Multicolour Banding zur Abklärung intrachromosomaler Aberrationen

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1 Aus dem Zentrum für Humangenetik Geschäftsführender Direktor: Prof. Dr. rer. nat. Karl-Heinz Grzeschik des Fachbereichs Medizin der Philipps-Universität Marburg in Zusammenarbeit mit dem Universitätsklinikum Gießen und Marburg GmbH, Standort Marburg Multicolour Banding zur Abklärung intrachromosomaler Aberrationen INAUGURAL-DISSERTATION zur Erlangung des Doktorgrades der gesamten Humanmedizin dem Fachbereich Medizin der Philipps-Universität Marburg vorgelegt von Ingo Zimmermann aus Lennestadt Marburg, 2007

2 Angenommen vom Fachbereich Medizin der Philipps-Universität Marburg am: Gedruckt mit Genehmigung des Fachbereichs. Dekan: Prof. Dr. Bernhard Maisch Referent: PD Dr. Barbara Fritz Korreferent: Prof. Dr. Guntram Suske

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4 Inhaltsverzeichnis 1. Einleitung Chromosomen des Menschen Veränderungen im menschlichen Chromosomensatz Numerische Chromosomenaberrationen Strukturelle Chromosomenaberrationen Interchromosomale Aberrationen Intrachromosomale Aberrationen Historische Entwicklung der Zytogenetik Klassische chromosomale Färbe- und Bänderungstechniken In Situ Hybridisierung (ISH) Fluoreszenz in situ Hybridisierung (FISH) Historisches FISH an Interphase-Zellkernen Comparative genomische Hybridisierung (CGH) Heutiger Stand Multicolour FISH Historisches Multiplex-fluorescence in situ hybridization (M-FISH) Spectral Karyotyping (SKY) Combined Binary Ratio labelling (COBRA) High Resolution Multicolour Banding (mband) Herstellung der Sonden Auswertung Ziel der Arbeit 23

5 Inhaltsverzeichnis 2 Material und Methoden Untersuchungsmaterial Chemikalien Geräte und Zubehör Lymphozytenkultivierung Lösungen und Puffer Experimentelle Methodik Chromosomenpräparation und GTG bänderung Lösungen und Puffer Experimentelle Methodik Behandlung der Lymphozytenkultur in hypotoner Lösung Fixierung und Präparation der Chromosomen Chromosomenbänderung Zytogenetischer Befund CBG-Färbung zur Darstellung der Zentromerregion Lösungen und Puffer Experimentelle Methodik mband Lösungen, Puffer und Sonden Lösungen und Puffer Sonden Experimentelle Methodik der Hybridisierung mit mband-sonden Vorbereitung der Objektträger Denaturierung der aufgebrachten Chromosomensuspension Vorbereitung und Denaturierung der Sonden Hybridisierung Posthybridisierungsschritte und Gegenfärbung Auswertung der fluoreszenzmarkierten Metaphasen 34

6 Inhaltsverzeichnis 2.9 Ergänzende Methoden zur Verifizierung und weiteren Abklärung der Ergebnisse FISH Mikrodissektion mit Reversem Painting Präparation von geeigneten Metaphaseplatten Dissektion der zu analysierenden Chromosomen/Chromosomensegmente Herstellung einer DNA-Sonde Aufbringen der durch Mikrodissektion generierten Sonden (Reverses Painting) Auswertung CGH-Analyse Vorbereitung und Denaturierung der Chromosomen DNA-Präparation aus Blut Markierung der genomischen DNA (Nicktranslation) Herstellung der Hybridisierungsmischung und Hybridisierung Waschung und Detektion Auswertung mit Digitaler Bildanalyse 40 3 Ergebnisse Qualität der Hybridisierungen mit mband-sonden Deletionen Deletion 7p (Fall 07-01) Klinische Befunde Zyto- und molekularzytogenetische Untersuchungen mband-analyse Zusammenfassung der Ergebnisse Deletion 15 (Fall 15-03) Klinische Befunde Zyto- und molekularzytogenetische Untersuchungen mband-analyse Zusammenfassung der Ergebnisse 49

7 Inhaltsverzeichnis 3.3 Duplikationen Direkte Duplikation 2p (Fall 02-03) Klinische Befunde Zyto- und molekularzytogenetische Untersuchungen mband-analyse Zusammenfassung der Ergebnisse Direkte Duplikation 4p (Fall 04-01) Klinische Befunde Zyto- und molekularzytogenetische Untersuchungen mband-analyse Zusammenfassung der Ergebnisse Duplikation 8p (Fälle und 08-03) Klinische Befunde Zyto- und molekularzytogenetische Untersuchungen mband-analyse Zusammenfassung der Ergebnisse Duplikation 17p (Fall 17-01) Klinische Befunde Zyto- und molekularzytogenetische Untersuchungen mband-analyse Zusammenfassung der Ergebnisse Duplikation 18q (Fälle 18-02, pränatal und 18-01, Mutter) Klinische Befunde Zyto- und molekularzytogenetische Untersuchungen mband-analyse Zusammenfassung der Ergebnisse Inverse Duplikation 19 (Fälle 19-01,pränatal, 19-02, Mutter und 19-03, Vater) Klinische Befunde Zyto- und molekularzytogenetische Untersuchungen mband-analyse Zusammenfassung der Ergebnisse Duplikation 9 durch überzähliges Markerchromosom (Fall 09-04) Klinische Befunde Zyto- und molekularzytogenetische Untersuchungen mband-analyse Zusammenfassung der Ergebnisse 69

8 Inhaltsverzeichnis Komplexes Rearrangement mit inverser Duplikation 8p (Fall 08-01) Klinische Befunde Zyto- und molekularzytogenetische Untersuchungen mband-analyse Zusammenfassung der Ergebnisse Inversionen Perizentrische Inversion 2 (Fall 02-01, Sohn und Fall 02-02, Mutter) Klinische Befunde Zyto- und molekularzytogenetische Untersuchungen mband-analyse Zusammenfassung der Ergebnisse Parazentrische Inversion 2p (Fall 02-04, pränatal und Fall 02-05) Klinische Befunde Zyto- und molekularzytogenetische Untersuchungen mband-analyse Zusammenfassung der Ergebnisse Komplexes Rearrangment mit Inversion 17p (Fälle und 17-03) Klinische Befunde Zyto- und molekularzytogenetische Untersuchungen mband-analyse Zusammenfassung der Ergebnisse X-chromosomale Aberrationen Ringchromosom X (Fall X-02) Klinische Befunde Zyto- und molekularzytogenetische Untersuchungen mband-analyse Zusammenfassung der Ergebnisse Ringchromosom X (Fall X-06) Klinische Befunde Zyto- und molekularzytogenetische Untersuchungen mband-analyse Zusammenfassung der Ergebnisse 89

9 Inhaltsverzeichnis Ringchromosom X (Fall X-04) Klinische Befunde Zyto- und molekularzytogenetische Untersuchungen mband-analyse Zusammenfassung der Ergebnisse Markerchromosom X (Fall X-05) Klinische Befunde Zyto- und molekularzytogenetische Untersuchungen mband-analyse Zusammenfassung der Ergebnisse Isochromosom X (Fall X-03) Klinische Befunde Zyto- und molekularzytogenetische Untersuchungen mband-analyse Zusammenfassung der Ergebnisse Komplexes, X-chromosomales Rearrangement (Fall X-01) Klinische Befunde Zyto- und molekularzytogenetische Untersuchungen mband-analyse Zusammenfassung der Ergebnisse Diskussion Multicolour Banding Qualität der Hybridisierungen mit mband-sonden Qualität der Auswertung der mband-analysen Sensitivität der mband-analyse Sensitivität in Abhängigkeit von der Art der intrachromosomalen Aberration Falldiskussionen Partielle Trisomie 4p Partielle Monosomie 15q mit Neozentromerformation Partielle Trisomie 18q bei unauffälligem Phänotyp Varianten des Ullrich-Turner-Syndroms 126

