Seminar HPLC. Seminar HPLC / WS 2003/04. Dr. R. Vasold

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1 Seminar HPLC 1

2 2 Analytik - Abteilung Institut für Organische Chemie Prof. B. König

3 Kapitel I Theoretischer Teil 3 I.1 Einleitung I.2 Zielsetzung I.3 Die stationäre Phase I.4 Die mobile Phase I.5 Die Pumpe I.6 Die Injektionseinheit I.7 Der Detektor I.8 Die Software I.9 Die Methode des ISTD I.10 Aufgaben (Skript)

4 Kapitel I Theoretischer Teil 4

5 I.1 Einleitung 5 H igh P erformance-pressure L iquid C hromatography ( = Hochleistungs/Druck -Flüssig-Chromatographie)

6 I.2 Zielsetzung 6 Nach diesem Praktikum soll man u.a.: Die einzelnen Komponenten eines HPLC- Systems kennen Wichtige chromatographische Kenngrößen bestimmen können Die Trennleistung einer Trennung beurteilen können Eine quantitative Bestimmung einer Komponente mit der Methode des Internen Standards durchführen können

7 I.2.1 Komponenten eines HPLC Systems 7 Abb. 1: Komponenten eines HPLC-Systems (komplett)

8 I.2.1 Der HPLC-Arbeitsplatz 8 Abb. 2: Moderner HPLC-Arbeitsplatz

9 I.3 Die Stationäre Phase 9 Abb. 3: Komponenten eines HPLC-Systems (Säule)

10 I.3 Die Stationäre Phase 10 Stationäre Phase Abb. 4: Darstellung einer HPLC-Säule gefüllt mit stationärer Phase End-Kartusche

11 I.3 Die Stationäre Phase 11 Partikel (sphärisch) 3µm -10µm Abb. 5: Darstellung des Säulenmaterials (Einzelpartikel)

12 I.3.1 Chromatographiearten (Auswahl) 12 untersch. Löslichkeit Verteilungs-Chromatographie flüssig / flüssig untersch. elektrostatische WW unterschdl. Größe od. Gestalt Adsorptions-Chromatographie flüssig / fest NP / RP-HPLC untersch. Adsorptionsverhalten Ionenaustausch- Chromatographie Gel-Chromatographie SEC, GPC

13 I.3.2 Polarität der Stationäre Phase 13 Adsorptions-Chromatographie teilt sich auf in: Normal-Phase-Chomatographie: NP Stationäre Phase polar Reversed-Phase-Chomatographie: Stationäre Phase unpolar Mobile Phase unpolar RP Mobile Phase polar

14 I.3.3 Beispiele stationärer Phasen 14 Normal-Phase Abb. 6: Material mit polaren Silanol- (SiOH)-Endguppen

15 I.3.3 Beispiele stationärer Phasen Abb. 7: Material mit C18-Endcapping 15 RP-Phase

16 I.3.3 Beispiele stationärer Phasen Abb. 8: Material mit C8-Endcapping 16 RP-Phase

17 I.3.3 Beispiele stationärer Phasen Abb. 9: Material mit C4-Endcapping 17 RP-Phase

18 I.3.3 Beispiele stationärer Phasen Abb. 10: Material mit CH 3 -Endcapping 18 RP-Phase

19 I.3.3 Beispiele stationärer Phasen 19 RP-Phase Abb. 11: Material mit Phenyl-Endcapping

20 I.3.3 Beispiele stationärer Phasen 20 Abb. 12: Material mit Aminopropyl- Endcapping

21 I.3.3 Beispiele stationärer Phasen 21 Abb. 13: Material mit SO Endcapping

22 I.3.3 Beispiele stationärer Phasen 22 Abb. 14: Material mit C 3 H 6 N(CH 3 ) Endcapping

23 I.3.3 Beispiele stationärer Phasen 23 Im Praktikumsversuch wird folgende Säule eingesetzt: Hersteller: Fa. Phenomenex Dimensionen: 150 mm x 4.6 mm (ID) Material: 3 µm stationäre Phase: C18

24 I.4 Die mobile Phase 24 Abb. 15: Komponenten eines HPLC-Systems (Eluenten)

25 I.4.1 Die Polarität der mobilen Phase 25 Adsorptions-Chromatographie teilt sich auf in: Normal-Phase-Chomatographie: NP Stationäre Phase polar Reversed-Phase-Chomatographie: Stationäre Phase unpolar Mobile Phase unpolar RP Mobile Phase polar

26 I.4.2 Die Eluotrope Reihe für 26 = Empirische Anordnung der Laufmittel nach steigender Elutionskraft (Polarität E 0 ) bezogen auf Al 2 O 3 bzw. SiO 2 als Stationäre Phase Für die Normalphasen-(NP)-Chomatographie gilt: THF Acetonitril Methanol Wasser E 0 =0,45 E 0 = 0,65 E 0 = 0,95 E 0 > 1

27 I.4.2 Die Eluotrope Reihe 27 Für die Reversed-Phase-(RP)-Chomatographie gilt: Wasser Methanol Acetonitril THF E 0 > 1 E 0 = 0,95 E 0 = 0,65 E 0 =0,45

28 I.4.3 Die isokratische-elution 28 Die Zusammensetzung der mobilen Phase ändert sich während der chromatographischen Trennung nicht: Abb. 16: Solventverlauf bei isokratischer Elution

29 I.4.4 Die Gradienten-Elution 29 Die Zusammensetzung der mobilen Phase ändert sich während der chromatographischen Trennung: Abb. 17: Solventverlauf bei Gradienten Elution

