Mentype DIPquant qpcr Manual

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1 43 Mentype DIPquant qpcr Manual Allelspezifische Quantifizierung des Chimärismus Status For research use only Made in Germany

2 2 Die Biotype Diagnostic GmbH entwickelt, produziert und vertreibt PCR-basierte Anwendungen für die medizinische Diagnostik. Unsere Mentype Test Kits garantieren höchste Qualitätsstandards. Für Informationen und Anregungen stehen wir Ihnen gerne zur Verfügung. Kontaktieren Sie uns oder besuchen Sie unsere Homepage

3 3 Mentype DIPquant qpcr Produktbeschreibung Mentype DIPquant Anwendungen sind quantitative Real-Time PCR (qpcr) Assays, die die allelspezifische und quantitative Analyse des molekularen Chimärismus unter Verwendung von Insertions/Deletions Polymorphismen (DIPs/INDELs) ermöglichen. Die Analyse des molekularen Chimärismus ist entscheidend, um das Anwachsen des Stammzelltransplantates zu überwachen bzw. um eine drohende Abstoßungsreaktion frühzeitig zu erkennen. Die molekulare Chimärismusanalyse erfolgt über die Insertions/Deletions Polymorphismen, welche im Vergleich zu anderen DNA- Sequenzmotiven, sehr gut für die Analyse mittels qpcr Technologie geeignet sind. Im Anschluss an die Identifizierung informativer DIP-Loci mit der Anwendung Mentype DIPscreen kann mit den entsprechenden Mentype DIPquant Monoplex Assays die quantitative Chimärismusanalyse erfolgen. Das flexible Assay Format erlaubt sowohl die Analyse einzelner Proben als auch großer Probenmengen mit minimalen Materialaufwand. Mit den allelspezifischen Mentype DIPquant Assays können 55 DIP Allele sowie zwei Y-chromosomale Regionen individuell adressiert werden. Als Referenz (REF) für die relative Quantifizierung dient ß-Globin. Die qpcr Parameter sind universell eingestellt, so dass die Analyse verschiedener empfängerspezifischen Mentype DIPquant Assays und mehrer Patientenproben parallel in einem qpcr-lauf erfolgen kann. Mentype DIPquant wurde auf den Geräten ABI Prism 7000, Roche LC480 und Qiagen Rotor-Gene validiert. Die Entwicklung, die Herstellung und der Vertrieb der Biotype Produkte ist zertifiziert nach DIN EN ISO 9001:2008.

4 4 Inhaltsverzeichnis 1. Beschreibung des Mentype DIPquant Überblick der Chimärismusanalyse mit den Mentype DIP-Produkten qpcr Amplifikation Ansetzen des Master Mixes Ansetzen der qpcr Amplifikation Geräteeinstellungen und Amplifikationsparameter Auswertung Quantifizierung Interpretation der Ergebnisse Referenzen... 22

5 5 1. Beschreibung des Mentype DIPquant Tabelle 1. Allelspezifische Mentype DIPquant qpcr Assays DIPscreen Loci FAM Panel DIPquant allelspezifische qpcr Assays Deletion Insertion (- Allel) (+ Allel) DIPscreen Loci BTY Panel DIPquant allelspezifische qpcr Assays Deletion Insertion (- Allel) (+ Allel) AM X HLD48 HLD48-I AM Y SRY / SMCY HLD114 HLD114-D HLD114-I HLD106 HLD106-D HLD106-I HLD304 HLD304-D HLD70 HLD70-D HLD70-I HLD131 HLD131-D HLD131-I HLD84 HLD84-D HLD84-I HLD38 HLD38-I HLD103 HLD103-D HLD103-I HLD82 HLD82-D HLD82-I HLD104 HLD104-D HLD104-I HLD116 HLD116-D HLD116-I Aktive Referenz HLD112 HLD112-I HLD307 HLD307-D HLD307-I HLD110 HLD133 HLD79 HLD110-I HLD133-I HLD79-I HLD105 HLD105-D HLD105-I HLD140 HLD140-I HLD163 HLD163-D HLD163-I BTG Panel HLD91 HLD91-D HLD91-I HLD23 HLD23-I HLD88 HLD88-D HLD88-I HLD101 HLD101-D HLD101-I HLD67 HLD67-D HLD67-I HLD301 HLD301-D HLD301-I HLD53 HLD53-D HLD53-I HLD97 HLD152 HLD152-D HLD97-I HLD128 HLD128-D HLD128-I HLD134 HLD134-D HLD134-I HLD305 HLD305-D HLD305-I Reference