10 Inhaltsverzeichnis 5 Zusammenfassung Ausblick Literaturverzeichnis Anhang Trademarks Sondenverzeichnis Verzeichnis der akademischen Lehrer Danksagung 153

11 Einleitung Einleitung Die vorliegende Arbeit beschäftigt sich mit Veränderungen im menschlichen Chromosomensatz, speziell mit intrachromosomalen Aberrationen. Diese wurden mit High Resolution Multicolour Banding (mband) untersucht, einer Methode, welche auf dem grundlegenden Prinzip der Fluoreszenz in situ Hybridisierung (FISH) beruht. 1.1 Chromosomen des Menschen Der Mensch besitzt 46 Chromosomen, von denen 44 als Autosomen bezeichnet werden. Von diesen können immer zwei nach Größe und Form zu Paaren (Homologen) angeordnet werden, so dass sich 22 Autosomen- bzw. Homologenpaare ergeben, die sowohl beim weiblichen als auch beim männlichen Geschlecht vorhanden sind. Dazu kommen bei der Frau zwei identische Chromosomen, die beiden X-Chromosomen, und beim Mann ein X- und ein Y-Chromosom, die auch als Geschlechtschromosomen oder Gonosomen bezeichnet werden. Je nach der endständigen oder mehr oder weniger mittelständigen Lage des Zentromers spricht man von akrozentrischen, submetazentrischen und metazentrischen Chromosomen. Dabei wird der kurze Arm als p-arm und der lange Arm als q-arm bezeichnet. Nach diesen Kriterien ist eine Unterteilung in sieben Chromosomengruppen (A-G) möglich. Abbildung 1: Normaler männlicher Chromosomensatz. Die Buchstaben zeigen, welche Chromosomen welcher Gruppe zugeordnet sind (Zentrum für Humangenetik, Marburg).

12 Einleitung Liegt in einem Chromosomensatz nur je eines der beiden homologen Chromosomen vor (n = 23), wie es bei den Keimzellen des Menschen der Fall ist, spricht man von einem haploiden Chromosomensatz. Liegen beide Partner des homologen Paares vor, wie in allen übrigen Zellen des Menschen, spricht man von einem diploiden Chromosomensatz (n = 46). 1.2 Veränderungen im menschlichen Chromosomensatz Im menschlichen Chromosomensatz kann es zu unterschiedlichen Veränderungen kommen, die teilweise mit definierten Krankheitsbildern assoziiert sind. Insgesamt sind Chromosomenstörungen beim Menschen keine Seltenheit. Etwa 0,8% aller Neugeborenen weisen Chromosomenanomalien auf (Gardner & Sutherland, 2004). Die Gesamtrate an Chromosomenveränderungen in Aborten liegt deutlich höher bei ca. 30%. Die Häufigkeit von chromosomalen Störungen bei Frühaborten der Schwangerschaftswoche wird sogar mit mehr als 50% angegeben (Gardner & Sutherland, 2004). Chromosomenanomalien werden aufgrund ihrer Erscheinungsform in numerische und strukturelle Veränderungen eingeteilt Numerische Chromosomenaberrationen Bei numerischen Chromosomenanomalien ist die Chromosomenzahl verändert. Es werden drei Arten numerischer Chromosomenanomalien unterschieden: Polyploidie, Aneuploidie und Mixoploidie. Die häufigste Form der Polyploidie (Vervielfachung des Chromosomensatzes) ist die Triploidie. Sie entsteht entweder als Diandrie durch Befruchtung einer Eizelle durch zwei Spermien (Dispermie), seltener durch Befruchtung einer haploiden Eizelle durch ein diploides Spermium oder als Digynie durch Befruchtung einer diploiden Eizelle durch ein haploides Spermium. Eine Tetraploidie (Vervierfachung des Chromosomensatzes) entsteht durch amitotischen Verlauf der ersten zygotischen Teilungen. Bei einer Aneuploidie besitzen diploide Zellen eine abnormale Zahl der beiden homologen Chromosomen eines bestimmten Chromosomenpaares. Ist ein Chromosom dreifach, vierfach, fünffach usw. vorhanden, spricht man von einer Trisomie, Tetrasomie, Pentasomie usw. Bei Verlust eines der homologen Chromosomen entsteht eine Monosomie. Dies kann entweder aufgrund fehlerhafter Trennung der Chromatiden (non-disjunction) während der Meiose oder der Mitose geschehen oder aber durch eine Anaphaseverzögerung (anaphase lag) mit anschließendem Verlust eines Chromosoms. Ursächlich für Aneuploidien sind überwiegend Fehlverteilungen der Chromosomen in den meiotischen Teilungen der mütterlichen Keimzellen. Weniger häufig treten diese in den paternalen Meiosen auf.

13 Einleitung Ein bekanntes klinisches Beispiel für eine Trisomie ist die Trisomie des Chromosoms 21, die als Down-Syndrom bezeichnet wird. Des Weiteren sind Trisomie 13 (Pätau-Syndrom) und Trisomie 18 (Edwards-Syndrom) zu nennen. Von einer Fehlverteilung der Chromosomen können auch die Geschlechtschromosomen betroffen sein. Eine Monosomie des Chromosoms X ist die Ursache des Ullrich-Turner-Syndroms (45,X). Ebenso können weitere numerische Chromosomenaberrationen die Gonosomen betreffen. So liegt beim Vorhandensein von drei X- Chromosomen ein Triple-X-Syndrom (47,XXX) oder bei zwei X und einem Y Chromosom ein Klinefelter-Syndrom (47,XXY) vor. Die Mixoploidie bezeichnet ein genetisches Mosaik, also ein Individuum, das aus zwei oder mehr unterschiedlichen Zelllinien einer oder sogar zwei Zygoten besteht (Chimärenstruktur). Als Entstehungsursache gelten mitotische Fehlverteilungen Strukturelle Chromosomenaberrationen Strukturelle Chromosomenanomalien entwickeln sich aufgrund von Chromosomenbrüchen. Je nachdem wie oft Chromosomen brechen, entstehen zwei oder mehr Bruchstücke. Bei deren Reparatur können Verluste oder falsche Wiederverbindungen der Bruchenden und somit unterschiedliche Arten struktureller Chromosomenanomalien entstehen. Abbildung 2 zeigt die häufigsten Chromosomenanomalien nach Bruchereignissen. Abbildung 2: Die wesentlichen Typen struktureller Chromosomenanomalien. In der Abbildung sind nicht alle anomalen Chromosomenstrukturen berücksichtigt (Strachan & Read 1996).

