit Diabetes mellitus Typ 2 (Winkler et al. 2002). Zweitens: Pioglitazon erniedrigt wesentlich die kleinen, dichten LDL bei solchen Patienten (Abbildung 5), unabhängig von der nüchtern Triglyzerid- und HDL-CH-Konzentration (Tabelle 7). Daraus folgt, daß eine Behandlung mit Pioglitazon zu größeren, leichteren LDL- Partikeln führt (Abbildung 6), mit einem Anstieg der LDL-Größe um ca. 1,5%. Dieses Ergebnis kann in Bezug auf das KHK-Risiko relevant sein, da in einer prospektiven Fall- Kontroll-Studie gezeigt wurde, dass die Insidenz für eine fatale oder nicht-fatale KHK assoziiert ist, mit einer LDL-Größe, die ca. 1,9% kleiner war, als in Kontrollgruppen (Gardner et al. 1996). Unsere Beobachtungen bestätigten die bis jetzt gewonnenen Ergebnisse, daß Pioglitazon kleine, dichte LDL bei Patienten mit Diabetes mellitus Typ2 erniedrigt (Winkler et al. 2002). Im Allgemeinen korrelieren die Konzentrationen für kleine, dichte LDL mit den Triglyzerid- Konzentrationen. Daher sind Medikamente, die die Triglyzeride erniedrigen, auch in der Lage, die kleinen, dichten LDL zu reduzieren. Wie andere TZDs, reduziert Pioglitazon ebenfalls die Insulinresistenz bei Patienten mit Diabetes mellitus Typ 2 (Miyazaki et al. 2001), was wiederum zu einer Reduktion der Triglyzerid-Konzentration führen kann (Winkler et al. 2002). Interessanter Weise konnte das nicht in dieser Studie beobachtet werden. Es kam sogar zu einem wenn auch nichtsignifikanten Anstieg der Triglyzerid-Konzentration unter Behandlung mit Pioglitazon, was gleichzeitig mit dem Anstieg der ApoC-II-Konzentration zu beobachten war. Diese unerwarteten Ergebnisse können teilweise mit der Tatsache erklärt werden, daß die Triglyzerid-Konzentration zu Beginn der Studie alle im Referenzbereich lagen. Betrachtet man nur die Patienten mit einer Triglyzerid-Konzentration <150 mg/dl, kam es in der Pioglitazon-Gruppe nach wie vor zu einem signifikanten Anstieg des LDL-Durchmessers verglichen mit der Placebo-Gruppe. Ferner ist der Effekt von Pioglitazon unabhängig von der nüchtern Triglyzerid- oder HDL-CH-Konzentration, was zur metabolischen Entkopplung kleiner, dichter LDL von anderen Komponenten des atherogenen Lipoprotein-Phänotyps führt. Pioglitazon scheint dabei die Verteilung der LDL-Subfraktionen zu modifizieren, unabhängig von der nüchtern Triglyzerid-Konzentration. Dies führt zu der interessanten Frage, wie sich kleine, dichte LDL bei normalen nüchtern Triglyzerid-Konzentrationen bilden können. Auf der anderen Seite kommt es auch zu einer Bildung von kleinen, dichten LDL, in geringeren Konzentrationen, bei Erwachsenen ohne Diabetes mellitus Typ 2, Hypertonie und mit Normolipidämie, besonders bei mittel-alten und alten Männern. Ein möglicher Mechanismus könnte mit postprandialen