6 6 Kit Inhalt Mentype DIPquant (100 Reaktionen) Nuklease-freies Wasser / Nuclease-free water 3.0 ml Reaktionsgemisch D / Reaction mix D 500 µl Primergemisch / Primer mix 250 µl Multi Taq2 DNA Polymerase / Multi Taq2 DNA polymerase 40 µl Bestellinformation Mentype DIPquant 25 Reaktionen Kat. No. vlg. Tab. 3 Mentype DIPquant 50 Reaktionen Kat. No. vlg. Tab. 3 Mentype DIPquant 100 Reaktionen Kat. No. vlg. Tab. 3 Lagerung Die Lagerung sollte bei 20 C erfolgen. Häufiges Auftauen und Einfrieren sollte vermieden werden. Das Primergemisch und die ROX Passive Reference sollten lichtgeschützt aufbewahrt werden. Es wird empfohlen die Kontroll-DNA General Positive Control getrennt von den PCR Reagenzien zu lagern. Die Haltbarkeit des Testkits ist auf dem Verpackungsetikett angegeben. Zusätzliche Reagenzien Für die qpcr-amplifikation und Probenvorbereitung benötigen Sie, neben den im Testkit enthaltenen Bestandteilen, folgende Reagenzien: Reagenz Lieferant Bestellnummer General Positive Control Biotype Diagnostic GmbH ROX Passive Reference Biotype Diagnostic GmbH

7 7 Warnungen und Sicherheitshinweise Folgende potenziell gefährliche Substanz ist in diesem Testkit enthalten: Kitbestandteil Chemikalie Gefahr Reaktionsgemisch D Sodium azide NaN 3 giftig beim Verschlucken, entwickelt bei Berührung mit Säure giftige Gase Bitte beachten Sie das Sicherheitsdatenblatt der Biotype Produkte, die wir Ihnen gerne auf Nachfrage zusenden. Für Sicherheitsdatenblätter von Reagenzien, die nicht im Testkit enthalten sind, kontaktieren Sie bitte den jeweiligen Hersteller. Qualitätssicherung Der gesamte Inhalt des Testkits wird einer intensiven Qualitätssicherung durch die Biotype Diagnostic GmbH unterzogen. Die Qualität der Testkits wird kontinuierlich überprüft, um die uneingeschränkte Verwendbarkeit zu belegen. Bitte kontaktieren Sie uns in allen Fragen zur Qualitätssicherung. Warenzeichen und Patente Mentype ist eingetragenes Warenzeichen der Biotype Diagnostic GmbH.

8 8 2. Überblick der Chimärismusanalyse mit den Mentype DIP-Produkten Probennahme DNA Isolation Identifizierung informativer Allele Selektion spezifischer Allele Mentype DIPscreen Relative Quantifizierung der Allele Analyse des Chimärismus Status Mentype DIPquant Abbildung 1 Von der Probennahme zur Analyse die Chimärismusanalyse mit den Anwendungen Mentype DIPscreen und Mentype DIPquant.