14 Einleitung Bei den strukturellen Chromosomenaberrationen werden balancierte von unbalancierten Strukturaberrationen unterschieden. Unbalancierte Strukturaberrationen weisen insgesamt einen Verlust oder Zugewinn von Chromosomensegmenten auf, was häufig mit einem auffälligen klinischen Bild (Phänotyp) assoziiert ist. Eine balancierte Strukturaberration führt in der Regel nicht zu einem klinisch auffälligen Phänotyp. Man unterscheidet weiterhin zwischen interchromosomalen und intrachromosomalen Strukturaberrationen Interchromosomale Aberrationen Bei den interchromosomalen Aberrationen handelt es sich um Chromosomenanomalien, bei denen zwischen Chromosomen unterschiedlicher Paare Segmente ausgetauscht werden. Dazu zählen reziproke, nicht-reziproke und Robertson-Translokationen. Bei einer reziproken Translokation kommt es zu einem Segmentaustausch zwischen zwei nicht homologen Chromosomen. Dazu muss bei jedem Chromosom ein Bruchereignis stattgefunden haben. Ein bekanntes Beispiel hierfür ist das Philadelphia-Chromosom, ein strukturell verändertes Chromosom 22 infolge einer Translokation zwischen Chromosom 22 und 9. Von einer nicht-reziproken Translokation spricht man, wenn ein Stück eines Chromosoms abbricht und auf ein anderes Chromosom übertragen wird, ohne dass dieses selbst ein Bruchstück überträgt. Die Robertson-Translokation ist die zentrische Fusion zweier akrozentrischer Chromosomen. Es entsteht ein Translokationschromosom aus zwei langen Armen zweier akrozentrischer Chromosomen. Das entsprechende Translokationsprodukt der beiden kurzen Arme der betreffenden Chromosomen ist in den Zellen nicht mehr auffindbar, so dass ein Chromosomensatz mit nur 45 Chromosomen vorliegt. Dennoch sind Betroffene meist phänotypisch unauffällig. Da dieses strukturell veränderte Chromosom bei der Keimzellreifung zufällig verteilt wird, ergibt sich aus einer solchen Translokation ein erhöhtes Risiko für einen unbalancierten Karyotyp bei den Nachkommen Intrachromosomale Aberrationen Bei intrachromosomalen Aberrationen handelt es sich um strukturelle Anomalien innerhalb eines Chromosoms ohne Beteiligung weiterer Chromosomen. In diese Kategorie fallen alle in dieser Arbeit vorkommenden Aberrationen wie Deletionen, Duplikationen, Insertionen, Inversionen, Isochromosomen, Ring- und Markerchromosomen. Um Deletionen handelt es sich, wenn ein Teil eines Chromosoms verloren geht. Dies kann entweder das Ende eines Chromosoms (terminalen Deletion) oder dem mittleren Chromosomenbereich (interstitielle Deletion) betreffen. In Bezug auf den verlorengegangenen Bereich liegt dann für den Chromosomensatz eine partielle Monosomie vor. Häufig können den

15 Einleitung partiellen Monosomien, wie den kompletten Monosomien, spezifische Krankheitsbilder zugeordnet werden. Die partielle Monosomie des kurzen Arms von Chromosom 4 z.b. ist als Wolf-Hirschhorn-Syndrom und die partielle Monosomie des kurzen Arms von Chromosom 5 als Cri-du-chat-Syndrom bekannt. Duplikationen führen zum zweimaligen Vorhandensein eines Chromosomensegments in einem Chromosom, so dass für den gesamten Chromosomomensatz eine partielle Trisomie entsteht. Als Entstehungsursache wird einerseits illegitimes crossing over während der Meiose angesehen, also ein Kontakt zwischen zwei homologen Chromosomen an nicht-homologen Stellen, so dass ein Chromatidenstück des einen mit dem des anderen Chromosoms vereinigt wird und zwei reziproke Produkte entstehen (Stankiewicz & Lupski, 2002). Es resultierten Gameten mit einer Duplikation und mit einer Deletion, sowie Zygoten mit einer partiellen Trisomie und solche mit einer partiellen Monosomie. Ein weiterer Entstehungsmechanismus basiert auf einer Schleifenbildung in der Meiose bei Vorliegen einer parentalen balancierten Translokation oder Inversion (Buselmaier & Tariverdian, 1999). Aber auch während der Mitose kann es zwischen zwei Chromatiden zu einem ungleichen crossing over kommen (s. Abb. 3). Abbildung 3: Schematische Darstellung eines Chromosoms 1 mit einer Duplikation bzw. Deletion, die jeweils zwei Brüche innerhalb eines Chromosoms voraussetzen (Steffensen et al., 1977). Insertionen oder insertionale Translokationen setzten drei Bruchpunkte in einem Chromosom voraus. Das durch zwei Bruchpunkte entstandene Bruchstück wird in die dritte Bruchstelle eingebaut. Die Insertionstranslokation ist eine eher selten vorkommende

16 Einleitung Chromosomenaberration und weist eine Inzidenz von 1 zu Lebendgeborenen auf (van Hemel & Eussen, 2000). Inversionen entstehen, wenn das Segment zwischen zwei Brüchen um 180 gedreht wird. Wenn beide Bruchpunkte auf einem Arm des Chromosoms liegen und das Zentromer nicht mit eingeschlossen ist, spricht man von einer parazentrischen Inversion. Ist das Zentromer von den Brüchen eingeschlossen, spricht man von einer perizentrischen Inversion. Parazentrische Inversionen weisen eine geschätzte Frequenz von 0,1-0,5 auf Tausend und perizentrische Inversionen von 0,12-0,7 pro Tausend auf (Hengstschläger et al., 2003). Ein Isochromosom ist meist Folge einer transversalen Teilung des Zentromers bei der Meiose. Nach der DNA-Duplikation ist das Zentromer wieder vollständig, aber beide Chromosomenarme sind homolog und beinhalten identisches Genmaterial. Bei Lebendgeborenen ist das Isochromosom des langen Arms des X-Chromosoms am häufigsten und tritt bei 0,002% aller Neugeborenen auf (James et al., 1997). Es liegt in diesen Fällen also eine Verbindung zweier langer Arme über ein Zentromer vor. Klinisch besteht in diesen Fällen häufig ein Ullrich-Turner- Syndrom, da genotypisch eine partielle Monosomie des kurzen Arms des X-Chromosoms vorhanden ist. Seltenere Formen von Isochromosomen betreffen die Autosomen z.b. ein überzähliges Isochromosom 12p beim Pallister-Killian-Syndrom. Ringchromosomen entstehen durch Brüche an den Chromosomenenden, wobei sich die terminalen Bruchflächen unter Ringschluss miteinander verbinden. Bei diesem Prozess kommt es zu sehr unterschiedlich großem Verlust von Chromosomenmaterial, so dass die damit verbundenen klinischen Krankheitsbilder sehr unterschiedlich sein können. Als Markerchromosom wird ein kleines Segment bezeichnet, das zusätzlich zu den normalen 46 Chromosomen vorliegt und dessen Ursprung mit klassischen Bänderungstechniken oft nicht nachgewiesen werden kann. Die Erkennung und Darstellung aller genannten Chromsomenaberrationen erfuhr in den letzten Jahrzehnten einen deutlichen Fortschritt durch die Entwicklung und Verbesserung der Chromosomenpräparation sowie chromosomaler Färbe- und Bänderungstechniken. Dazu kam eine stetige Weiterentwicklung der mikroskopischen Möglichkeiten. Auf diese Entwicklungen wird im folgenden Kapitel näher eingegangen, wobei das Hauptaugenmerk auf der Entwicklung der Fluoreszenz in situ Hybridisierung liegt, da das in dieser Arbeit eingesetzte Verfahren des Multicolour Bandings ebenfalls unter diesen Begriff zu fassen ist. 1.3 Historische Entwicklung der Zytogenetik Lange Zeit fiel die Sichtbarmachung und Auszählung eines kompletten Chromosomensatzes und die Identifikation einzelner Chromosomen äußerst schwer, da es schwierig war geeignete Präparationen von Metaphasen herzustellen, in denen die Chromosomen in ihrer kondensierten