30 I.5 Die Pumpe 30 Abb. 18: Komponenten eines HPLC-Systems (Pumpe, Detektor, Injektionseinheit)

31 I.5 Die Pumpe 31 Auslaßventil Abb. 19: Kolbenpumpe Kolben Einlaßventil

32 I.5 Die Pumpe 32 Auslaßventil Kolben Kolbenantrieb Einlaßventil Abb. 20: Einkolben-Pumpe

33 I.5 Die Pumpe 33 Membran Kolben Hydraulik-Flüssigkeit Abb. 21: Diaphragma-Pumpe

34 I.6 Die Injektionseinheit 34 Injektionsnadel Probengläschen Ventil Abb. 22: Funktionsweise Autosampler Proben -Schleife

35 I.7 Der Detektor I.7.1 Der VWD-Detektor 35 Spalt Gitter Deuteriumlampe Flußzelle Abb. 23: Variabler Wellenlängendetektor (VWD) Jeweils nur eine Wellenlänge einstellbar

36 I.7.2 Der Diodenarray-Detektor 36 Spalt Gitter Photodioden Flußzelle Deuteriumlampe Abb. 24: Der Photodiodenarray-Detektor

37 I Der ISO-Plot 37 Absorption 0 mau 100 mau Wellenlänge [nm] Zeit [min] Abb. 25: Isoplot einer chromatographischen Trennung

38 I Der 3D-Plot Abb. 26: 3-D-Plot einer chromatographischen Trennung 38 Zeit [min] Wellenlänge [nm] Absorption [mau]

39 I.7.3 Der MS-Detektor 39 Ionenquelle Quadrupol Ionenfalle HPLC Abb. 27: Vereinfachte Darstellung eines HPLC-MS- Detektors

40 I Funktionsweise des LC-MS-Detektors 40 Abb. 28: Funktionsweise eines HPLC-MS-Detektors

41 I.8 Software 41 Abb. 29: Software ChemStation A [1635]

42 I.9 Die Methode des Internen Standards 42 Die Fläche eines Peaks ist mit der eingespritzten Stoffmenge bzw. der Masse m i des Stoffes proportional: Fläche der Komponente i a = m (1) i f i Responsefaktor der Komponente i i Masse der Komponente i

43 I.9 Die Methode des Internen Standards 43 Aber chromatographische Läufe sind nie 100% identisch. Es kann zu ganz normalen Schwankungen zwischen den Läufen kommen, wie: Geringe Unterschiede im Injektionsvolumen (Luftblasen, manuelle Injektion). Veränderungen des Säulenmaterials im Laufe des Meßbetriebes. Veränderungen der Umgebungstemperatur etc.

44 I.9 Die Methode des Internen Standards 44 Wie können diese Fehlerquellen eliminiert werden? Zugabe eines Tracers zur Stammlösung ( führt zur Kalibrierlösung) Zugabe des gleichen Tracers (gleiche Konzentration, gleiches Volumen) zu den Realproben (führt zu Probenlösungen).

45 I.4.1 Die Methode des Internen Standards 45 Beliebige Substanz Tracer Substanz f i = a i m i KF = i f (2) Tr f i f Tr = a Tr m K K m i atr = K K m a Tr i Kalibrierfaktor der Komponente i Tr (3) Tr = Tracer (4) K = Kalibrierlösung

46 I.4.1 Die Methode des Internen Standards 46 f Tr f i = m m x i x Tr a a x Tr x i (5) x = Probenlösung Auflösen nach Masse der Komponente i m x f = KF Tr i m i i x Tr (6) f i a x a Tr

47 Kapitel II Experimenteller Teil 47

48 Kapitel II: Experimenteller Teil 48 II.1 II.2 II.2.1 II II II II.2.2 II.3 Einleitung Versuchsdurchführung Vorbereitung der Lösungen Vorbereitung der Stammlösungen (siehe Praktikumsskript) Vorbereitung der Eich-(Kalibrierlösung) (siehe Praktikumsskript) Vorbereitung der Probenlösungen (siehe Praktikumsskript) Durchführung der HPLC-Analysen Aufgaben (Skript)

49 II Experimenteller Teil II.1 Einleitung O CH 3 H 3 C N N Coffein O N N CH 3 49

50 II Experimenteller Teil I.4.1 Durchführung der HPLC-Analyse 50 Abb. 30: Die Pumpen-Programmierung

51 II Experimenteller Teil I.4.1 Durchführung der HPLC-Analyse 51 Abb. 31: Die Programmierung des Injektionsvolumens

52 II Experimenteller Teil I.4.1 Durchführung der HPLC-Analyse 52 Abb. 32: Die Detektorprogrammierung (DAD)

53 II Experimenteller Teil I.4.1 Durchführung der HPLC-Analyse 53 Abb. 33: Die Programmierung des Säulenthermostaten

54 II Experimenteller Teil I.4.1 Durchführung der HPLC-Analyse 54 Abb. 34: Die Einstellung der Integrationsparameter

55 II Experimenteller Teil I.4.1 Durchführung der HPLC-Analyse 55 Abb. 35: Die Programmierung des Autosamplers

56 II Experimenteller Teil I.4.1 Durchführung der HPLC-Analyse 56 Abb. 36: Das Starten der Probensequence

57 II Experimenteller Teil I.4.1 Durchführung der HPLC-Analyse 57 Abb. 37: Der Menüpunkt: Data-Analysis

58 II Experimenteller Teil I.4.1 Durchführung der HPLC-Analyse 58 Abb. 38: Das Erstellen der Kalibriertabelle

59 II Experimenteller Teil I.4.1 Durchführung der HPLC-Analyse 59 Abb. 39: Das Erstellen des Quantitativen Reports

60 II Experimenteller Teil I.4.1 Durchführung der HPLC-Analyse 60 Abb. 40: Praktikumslabor Raum

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