9 Protokoll für die PCR-Amplifikation und Auswertung 9 3. qpcr Amplifikation 3.1 Ansetzen des Master Mixes Die folgende Tabelle zeigt die Volumina der eingesetzten Kitbestandteile bei 5,0 µl Probenvolumen (Template-DNA) in einem Reaktionsvolumen von 25 µl. Berücksichtigen Sie bei der Anzahl der anzusetzenden qpcr-reaktionen die Positivund Negativkontrolle. Fügen Sie der Gesamtanzahl ein oder zwei Reaktionen hinzu, um Pipettierfehler zu kompensieren. Komponente Volumen Nuklease-freies Wasser 12,1 µl Reaktionsgemisch D* 5,0 µl Primergemisch 2,5 µl Multi Taq2 DNA Polymerase (hot start, 2,5 U/µL) 0,4 µl Gesamtvolumen des Master Mixes 20,0 µl * enthält Mg 2+, dntps, BSA, wenn nötig, fügen Sie ROX Passive Reference zu Alle Reagenzien sollten vor dem Ansetzen des Master Mixes gut gemischt (Vortex) und kurz zentrifugiert werden (ca. 10 s). Die Menge der einzusetzenden DNA richtet sich nach ihrer Konzentration. Für Referenzproben sind meist 5 µl ausreichend. Für kritische Proben mit geringer DNA-Konzentration kann die Templatemenge entsprechend erhöht werden. Die Menge an Nuklease-freiem Wasser ist entsprechend zu korrigieren, so dass das Gesamtvolumen des PCR-Ansatzes immer 25 µl beträgt. Lagern Sie Ihre DNA-Proben in Nuklease-freiem Wasser oder in verdünntem TE Puffer (10 mm Tris HCl, ph 8,0 und 1 mm EDTA), z.b. 0,1 x TE Puffer. Die Sensitivität der Mentype DIPquant Assays ist abhängig von der Qualität und Quantität der eingesetzten DNA. Das allelspezifische Primergemisch ist für den Einsatz von 250 ng aufgereinigter DNA und somit Zellen (6 pg / Zelle) optimiert. Unter Verwendung empfängerspezifischer Assays sollten bei < 43 Zyklen keine unspezifischen Signale in der Spender DNA auftreten. Das Detektionslimit der Mentype DIPquant Assays liegt bei 31 pg (5 Zellen) für homozygote DNA und 65 pg (10 Zellen) für heterozygote DNA. Erzielte Sensitivität beim Einsatz verschiedener DNA Mengen Einsatz DNA Menge (ng) Zelläquivalente (6 pg / Zelle) Sensitivitätslimit (%) für homozygote Allel-Konstellationen (Typ 1) Sensitivitätslimit (%) für heterozygote Allel-Konstellationen (Typ 2)

10 10 Der Einsatz von größeren DNA Mengen (> 250 ng bis 500 ng) kann der Steigerung der Sensitivität dienen, jedoch auch zur sporadischen Amplifikation unspezifischer Signale < 43 Zyklen in der Spender DNA führen. Wir empfehlen daher die Spender DNA vor der Transplantation zu testen um die Spezifität der Signale für diesen Fall abzusichern. ROX Passive Reference (Separate Komponente) Einige Real-Time PCR-Geräte benötigen die ROX Passive Reference, um Variationen, die z.b. gerätebedingt bei der Messung der verschiedenen Kavitäten entstehen, auszugleichen bzw. zu normalisieren. In diesem Fall muss vor dem Ansetzen des Master Mixes dem Reaktionsgemisch D (500 µl), das für das Gerät benötigte Volumen an ROX Passive Reference zugefügt werden. Das Komponentengemisch ist bei der Lagerung bei -20 C mindestens 6 Monate haltbar. Real-Time PCR-Geräte MX3000P / MX3005P / MX4000 ABI Prism 7500 / FAST 7500 ABI Prism 5700/ 7000/ 7300/ 7700/ 7900/ FAST 7900 ABI Step One/One Step Plus Mastercycler ep realplex I/II (Firmware 2.1 or below) Volumen ROX 11 µl in 500 µl REM D 3.85 µl in 500 µl REM D 55 µl in 500 µl REM D Positivkontrolle Für die Positivkontrolle verwenden Sie anstatt Template-DNA 5 µl der General Positive Control DNA" (1 ng/µl). Pipettieren Sie die Kontroll-DNA an Stelle der Template-DNA in die Reaktionsgefäße mit dem vorgelegten qpcr Master Mix. Da die Kopienzahl der spezifischen Allele in der General Positive Control variiert, entstehen, abhängig von dem verwendeten Mentype DIPquant-Assay, Cp/Ct -Werte zwischen 27 und 31 (siehe Tabelle 1). Negativkontrolle Als Negativkontrolle pipettieren Sie 5 µl Nuklease-freies Wasser an Stelle der Template-DNA in die Reaktionsgefäße mit dem vorgelegten qpcr Master Mix. Template-DNA Das Detektionslimit und die Sensitivität der Mentype DIPquant Assays ist abhängig von der Qualität und Quantität der eingesetzten Template-DNA. Wurde DNA aus peripherem Blut isoliert, sollten für optimale Ergebnisse 250 ng DNA eingesetzt werden. Wurde die DNA aus sortierten Zellpopulationen isoliert, sollte die DNA Menge entsprechend den DNA Ausbeuten angepasst werden. In Abhängigkeit von der angewendeten Quantifizierungsmethode kann der Messwert der DNA-Konzentration variieren, so dass die optimale DNA-Menge ggf. anzugleichen ist.