17 Einleitung und spiralisierten Form vorlagen und beobachtet werden konnten. So spekulierte man seit 1920 über die Chromosomenzahl des Menschen, die über lange Jahre zwischen 8 und 50 vermutet wurde. In den 1930er Jahren gelang es mit der Einführung des Colchicins in die Aufbereitung von Zellen, diese bei der Zellteilung in der Metaphase zu arretieren (Blakeslee & Avery, 1937; Levan, 1938). Der wahre Durchbruch kam 1952 mit der Beschreibung des Effekts von hypotonen Lösungen auf Chromosomen in drei unabhängigen Veröffentlichungen (Hughes, 1952; Hsu, 1952; Makino & Nishimura, 1952). Dieser Effekt bestand in einer besseren Ausbreitung der Chromosomen auf dem Objektträger war es dann erstmals möglich, die exakte Anzahl der Chromosomen mit 46 anzugeben (Tijo & Levan, 1956; Ford & Hamerton, 1956). Diese Entdeckung war Anstoß für den Beginn der klinischen Genetik konnte man erstmals Patienten mit Down-Syndrom die pathologische Anzahl von 47 Chromosomen zuordnen, wobei eines der kleinen Chromosomen zusätzlich vorhanden war (Lejeune et al., 1959). Kurz darauf folgten weitere Zuordnungen schon bekannter Krankheitsbilder zu chromosomalen Aberrationen: ein fehlendes X-Chromosom beim Ullrich-Turner-Syndrom (45,X) (Ford et al., 1959), ein zusätzliches X-Chromosom beim Klinefelter-Syndrom (47,XXY) (Jacobs & Strong, 1959), Trisomie 18 (Edwards et al., 1960) und Trisomie 13 (Patau et al., 1960). Trotz dieser Fortschritte war es oft unmöglich aus Metaphasechromosomen ein genaues Karyogramm zu erstellen, so dass oft nur die Zuteilung in eine der sieben Chromosomengruppen (A-G) gelang (s. Abb. 1) Klassische chromosomale Färbe- und Bänderungstechniken Erstmals gelang es Ende der 1960er Jahre in Stockholm Lore Zech mit der Substanz Quinacrin distinkte fluoreszierende Banden entlang menschlicher Chromosomen zu erzeugen (Caspersson et al., 1968,1969,1970). Später wurden weitere Färbetechniken entwickelt, wie im Jahr 1971 die Bänderungstechnik mit Giemsa (Drets & Shaw, 1971), die den heutigen Standard in der klassischen Chromosomenfärbung darstellt. All diesen Methoden ist gemein, dass sie für jedes Chromosom spezifische und reproduzierbare Banden ergeben, die eine eindeutige Identifikation der Chromosomen, die sogenannte Karyotypisierung, zulassen In Situ Hybridisierung (ISH) In situ Hybridisierung ist eine zytochemische Methode, die eine sensitive Erkennung und Lokalisation spezifischer Nukleinsäuresequenzen im Chromosom ermöglicht. Sie wurde im gleichen Jahr wie die ersten Bänderungstechniken (1969) entwickelt und basiert auf der Möglichkeit, dass sich an der gesuchten Sequenz der DNA (Zielsequenz) ein synthetisierter komplementärer Strang (Sonde) anlagern kann (Übersicht in van der Ploeg, 2000). Diese Sonde muss mit einem sogenannten Reportermolekül markiert sein, damit die Zielsequenz später sichtbar gemacht werden kann. Anfangs gelang diese Markierung mit radioaktiven Substanzen.

18 Einleitung Dabei waren die experimentellen Prozeduren relativ riskant, langsam und ergaben zwar sensitive aber nur gering auflösende Ergebnisse. 1.4 Fluoreszenz in situ Hybridisierung (FISH) Bei der Fluoreszenz in situ Hybridisierung wird die Markierung der Sonden mit einem fluoreszierenden Farbstoff durchgeführt. Man unterscheidet zwischen direkten und indirekten FISH Methoden. Bei der direkten Methode wird das Fluorochrom direkt an die Sonde gebunden. Bei der indirekten Methode wird ein Hapten an die Sonde gelagert, das in einem späteren Schritt mit einem fluoreszenzmarkierten Antikörper beladen wird und so die Detektion gelingt Historisches In den letzten 20 Jahren erhöhte sich die Sensitivität der Fluoreszenz in situ Hybridisierung auf das fache des ursprünglich Möglichen. Mit Einführung der FISH konnte allgemein das Interesse für in situ Hybridisierungen deutlich erhöht werden. Es kam zu einer rapiden Entwicklung in diesem Bereich, die zu den heute möglichen äußerst sensitiven, spezifischen und hoch auflösenden FISH-Ergebnissen führte. Ein wichtiger Schritt in dieser Entwicklung war die enzymatische Synthese von Biotin-markierten Nukleinsäuren in einer Form, die es ermöglichte, dass die markierten Nukleinsäuren weiterhin in DNA und/oder RNA eingebaut werden konnten (Langer et al., 1981). Der erste konkrete Einsatz fluoreszenzmarkierter Sonden erfolgte 1982 und bot gegenüber radioaktiv markierten Sonden den Vorteil der sichereren und einfacheren Anwendung (van Prooijen-Knegt et al., 1982). Außerdem erhoffte man sich, mit einem Hybridisierungsansatz mehrere Zielsequenzen innerhalb eines Chromosomensatzes mit verschiedenen Fluoreszenzfarbstoffen gleichzeitig detektieren zu können konnte mit Hilfe der FISH das erste menschliche Gen, das des Thyreoglobulins, einer chromosomalen Bande zugeordnet werden (Landegent et al., 1985). Diesen Prozess, einem Gen den genauen Ort (Locus) innerhalb des Chromosomensatzes zusortieren zu können, bezeichnete man als gene mapping, welches in den folgenden Jahren exzessiv weiter betrieben wurde. Dazu wurden bekannte Sequenzen bestimmter Gene synthetisiert, fluoreszenzmarkiert und auf menschliche Chromosomen hybridisiert, um anschließend sehen zu können, in welcher Bande auf welchem Chromosom das entsprechende Gen liegt. Zu dieser Zeit wurden viele solcher geklonten Bereiche des menschlichen Genoms hergestellt, die man einem exakten Locus auf einem Chromosom zuordnen wollte. Je nach Größe und Art des Wirtes wurden solche Sequenzen, die zur weiteren Klonierung in Plasmide verpackt wurden, als Cosmide, BACS, PACS oder YACS bezeichnet. Umgekehrt konnten diese entwickelten Sequenzen nun von