11 Ansetzen der qpcr Amplifikation Pipettieren Sie 20 µl des qpcr Master Mixes in die Reaktionsgefäße (optical tubes) oder in die Multi-well Platte (optical multi-well). Für die Analyse sollten, wenn für die eingesetzten Geräte möglich, weiße PCR-Platten oder Reaktionsgefäße verwendet werden, da hierdurch Überstrahlungen von Kavität zu Kavität weitestgehend eliminiert werden. Durch die verbesserte Detektion der Fluoreszenz kann die Sensitivität des Assays gesteigert werden. Empfohlenes Setup Für die relative Quantifizierung des Chimärismus wird das Ansetzen von vier verschiedenen qpcr Assays empfohlen: Eines für die Aktive Referenz (REF) und drei verschiedene empfängerspezifische Allele (Allele of Interest, AOI). Wir empfehlen für die Reaktionsansätze (Aktive Referenz und empfängerspezifische Assays) je zwei Replikate, sowie für jeden Assay eine negative (NTC) und positive Kontrolle (PC) mitzuführen. Ist die DNA Menge oder die Anzahl der empfängerspezifischen Allele limitiert, ist eine Analyse mit nur zwei empfängerspezifischen Allelen (allele of interest, AOI) möglich. Quantifizierung vor der Transplantation (pre-hsct) Um die Analyse zu kalibrieren, muss die Empfänger DNA, die vor der Transplantation isoliert wurde (Kalibrator), zusammen mit dem Referenz-Gen und dem jeweiligen empfängerspezifischen qpcr Assay, analysiert werden. Der Wert dieser Quantifizierung wird als 100 % Empfänger-Level gesetzt. Um die Spezifität der empfängerspezifischen qpcr Assays abzusichern, kann optional auch eine Analyse der Spender DNA durchgeführt werden. Dies entspricht dem 0 % Empfänger-Level. Beispiel für das Setup einer Multi-well Platte vor Transplantation (Kalibrator) AOI-1 AOI-2 AOI-3 REF Empfänger Empfänger Empfänger Rep. 1 Rep. 1 Rep. 1 Rep. 1 Rep. 2 Rep. 2 Rep. 2 Rep. 2 NTC REF NTC AOI-1 NTC AOI-2 NTC AOI-3 PC REF PC AOI-1 PC AOI-2 PC AOI-3 AOI-1 Spender AOI-2 Spender AOI-3 Spender Rep. 1 Rep. 1 Rep. 1 Rep. 2 Rep. 2 Rep. 2 optionale Spender-Kontrollen

12 12 Quantifizierung nach Transplantation / Monitoring (post-hsct) Das Chimärismus-Monitoring sollte mit Patienten DNA erfolgen, die frisch zu den jeweiligen Monitoring-Zeitpunkten isoliert wurde. Für eine sichere Analyse sollten die Aktive Referenz, drei empfängerspezifische Allele, sowie Positiv- und Negativkontrollen mitgeführt werden (vgl. oben). Beispiel für das Setup einer Multi-well Platte nach Transplantation (Monitoring)* AOI-1 AOI-2 AOI-3 REF Empfänger Empfänger Empfänger Rep. 1 Rep. 1 Rep. 1 Rep. 1 Rep. 2 Rep. 2 Rep. 2 Rep. 2 NTC REF NTC AOI-1 NTC AOI-2 NTC AOI-3 PC REF PC AOI-1 PC AOI-2 PC AOI-3 * die Anzahl der NTCs und PCs kann im Falle der retrospektiven Analyse von Proben reduziert werden. Nach dem Pipettieren sollten die Reaktionsgefäße bzw. die Multi-well Platten verschlossen werden (optical caps, optical sealings). Zentrifugieren Sie die Reaktionsansätze kurz und geben Sie diese anschließend zur Analyse in das Gerät.