19 Einleitung Zytogenetikern genutzt werden, um abnorme Chromosomen mit FISH besser charakterisieren und beteiligte Gene identifizieren zu können. Ein häufiges Problem zu dieser Zeit war, dass bei den Hybridisierungen innerhalb dieser Bereiche noch repetitive Sequenzen lagen, die nicht chromosomen-spezifisch waren und es so häufig zu störenden Hybridisierungsmustern auf weiteren Chromosomen kam. Daher war die Anwendung der in situ Suppressions Hybridisierung sinnvoll (Landegent et al., 1987). Es handelte sich dabei um eine Kompetitionshybridisierung. Man versetzte die Sonde vor der eigentlichen Hybridisierung mit einem großen Überschuss von unmarkierter chromosomaler Cot-1-DNA und denaturierte dieses Gemisch. Die Cot-1-DNA bestand fast ausschließlich aus hochrepetitiven Sequenzen der gesamtgenomischen DNA. Dadurch wurde eine Absättigung der repetitiven Sequenzen der Sonde erreicht, und sie konnten somit das Signal der spezifischen Sequenz nicht mehr überlagern. Später entwickelten sich weitere Fortschritte der Fluoreszenz in situ Hybridisierung wie FISH an Interphase-Zellkernen und die Comparative genomische Hybridisierung (CGH) FISH an Interphase-Zellkernen Eine weitere Entwicklung in der FISH war die Hybridisierung der Sonden auf Interphase- Zellkernen (Cremer et al., 1986). Der Begriff der Interphase-Zytogenetik wurde erstmals 1986 geprägt und besaß großes Potenzial für biologische und klinische Anwendungen, vor allem in Bereichen, in denen nur kleine Zahlen der aberranten Zellen im Verhältnis zur Gesamtzellzahl vorhanden waren. Dies galt besonders für Tumorzellen, die häufig numerische und/oder strukturelle Aberrationen zeigten. Zudem wurde durch diese Methode die elementarste Einschränkung der klassischen Zytogenetik, die Erfordernis von sich teilenden Zellen umgangen, um die korrekte Anzahl der Kopien eines Chromosoms nicht nur in Metaphasen, sondern auch in Interphase-Zellkernen zu erfassen. Dabei wurde in der Auswertung die Anzahl der Signale (Spots) für die jeweils verwendete chromosom-spezifische Sonde im Kern ausgezählt. Abweichungen in der Spotzahl konnten auf Verluste oder Zugewinn genetischen Materials hinweisen. Zudem bestand ein weiterer Vorteil dieser Methode darin, dass der Kondensationsgrad in Interphasen geringer war als in Metaphasen und somit eine größere Auflösung bei der FISH an Interphase-Zellkernen möglich war. Dies bedeutete, dass Sonden, die bei Hybridisierung auf Metaphasechromosomen einen Mindestabstand von 1 Mb haben müssen, um noch getrennt visualisiert werden zu können, bei Hybridisierung auf Interphasenuclei nur 50 kb voneinander getrennt sein mussten, um als einzelne Signale erkannt werden zu können (Trask et al., 1989; Lawrende et al., 1990; van den Engh et al., 1992). Diese Vorteile fanden Anwendung in der Diagnostik von Mikrodeletionssyndromen wie z.b. des Charcot-Marie-Tooth-Syndroms. Dabei handelt es sich um eine strukturelle

20 Einleitung Chromosomenaberration mit einer 1 Mb großen Duplikation, die nur durch FISH an Interphase- Zellkernen detektiert werden kann (Lupski et al., 1991) Comparative genomische Hybridisierung (CGH) Mit der Technik der comparativen genomischen Hybridisierung erhielt man die Möglichkeit komplette Genome, ohne vorherige Kenntnisse möglicher involvierter Chromosomen oder chromosomaler Regionen, auf genetische Veränderungen hin zu untersuchen (Voorter et al., 1995). Die CGH wurde unabhängig von zwei Arbeitsgruppen entwickelt (Kallioniemi et al., 1992; du Manoir et al., 1993). Im Gegensatz zur herkömmlichen Fluoreszenz in situ Hybridisierung wurde bei der CGH die komplette DNA des zu untersuchenden Gewebes als DNA-Sonde eingesetzt. Dies bot den Vorteil, dass für eine genetische Untersuchung kein vitales Zellmaterial, aus dem ansonsten Metaphasechromosomen gewonnen werden müssten, notwendig war. Zum Nachweis genetischer Imbalancen wurde die zu testende DNA mit DNA normaler männlicher Zellen, der sogenannten Referenz-DNA, verglichen. Hierzu wurden Referenz- und Test-DNA mit unterschiedlichen Fluoreszenz-Farbstoffen markiert und im Verhältnis 1:1 gemischt. Diese DNA- Mischung wurde als Sonde für eine in situ Hybridisierung an Metaphasechromosomen gesunder männlicher Spender eingesetzt. Das Vorgehen wurde als reverse in situ Hybridisierung bezeichnet, da bei diesem Verfahren nicht direkt die Chromosomen des zu untersuchenden Materials als Struktur analysiert wurden. Bei der Anlagerung der DNA-Mischung an die korrespondierenden DNA-Abschnitte der Metaphasechromosomen kompetitierten die Anteile aus der Test- und Referenz-DNA um Bindung. Lagen alle Chromosomenabschnitte der Test- und Referenz-DNA im gleichen Verhältnis vor, so kam es zu einer homogenen Mischanfärbung der Chromosomen. Waren jedoch in der Test-DNA im Vergleich zur Referenz-DNA einzelne Chromosomenabschnitte überrepräsentiert, so färbte sich der betreffende Abschnitt des Metaphasechromosoms vermehrt in der Farbe der Test-DNA an. Fehlten in der Test-DNA Segmente, so überwog an der betreffenden Stelle die Färbung der Referenz-DNA. Die Fluoreszenzverteilung und -intensität auf den hybridisierten Metaphasechromosomen wurde mittels eines Bildanalysesystems für jedes Fluorochrom separat erfasst und in einem Fluoreszenzratioprofil verrechnet. Die Ausprägung der Fluoreszenzunterschiede hing dabei von der Größe des veränderten Chromosomenabschnitts sowie dem Anteil der veränderten Zellen in der Probe ab, aus der die Test-DNA gewonnen wurde Heutiger Stand Die Klinische Genetik macht heute sowohl in der Diagnostik als auch in der Forschung beträchtlichen Gebrauch von molekularzytogenetischen Methoden. Sie wird routinemäßig zur

21 Einleitung weiteren Abklärung von Rearrangements genutzt, die durch konventionelle Bänderungstechniken festgestellt wurden. Heute steht eine breite Palette an industriell hergestellten DNA-Sonden für den gezielten Einsatz der Fluoreszenz in situ Hybridisierung zur Verfügung: WCP-Sonden (Whole Chromosome Probes), die aus einer Mischung vieler Fragmente eines Chromosoms bestehen und so ein einzelnes Chromosom komplett End-zu-End markieren CEP-Sonden (Chromosome Enumeration Probes), die spezifisch die Zentromerregion eines Chromosoms färben Subtelomer-Sonden, für die Markierung von euchromatischen Sequenzen, die ca. 300kb vom Telomer entfernt liegen Banden-spezifische Sonden, die einen definierten, breiteren Bereich eines Chromosoms markieren LSI-Sonden (Locus Specific Identifier), die spezifisch definierte Loci detektieren und zur Erkennung von Mikrodeletionen (z.b. beim Wolf-Hirschhorn-Syndrom Verlust der Region 4p16.3, beim Cri-du-chat-Syndrom Verlust der Region 5p15.2/15.3 oder beim Williams- Beuren-Syndrom Verlust der Region 7q11.23) beitragen Zudem stehen heute Methoden zur Verfügung, die als Weiterentwicklung der FISH angesehen und unter dem Begriff der Multicolour FISH zusammengefasst werden können. 1.5 Multicolour FISH Historisches Nachdem Ende der späten 1980er Jahre potente FISH Protokolle entwickelt wurden, die es erlaubten einzelne Loci, kleine Bereiche oder komplette Chromosomen zu färben, arbeitete man an weiteren Entwicklungen, die es ermöglichen sollten, innerhalb einer Metaphase verschiedene Zielsequenzen in verschiedenen Farben zu markieren. Dieses Ziel wurde allgemein als Multicolour FISH bezeichnet. Das Vorhaben scheiterte eine Zeit lang an der mangelnden Verfügbarkeit geeigneter Fluorochrome. Eine Hybridisierung, die gleichzeitig drei Zielsequenzen in einer Hybridisierung detektierte, gelang 1989 erstmals der Arbeitsgruppe um Nederlof, die als Fluorochrome FITC, TRITC und AMCA verwendeten (Nederlof et al., 1989). Später wurde die Sonde einer Zielsequenz mit einer Kombination aus Fluorochromen markiert, so dass sich für n Fluorochrome 2 n -1 Möglichkeiten zur parallelen Markierung einzelner Bereiche ergaben. Somit war es 1996 erstmals möglich alle 24 Chromosomen (22 + X + Y) in unterschiedlichen Farben erscheinen zu lassen. Das Prinzip wurde von zwei Arbeitsgruppen zeitgleich entwickelt, deren Protokolle sich allerdings in der Technik der Auswertung unterschieden. So entstanden zwei neue Varianten zur kompletten Karyotypisierung mit Hilfe der FISH: M-FISH und SKY. Eine