13 Geräteeinstellungen und Amplifikationsparameter Erstellen Sie mit den unten aufgeführten Parametern das Protokoll für die qpcr Amplifikation und Detektion. Gerätespezifische Einstellungen entnehmen Sie bitte dem Handbuch der jeweiligen Gerätehersteller. Detektionsparameter 6-FAM dient als Reporter-Fluoreszenzfarbstoff für alle Assays. Achten Sie auf die Auswahl des richtigen Filtersets in der Software des Real-Time PCR-Gerätes. Falls nötig wählen Sie ROX als passive reference dye für die Normalisierung des qpcr-gerätes (vlg. 3.1). qpcr Amplifikationsparameter* Um die Multi Taq2 DNA Polymerase zu aktivieren und die Bildung von unspezifischen Amplifikationsprodukten zu unterdrücken, sollte unbedingt ein hot start durchgeführt werden. Temperatur Zeit 94 C 4 min (hot start um die Multi Taq2 DNA Polymerase zu aktivieren) 94 C 30 s 62 C 45 s 45 Zyklen * Validiert mit Roche Light Cycler LC480 (mit Standard Heizraten von ca. 4,4 C/sec und Kühlraten von 2,2 C/sec) und ABI 7000 (9600 Ramping deaktiviert). Die Datenaufnahme sollte während der Annealing- und Elongationsphase bei 62 C erfolgen. Erstellen Sie eine Probenliste (Sample-Sheet) mit den gewählten Einstellungen. Für die Quantifizierung mit der Software Chimeris TM Monitor empfehlen wir den jeweiligen Namen des verwendeten Mentype DIPquant Assays im Probennamen mitzuführen (z.b. Patient 300_Tag28_HLD104-D_Rep.1). Dadurch wird eine automatische Assay Erkennung in der Software Chimeris TM Monitor unterstützt.

14 14 4. Auswertung Daten Analyse Betrachten Sie die Amplifikationskurven des gesamten qpcr Laufes. Der detailierte Ablauf der Rohdatenanalyse ist vom verwendeten Real-Time Gerät abhängig. Die Definition des Schwellenwertes baseline noise levels sollte entweder automatisch erfolgen, oder auf bestimmte Zyklen vordefiniert werden (z.b. 3-15). Verwenden Sie die NTC um den jeweiligen Schwellenwert zu ermitteln. Da die Cp/Ct Methode zur Quantifizierung eingesetzt wird, haben individuell für den Schwellenwert gesetzte Werte keinen Einfluss auf die Ergebnisse. Um die Analyse mit Chimeris TM Monitor Software durchzuführen, benötigen Sie einen Datenexport als tab.delimited txt. Informationen für den Datenexport sowie die Datenverarbeitung entnehmen Sie bitte dem Handbuch Ihres Real-Time Geräteherstellers. Bitte exportieren Sie den Probennamen Sample name und die Cp/Ct Werte für die anschließenden Berechnungen. Prüfen der Ergebnisse Die qpcr war erfolgreich, wenn die Cp/Ct Werte der positiven Kontrolle < 33 Zyklen sind (vgl. Tab. 2) und die negative Kontrolle keine Amplifikation < 45 Zyklen aufweist. Unter Verwendung von Spender DNA zur Kontrolle der Assayspezifität sollten keine Signale < 43 Zyklen detektierbar sein.

15 15 5. Quantifizierung Die Quantifizierung der informativen DIP-Loci und deren Monitoring kann mit der Chimeris TM Monitor Software der Biotype Diagnostic GmbH erfolgen. Die Instruktionen entnehmen Sie bitte dem entsprechenden Software-Handbuch. Sollten Sie die Daten manuell auswerten, wenden Sie bitte die Methode der relativen Quantifizierung an. Individuell gesetzte Schwellenwerte während der Rohdatenanalyse haben keinen Einfluss auf die Quantifizierung mittels der Cp/Ct Methode. Verwenden Sie die NTC, um die entsprechenden Schwellenwerte zu ermitteln. Berechnung Quantifizierung der pre-hsct Proben (Cp entspricht Ct) 1. Berechnen Sie die individuellen Cp Werte für die Referenz (REF) und die informativen Allele Alleles of Interest (AOI) für die Empfänger DNA 2. Berechnen Sie den Cp für jede AOI zur REF ( Cp C = Cp AOI Cp REF) 3. Cp gibt den Wert des Kalibrators ( Cp C) in der post-hsct Berechnung (100 % Empfänger) Quantifizierung der Post-HSCT Proben (Cp entspricht Ct) 1. Berechnen Sie die individuellen Cp Werte für die Referenz (REF) und die informativen Allele Alleles of Interest (AOI) für die Patienten DNA 2. Berechnen Sie Cp für jedes AOI zur REF ( Cp C = Cp AOI Cp REF) 3. Dieser Cp Wert wird für die Berechnung des unbekannten Status ( Cp U) verwendet 4. Berechnen Sie Cp für die Quantifizierung des Chimärismus ( Cp = Cp U Cp C) 5. Berechnen Sie die % der Empfänger-Komponente in Abhängigkeit von der Effizienz der qpcr; % Empfänger = ((1+E) -( Cp) ) x 100. Ist die qpcr Effizienz 100 % verwenden sie die folgende Formel: (2 -( Cp) ) x 100.