22 Einleitung dritte Möglichkeit zur Darstellung aller 24 Chromosomen konnte mit dem Combined Binary Ratio labelling (COBRA) erzielt werden (Tanke et al., 1999). Auch die Methode, die in dieser Arbeit Anwendung fand, das `High Resolution Multicolour Banding (mband), ist als Neuentwicklung im Bereich der Multicolour FISH anzusehen Multiplex-fluorescence in situ hybridization (M-FISH) Diese Methode wurde von der Arbeitgruppe um Michael Speicher und David Ward von der Yale University entwickelt (Speicher et al., 1996). Als Fluorochrome benutzten sie FITC und die Cyanine Cy3 TM, Cy3.5 TM, Cy5 TM und Cy7, zur Gegenfärbung der Chromosomen DAPI. Um jedes Fluorochrom ausreichend genau detektieren zu können, wurde für jedes einzelne ein eigener Filter mit einer Bandbreite von nur 5-15 nm benutzt. Die Filter wurden so gewählt, dass sich ihre Emissions-Spektren nicht überschnitten. Die DNA-Sonden jedes einzelnen der 24 Chromosomen wurden über Mikrodissektion und DOP-PCR (vgl. Kap ) generiert und für jedes Chromosom spezifisch mit einem Fluorochrom oder einer Fluorochromkombination markiert. Nach der Hybridisierung mit dem Mix aus 24 Sonden wurde die Auswertung an einem Fluoreszenzmikroskop mit geeigneten Filtern durchgeführt. Dabei konnte betrachtet werden, welches Chromosom mit welchem bzw. welchen Fluoreszenzfarbstoffen markiert war. Die für die Auswertung erstellte Software erlaubte es, jedem Chromosom mit seiner spezifischen Kombination aus Fluorophoren eine individuelle Falschfarbe zuzuordnen. So erschien jedes Chromosom in einer eigenen Farbe (s. Abb. 4). Abbildung 4: Normaler männlicher Chromosomensatz nach M-FISH. Jedem Chromosom wird eine spezifische Falschfarbe zugeordnet (Eils et al., 1998).

23 Einleitung Spectral Karyotyping (SKY) Eine ähnliche Methode wie die M-FISH bot die Arbeitsgruppe um Evelin Schröck und Thomas Ried mit dem Spectral Karyotyping an (Schröck et al., 1996). Sie benutzten die fünf Fluorochrome Spectrum Green, Cy3 TM, Cy2 TM, Cy5 TM und Texas Red. Im Vergleich zur M-FISH wurde beim SKY mit Hilfe eines Interferometers jeder einzelne aufgenommene Bildpunkt hinsichtlich seiner Wellenlänge analysiert. Die Identifizierung der einzelnen Komponenten des Bildpunkts geschah über einen Klassifikationsalgorithmus. Jeder Komponente wurde ebenfalls eine Falschfarbe zugewiesen, so dass jedes Chromosom über seine spezifische Farbe identifiziert werden konnte. SKY und M-FISH besitzen großes Potenzial zur Abklärung numerischer Aberrationen, bei der Identifikation von Markerchromosomen und interchromosomalen Aberrationen wie den klassischen Translokationen. Sie sind allerdings weniger geeignet zur Abklärung intrachromosomaler Veränderungen wie z.b. peri- und parazentrischer Inversionen oder präziser Feststellung von chromosomalen Bruchpunkten (Chudoba et al., 1999) Combined Binary Ratio labelling (COBRA) Die 1999 von Tanke und Mitarbeitern entwickelte Methode arbeitet mit Kombinationen verschiedener Fluorochrome in unterschiedlichen Verhältnissen zueinander. So ergab sich die Möglichkeit 48 verschiedene Sequenzen parallel in einer Metaphase sichtbar zu machen. Für diese Methode waren lediglich ein gutes Fluoreszenzmikroskop, ein digitales Aufnahmesystem und die Fähigkeit präzise Messungen der Fluorochromverhältnisse durchführen zu können, notwendig High Resolution Multicolour Banding (mband) Die Methode des mband wurde erstmals 1999 beschrieben und sollte die vorhandenen Limitierungen der Multicolour FISH Methoden im Bereich intrachromosomaler Aberrationen und genauerer Bruchpunktbestimmung ergänzen (Chudoba et al., 1999). mband erlaubte die Unterscheidung regionen-spezifischer Bereiche eines Chromosoms auf dem Level der konventionellen chromosomalen Banden. Die Technik basierte auf dem Gebrauch unterschiedlich markierter, überlappender Mikrodissektionsbibliotheken, sogenannter regionspecific partial chromosome paints (RPCPs). Die wechselnden Fluoreszenzintensitäten entlang eines Chromosoms wurden benutzt, um verschiedene Falschfarben für spezifische chromosomale Bereiche zu generieren. Eine mband-sonde ist immer spezifisch für ein Chromosom Herstellung der Sonden Zuerst mussten bei der Herstellung einer mband-sonde die RPCPs mit Hilfe der Mikrodissektion erstellt werden (Lüdecke et al., 1989; Senger et al., 1990). Bei der

24 Einleitung Mikrodissektion handelte es sich um eine Methode, die es unter mikroskopischer Sicht erlaubte, mit einer feinen Glasnadel Chromosomen an beliebigen Stellen zu schneiden und die geschnittenen Stücke separat zu sammeln. Je nach Größe des Chromosoms erhielt man zwischen drei und acht Mikrodissektionsbibliotheken pro Chromosom, die so gewählt waren, dass sie sich zu einem gewissen Grad überlappten. Die Bereiche wurden von mehreren unterschiedlichen Metaphasen geschnitten, wobei gleiche Segmente in einem gemeinsamen Tube gesammelt werden. Bei dieser Prozedur wurde allerdings absichtlich ungenau geschnitten, um leicht unterschiedliche Endbereiche der gewünschten Regionen zu erhalten (s. Abb. 5). Abbildung 5: Veranschaulichung des ungenauen Schneidens am Chromosom 14. Ein bestimmter Bereich wird aus verschiedenen Chromosomen bis 20-mal leicht ungenau geschnitten, wie hier durch die 20 horizontalen Balken gezeigt wird. Dadurch wird für diesen Bereich bei der Hybridisierung eine Gauß-Verteilung der Fluoreszenzintensität erreicht (aus Liehr et al., Int J Mol Med, 2002). Jede so erstellte spezifische Region wurde nun mit DOP-PCR (Degenerate oligonukleotide primed-pcr) amplifiziert (Telenius et al., 1992; Zhang et al., 1993; Chudoba et al., 1996; Senger, 1997). Bei dieser Form der PCR wurden degenerierte Primer benutzt, die definierte 5 und 3 Enden und in der Mitte eine zufällige Hexamer-Sequenz besaßen, um eine universelle Amplifikation der DNA zu erzielen (Sequenz des Primers nach Telenius et al.: CCGACTCGAGNNNNNNATGTGG-3 ; N=A, C, G oder T). Unter wenig stringenten PCR- Bedingungen ließen sich zufällig genomische Sequenzen amplifizieren, welche in ihrer Summe theoretisch die gesamte eingesetzte DNA als überlappende Fragmente (Größenordnung 200bp- 2kbp) repräsentierten (s. Abb. 6). In einer zweiten PCR unter stringenten Bedingungen wurden diese Abschnitte vervielfältigt.

25 Einleitung Abbildung 6: Schema des DOP- PCR-Ablaufs. Die wenig stringenten PCR- Bedingungen erlauben eine teilweise Anlagerung des Primers, während unter stringenten Amplifikationsbedingungen eine komplette Anlagerung erfolgt (PCR Application Manual, Boehringer Mannheim, 1999). Zur anschließenden Markierung der PCR-Produkte standen fünf Fluorochrome zur Verfügung, mit denen jede Region spezifisch markiert wurde. Bei mehr als fünf Bibliotheken konnten auch Kombinationen unterschiedlicher Fluorochrome eingesetzt werden (s. Abb. 7). Um die RPCPs mit Fluorochromen zu bestücken, wurde für jede Mikrodissektionsbibliothek eine Markierungs- PCR durchgeführt. Je nachdem welche Markierung für den Bereich vorgesehen war, wurden ein oder zwei der Nukleotide, die direkt mit einem Fluoreszenzfarbstoffe gekoppelt waren (FITCdUTP, Spectrum Orange TM -dutp, DEAC-dUTP und Texas Red -dutp) bzw. ein biotingekoppeltes Nukleotid zugegeben. Das Biotin wurde in den Posthybridisierungsschritten mit einem AvidinCy5 TM detektiert. Abbildung 7: Markierungsschema einer konventionell hergestellten mband-sonde für das Chromosom 2. Die Sonde setzt sich aus acht RPCPs zusammen, von denen fünf einzeln und drei doppelt markiert sind (MetaSystems GmbH, 2003). Verwendete Fluorochrome: FITC Spectrum Orange Cy5 DEAC Texas Red

26 Einleitung Auswertung Nach der Hybridisierung erfolgte die Auswertung geeigneter Metaphasen mit einem Fluoreszenzmikroskop, das einen spezifische Filter enthaltenden Filterrevolver besaß, und einer geeigneten Software. Durch das beabsichtigt ungenaue Schneiden der Bereiche in der Mikrodissektion ergaben sich nach der Hybridisierung entlang der RPCPs Gauß-Verteilungen der Fluoreszenzintensitäten. Diese Fluoreszenzverläufe entlang des Chromosoms ermöglichten es der Software, eine im Vergleich zu den mikrodissezierten Segmenten vielfache Anzahl an Falschfarben auf das Chromosom zu legen (vgl. Kap ). 1.6 Ziel der Arbeit Die beschriebene Methode des mband erhält zunehmend einen hohen Stellenwert in der Ergänzung konventioneller Chromosomendarstellungstechniken und klassischer FISH-Analysen. Sie ist besonders dort unentbehrlich, wo es um komplizierte Strukturumbauten menschlicher Chromosomen geht. Ziel der hier vorliegenden Arbeit soll daher die Etablierung und Evaluierung des Multicolour Bandings in der zytogenetischen Diagnostik sein. Da es sich beim Multicolour Banding um eine relativ neu entwickelte, molekularzytogenetische Methode handelt, liegen nur wenige publizierte Erfahrungen vor. Insbesondere Ausarbeitungen zu Möglichkeiten und Grenzen der Methode, an unterschiedlichen Aberrationen erprobt und über Einzelfallberichte hinausgehend, sind bisher rar und sollen in dieser Arbeit geleistet werden. Zunächst soll geklärt werden, wie verlässlich die Hybridisierung mit unterschiedlichen chromosomen-spezifischen Sonden ist, um einen zu großen Verlust an Chromosomen und Sondenmaterial in der täglichen Routine zu vermeiden. Im Mittelpunkt steht allerdings die Abklärung der Frage, bei welchen intrachromosomalen Chromosomenaberrationen der Einsatz dieser Methode sinnvoll ist und bei welchen Anomalien sie keinen Nutzen bringt. Um Vor- und Nachteile des mband gegenüber bisher in der Diagnostik eingesetzter Methoden wie M-FISH, Mikrodissektion oder herkömmlicher FISH zu eruieren, soll ermittelt werden wie hochauflösend diese Methode ist und wie präzise Bruchpunkte von chromosomalen Aberrationen definiert werden können. Anhand von klinischen Beispielen soll die Wertigkeit des Multicolour Bandings dargelegt werden. Die möglichst genaue Charakterisierung von Chromosomenaberrationen mittels mband soll zur Aufklärung chromosomenbedingter Entwicklungsstörungen beitragen. In der Diskussion sollen die mit High Resolution Multicolour Banding erzielten Ergebnisse in Form der aberranten Karyotypen, mit eventuell genauer bestimmten Bruchpunkten, in Relation zu dem vorliegenden klinischen Bild eingeordnet werden. Dies soll an ausgewählten Beispielen dokumentiert und deren genotypisches und phänotypisches Bild mit den in der Literatur meist

27 Einleitung selten vorhandenen Fällen ähnlicher Art verglichen werden. Die Korrelation mit den erhobenen klinischen Daten kann zur Aufstellung von prognostischen Kriterien führen, die im Rahmen einer genetischen Beratung von Bedeutung sind. Die Ergebnisse leisten zudem Beitrag zur Ermittlung einer kartographischen Chromosomendatei mit chromosomenband-spezifischer Risikoabschätzung. Abschließend soll eine Empfehlung für den Einsatz des mband in der zytogenetischen Diagnostik erstellt werden, die das Verhältnis von Aufwand zu erzieltem Ergebnis berücksichtigt. Zudem soll versucht werden, die besonderen Vorzüge der Methode heraus zu arbeiten und eventuelle Schwächen zu nennen, um den Einsatz dieser Methode in der zytogenetischen Routine möglichst effizient zu gestalten.

28 Material und Methoden Material und Methoden Die Chromosomenpräparation, konventionelle Färbungen und Auswertungen sowie verschiedene molekularzytogenetische Untersuchungen wurden von Mitarbeitern des Instituts für Klinische Genetik im Medizinischen Zentrum für Humangenetik der Philipps-Universität Marburg durchgeführt. Teilweise lagen zytogenetische Voruntersuchungen aus Praxen für Humangenetik vor. Die mband-analysen wurden vom Autor selbst durchgeführt. 2.1 Untersuchungsmaterial Zur Abklärung intrachromosomaler Aberrationen wurde an 37 Fällen eine Hybridisierung mit einer chromosomen-spezifischen mband-sonde der Firma MetaSystems durchgeführt. Als Untersuchungsmaterial wurde aus venösen Vollblutproben der Patienten, denen zur Gerinnungshemmung Heparin zugesetzt war, über Lymphozytenkultivierung Chromosomensuspensionen gewonnen (vgl. Kap. 2.4). Diese wurden routinemäßig bei -20 C in Ethanol/Eisessig Lösung (3:1, vol:vol) aufbewahrt. Bei 27 mband-analysen wurde auf asservierte Chromosomensuspensionen zurückgegriffen. In den restlichen zehn Fällen handelte es sich um aktuelle Aufträge zur Chromosomenuntersuchung, so dass keine längere Lagerung der Chromosomensuspension voraus ging. Die ursprünglichen Blutproben stammen aus dem Institut für Klinische Genetik der Philipps- Universität Marburg, der Universitätskinderklinik Marburg, Kinderkliniken der Lehrkrankenhäuser der Philipps-Universität Marburg, niedergelassenen Kinderärzten aus Marburg oder Praxen für Humangenetik. 2.2 Chemikalien Alle Chemikalien für die Herstellung der Puffer und Lösungen wurden in p. A.-Qualität bezogen. Aqua ad iniectabilia DAPI (4,6-Diamidino-2-phenylindol) EDTA-Dinatriumsalz Eisessig 100% Ethanol, absolut Ethanol, 70% vergällt Euparal Giemsa Kaliumchlorid Braun Melsungen Sigma, Deisenhofen Roth, Karlsruhe Merck, Darmstadt Merck, Darmstadt Klinikumsapotheke, Marburg Roth, Karlsruhe Merck, Darmstadt Roth, Karlsruhe