16 16 Tabelle 2: Erwartet Cp/Ct Werte für die Positivkontrolle und berechnete Assay Effizienzen DIPquant Assay Erwarteter Cp/Ct Wert bei 5 ng GPC* qpcr Effizienz (E)** Reference 27 0,95 SRY 29 1,00 SMCY 29 1,00 HLD23-I 27,5 1,00 HLD38-I 28 1,00 HLD48-I 28,5 1,00 HLD53-D 30 1,00 HLD53-I 29 1,00 HLD67-D 28 0,98 HLD67-I 30 0,98 HLD70-D 28 1,00 HLD70-I 28 0,97 HLD79-I 28,5 1,00 HLD82-D 28 1,00 HLD82-I 27,5 1,00 HLD84-D 30,5 0,93 HLD84-I 29 0,95 HLD88-D 29 1,00 HLD88-I 27,5 1,00 HLD91-D 28 0,92 HLD91-I 27 0,99 HLD97-I 28 1,00 HLD101-D 28 0,97 HLD101-I 30 1,00 HLD103-D 29 0,99 HLD103-I 28,5 0,91 HLD104-D 27,5 1,00 HLD104-I 29 1,00 HLD105-D 27,5 1,00 HLD105-I 28 0,95

17 17 DIPquant Assay Erwarteter Cp/Ct Wert mit 5 ng GPC* qpcr Effizienz (E)** HLD106-D 29,5 1,00 HLD106-I 30 0,92 HLD110-I 28,5 0,97 HLD112-I 28 1,00 HLD114-D 28 0,90 HLD114-I 29 1,00 HLD116-D 28 0,93 HLD116-I 27 1,00 HLD128-D 29 0,92 HLD128-I 28 1,00 HLD131-D 27,5 0,95 HLD131-I 29 0,90 HLD133-I 28 1,00 HLD134-D 27 0,95 HLD134-I 27,5 0,92 HLD140-I 30 1,00 HLD152-D 29,5 1,00 HLD163-D 27 1,00 HLD163-I 28,5 1,00 HLD301-D 30 1,00 HLD301-I 28,5 1,00 HLD304-D 30 1,00 HLD305-D 27,5 1,00 HLD305-I 29 0,98 HLD307-D 27,5 1,00 HLD307-I 29,5 0,92 HLD310-D 28 0,90 HLD310-I 28 0,90 * Absolute Quantifizierung auf dem Roche Light Cycler LC480; Analyse erfolgte mit der 2 nd Derivative Maximum Methode ** Experimentell bestimmt durch serielle Verdünnungsreihe homozygoter DNA, berechnete Werte > 1,00 wurde als 1,00 gesetzt.

18 18 6. Interpretation der Ergebnisse Geringe Signalstärke oder kein Signal detektiert Ein oder mehrere Komponenten wurden dem Reaktionsansatz nicht beigefügt: Überprüfen Sie die Amplifikation der positiven Kontrolle und wiederholen Sie die ggf. die qpcr. Zur Analyse wurde das falsche Assay verwendet: Vergewissern Sie sich, dass die allelspezifischen Assays mit den empfängerspezifischen Allelen kompatibel sind. Suboptimale qpcr Bedingungen:Überprüfen Sie die qpcr Einstellungen. Stellen Sie sicher, dass die Aktivierung der Multi Taq2 DNA Polymerase bei 94 C erfolgt ist. Überprüfen Sie die Annealing- sowie die Elongationstemperatur und stellen Sie sicher, dass die Heizrate des Gerätes auf 4 C/s und die Kühlrate des Gerätes auf 2 C/s gesetzt ist. Die PCR wurde inhibiert: Aus der DNA-Extraktion wurden PCR-Inhibitoren nicht vollständig abgereinigt. Stellen Sie daher sicher, dass die DNA-Reinigung bei der Extraktion sorgfältig erfolgt. Reinigen Sie die DNA erneut oder verdünnen Sie das Template. Wiederholen Sie die qpcr mit der aufgereinigten/verdünnten DNA. Die Daten Sammlung ist fehlgeschlagen: Vergewissern Sie sich, dass die Fluoreszenz- Datensammlung zum richtigen Zeitpunkt im richtigen Fluoreszenzkanal erfolgte. Überprüfen Sie die Einstellungen Ihres Gerätes im Hinblick auf die im Assay verwendete Fluoreszenzfarbe (FAM und ROX). Probleme der Basislinie oder des Schwellenwertes: Setzen Sie den Schwellenwert oberhalb des unspezifischen Backgrounds, um akkurate Cp/Ct-Werte zu erhalten. Verwenden Sie hierfür, die in dem Handbuch Ihres PCR-Geräteherstellers angeführte Vorgehensweise. Wenn möglich, nehmen Sie die Einstellungen für die Basislinie und den Schwellenwert manuell vor. Degradierung der Template-DNA: Die Degradierung der DNA kann während der Probenaufarbeitung und während der Lagerung erfolgen. Lagern Sie die DNA in 1x oder 0,1x TE oder Nuklease-freiem Wasser. Verwenden Sie die Kontroll-DNA, um das Gesamtverhalten des Assays zu überprüfen. Degradierung der qpcr-komponenten: Überprüfen Sie die Haltbarkeit der eingesetzten Komponenten, sowie die Lagerungsbedingungen. Vermeiden Sie häufiges Einfrieren und Auftauen des Primergemisches und stellen Sie sicher, dass die Lagerung der Komponenten bei -20 C erfolgte.

19 19 Schwankungen der Signalstärke innerhalb der Replikate Pipettierfehler: Sie vermeiden Pipettierfehler durch eine regelmäßige Überprüfung Ihres Pipettensatzes. Der Einsatz von aerosol-vermeidenden Filterspitzen kann zur Unterbindung von Pipettierungenauigkeiten ebenfalls beitragen. Variationen im Master Mix: Fügen Sie beim Ansetzen des Master Mixes 1-2 Reaktionen extra hinzu, um Pipettierungenauigkeiten auszugleichen. Mischen Sie die Komponenten sorgfältig durch kurzes Vortexen und kurzes Abzentrifugieren (10 s). Pipettieren Sie mindestens 5 µl Template-DNA. Die PCR wurde inhibiert: Während der DNA-Extraktion wurden PCR-Inhibitoren nicht vollständig abgereinigt. Stellen Sie daher sicher, dass die Reinigung bei der DNA- Extraktion sorgfältig erfolgt. Reinigen Sie die DNA erneut oder verdünnen Sie das Template. Wiederholen Sie die qpcr mit der aufgereinigten/verdünnten DNA. Die Basislinie oder der Schwellenwert wurden falsch gesetzt: Setzen Sie den Schwellenwert oberhalb des unspezifischen Backgrounds, um akkurate Cp/Ct-Werte zu erhalten. Verwenden Sie hierfür, die in dem Handbuch Ihres qpcr-geräteherstellers angeführte Vorgehensweise. Wenn möglich, nehmen Sie die Einstellungen für die Basislinie und den Schwellenwert manuell vor. Zu niederiger/hoher ROX Level gewählt: Manche Real-Time Geräte benötigen die ROX-Passive Reference für die Normalisierung der Well- zu Well Variationen die durch z.b. Pipettierungenauigkeiten oder Gerätevariationen entstehen. Vergewissern Sie sich, dass die, für Ihr Gerät optimale Menge an ROX Passive Reference, dem Reaktionsgemisch D vor Ansetzen des Master Mixes beigefügt wurde. Geringe Sensitivität: Die Sensitivität der Mentype DIPquant Assays wurde auf mindestens 5 10 Zell-Äquivalente bestimmt. Der Einsatz von geringeren DNA Mengen kann die Sensitivität und Reproduzierbarkeit innerhalb der Replikate herabsetzen. Signale in der negativen Kontrolle: Um Kontaminationen auszuschließen, verwenden Sie barrier tips oder screw-cap tubes. Lassen Sie eine erneute qpcr mit dem eingesetzten Nuklease-freiem Wasser laufen. Lagern Sie pre- und post-pcr Reagenzien getrennt voneinander. Pipettieren Sie den Reaktionsansatz und die DNA wenn möglich in unterschiedlichen Räumlichkeiten. Signale der Empfänger-spezifischen Assays in der Donor DNA Einsatz von zu großen Mengen (> 250 ng) an Template-DNA: Reduzieren Sie die Template-DNA Menge auf 250 ng. Die maximal eingesetzte DNA- Menge sollte 500 ng nicht überschreiten. Auftreten falsch negativer Signale: In manchen Fällen kann es durch Mutation, die in der Primer-Bindungsstellen auftreten, zu Allelic-dropouts kommen. Aus der Genotypisierung mit dem Mentype DIPscreen könnten so falsch negativen Ergebnissen resultieren. Da die Primer-Bindungsstellen der Mentype DIPquant

20 20 Assays sich von denen des Mentype DIPscreen unterscheiden, können in der qpcr dennoch positive, allelspezifische Signale amplifiziert werden. Die Amplifikation zeigt zu niedrige oder keine ROX Passive Reference Signale Manche Real-Time Geräte benötigen die ROX Passive Reference für die Normalisierung der Well- zu Well Variationen, die durch z,b, Pipettierungenauigkeiten oder Gerätevariationen entstehen. Vergewissern Sie sich, dass die, für Ihr Gerät optimale Menge an ROX Passive Reference, dem Reaktionsgemisch D vor Ansetzen des Master Mixes beigefügt wurde. Tabelle 3: Bestellinformationen für allelspezifische DIPquant Assays DIPquant Assay 25 Reaktionen 50 Reaktionen 100 Reaktionen Reference SRY SMCY HLD23-I HLD38-I HLD48-I HLD53-D HLD53-I HLD67-D HLD67-I HLD70-D HLD70-I HLD79-I HLD82-D HLD82-I HLD84-D HLD84-I HLD88-D HLD88-I HLD91-D HLD91-I HLD97-I HLD101-D HLD101-I HLD103-D HLD103-I

21 21 HLD104-D HLD104-I HLD105-D HLD105-I HLD106-D HLD106-I HLD110-I HLD112-I HLD114-D HLD114-I HLD116-D HLD116-I HLD128-D HLD128-I HLD131-D HLD131-I HLD133-I HLD134-D HLD134-I HLD140-I HLD152-D HLD163-D HLD163-I HLD301-D HLD301-I HLD304-D HLD305-D HLD305-I HLD307-D HLD307-I HLD310-D HLD310-I

22 22 7. Referenzen Alizadeh M, Bernard M, Danic B, Dauriac C, Birebent B, Lapart C, Lamy T, Le Prise PY, Beauplet A, Bories D, Semana G, Quelvennec E, (2002) Quantitative assessment of hematopoietic chimerism after bone marrow transplantation by realtime quantitative polymerase chain reaction. Blood 99, Chen DP, Tseng CP, Wang WT, Wang MC, Tsai SH, Sun CF (2011) Real-time biallelic polymorphism-polymerase chain reaction for chimerism monitoring of hematopoietic stem cell transplantation relapsed patients. Clin Chim. Acta 412, Harries LW, Wickham CL, Evans JC, Rule SA, Joyner MV, Ellard S (2005) Analysis of haematopoietic chimaerism by quantitative real-time polymerase chain reaction. Bone Marrow Transplant, 35, Masmas TN, Madsen HO, Petersen SL, Ryder LP, Svejgaard A, Alizadeh M, Vindelov LL (2005) Evaluation and automation of hematopoietic chimerism analysis based on real-time quantitative polymerase chain reaction. Biol Blood Marrow Transplant, 11, Mills RE, Luttig CT, Larkins CE, Beauchamp A, Tsui C, Pittard WS, Devine SE (2006) An initial map of insertion and deletion (INDEL) variation in the human Genome. Genome Res 16 (9), Qin XY, Li GX, Qin YZ, Wang Y, Wang FR, Liu DH, Xu LP, Chen H, Han W, Wang JZ, Zhang XH, Li JL, Li LD, Liu KY, Huang XJ (2011) Quantitative assessment of hematopoietic chimerism by quantitative real-time polymerase chain reaction of sequence polymorphism systems after hematopoietic stem cell transplantation. Chin Med J (Engl.) 124, Weber JL, David D, Heil J, Fan Y, Zhao C, Marth G (2002) Human diallelic insertion/deletion polymorphisms. Am J Hum Genet 71(4), Wilhelm J, Reuter H, Tews B, Pingoud A, Hahn M (2002) Detection and quantification of insertion/deletion variations by allele-specific real-time PCR: application for genotyping and chimerism analysis. Biol Chem 383,

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