29 Material und Methoden Kalium-di-hydrogenphosphat Marabu Fixogum Rubber Cement Natronlauge (NaOH, 1N) Salzsäure Triton-X-100 Trypsin 250 Trockensubstanz Vectashield Mounting Medium Merck, Darmstadt Erich Feucht GmbH, Tamm Merck, Darmstadt Merck, Darmstadt Merck, Darmstadt Becton Dickinson Europe, France Vector Laboratories, Kanada 2.3 Geräte und Zubehör Alle nicht aufgeführten Werkzeuge und Geräte gehören der Laborgrundausstattung an. Axioplan Fluoreszenzmikroskop Carl Zeiss, Jena Axioskop Durchlicht-Mikroskop Carl Zeiss, Jena Brutschrank Heraeus, Hanau CCD-Kamera Fa. IMAC Feinwaage MC 1 Sartorius, Göttingen Heizplatte Medax, Kiel Inverses Mikroskop, Axiovert S100 Magnetrührer Ikamag RO Ika-Werk, Staufen Microprocessor ph-meter WTW, Weilheim Phasenkontrast-Mikroskop Carl Zeiss, Jena Quecksilberdampflampe, 100W LEJ GmbH, Jena Schüttelwasserbad GFL, Münster Software für die digitale Bildanalyse: IKAROS und ISIS MetaSystems, Altlussheim Mikrozentrifuge (Biofuge 13) Heraeus, Hanau Zentrifuge (Megafuge 1.0) Heraeus, Hanau Wasserbad Köttermann, Deutschland Zellkulturflaschen Becton Dickinson Europe, France Zentrifugenröhrchen Nunc, Wiesbaden

30 Material und Methoden Lymphozytenkultivierung Lösungen und Puffer Alle für die Zellkultur benötigten Lösungen, Puffer und Medien wurden, sofern sie nicht steril geliefert wurden, durch Druckfiltration über 0,2 µm Membranfilter (Sartorius) sterilfiltriert bzw. autoklaviert. Antibiotikum/Antimycoticum-Lösung: Penicillin ( units/ml) Streptomycin ( units/ml) Amphotericin B (25 µg/ml) Colcemid-Lösung (10 µg/ml) Fötales Kälberserum McCoy s 5A-Medium mit L-Glutamin Natriumbicarbonat 7,5% Phytohämagglutinin (PHA) Gibco, Paisley, U.K. Boehringer, Mannheim Gibco, Paisley, U.K. Gibco, Paisley, U.K. Gibco, Paisley, U.K. Murex Biotech Limited, U.K Experimentelle Methodik Zur Lymphozytenkultivierung wurde eine möglichst sterile Umgebung benötigt. Als Standardmedium für die Lymphozytenkultivierung dienten 10 ml Mc Coy s 5A Medium. Zur besseren Proliferation wurden 2 ml fetales Kälberserum zugegeben, das Hormone, Bindungsproteine mit Anheftungsfaktoren, zahlreiche Aminosäuren, anorganische Salze, Spurenelemente sowie Puffer- und Neutralisationssysteme (Albumin, Immunglobuline) lieferte. Um einer möglichen Kontamination vorzubeugen, wurden 0,1 ml einer Antibiotikamischung zugesetzt. Zur Pufferung im physiologischen Bereich dienten 0,1 ml Bikarbonat (NaHCO 3 ). Zu diesem Ansatz, der in Zellkulturflaschen überführt wurde, wurden Tropfen der heparinisierten Vollblutprobe gegeben. Da die spätere diagnostische Auswertung der Chromosomen maßgeblich von der Anzahl der in Teilung befindlichen Zellen abhing, wurde Phythämagglutinin (PHA) zur Stimulation der Lymphozytenproliferation zugegeben. PHA als pflanzliches Lektin aus Phaseolus vulgaris hat eine wachstumsanregende Wirkung vor allem auf T-Lymphozyten. Nach der Kultivierung dieses Ansatzes für 72 Stunden bei 37 C im Brutschrank wurde für zwei Stunden 0,2 ml Colcemid (Desacetyl-Methylcolchicin), ein Colchicinderivat zugegeben. Colchicin wirkte über die Hemmung der Ausbildung des Spindelapparats, wodurch der Vorgang der Mitose im Stadium der Metaphase arretiert wurde. Danach lagen die Chromosomen in einem stark kontrahierten und spiralisierten Zustand vor, der bei der späteren Betrachtung im Mikroskop eine Identifizierung ermöglichte.

31 Material und Methoden Chromosomenpräparation und GTG Bänderung Lösungen und Puffer ph-werte wurden am ph-meter mit Salzsäure bzw. Natronlauge eingestellt. Carnois Mischung (Fixativ): Kaliumchlorid-Lösung (75mM): Ethanol/Eisessig (3:1, vol:vol) 5,62 g Kaliumchlorid ad 1 l Aqua dest. di-natriumhydrogenphosphat-lösung: (= Soerensenpuffer Lösung A) Kaliumhydrogenphosphat-Lösung: (= Soerensenpuffer Lösung B) 11,8 g Na 2 HPO 4 ad 1 l Aqua dest. 9,1 g KH 2 PO 4 ad 1 l Aqua dest. Soerensenpuffer: Giemsa-Lösung: 61,2 ml Na 2 HPO 4 -Lösung + 38,8 ml KH 2 PO 4 -Lösung 8 ml Giemsa ad 100 ml Soerensenpuffer Trypsin-Lösung: Trockensubstanz wird zu einer 5 %igen Lösung in Aqua dest. gegeben, aliquotiert à 0,5 ml und bei -20 C gelagert PBS-Puffer: 8 g NaCl + 0,2 g Na 2 HPO 4 + 0,2 g KCl + 1,15 g KH 2 PO 4, ad 1 l Aqua dest.; ph 7,2 Versen-Puffer: Versen-Trypsin-Lösung: 0,2 g EDTA ad 1 l PBS-Puffer 0,5 ml Trypsin ad 30 ml Versen-Puffer Experimentelle Methodik Behandlung der Lymphozytenkultur in hypotoner Lösung Nach der Behandlung mit Colchicin wurde die Zellsuspension in ein Zentrifugenröhrchen überführt und für 10 Minuten bei 1000 Runden pro Minute (rpm) zentrifugiert. Der Überstand wurde bis auf ca. 1 ml abgesaugt und verworfen. Zur hypotonen Behandlung der Zellen wurden 7 ml einer 75 mm Kaliumchlorid-Lösung zugegeben und der Ansatz für 22 Minuten bei 37 C im Brutschrank inkubiert. Diese Behandlung führte über osmotische Vorgänge zur Schwellung der Zellen und so intrazellulär zu einer besseren Ausbreitung der Chromosomen Fixierung und Präparation der Chromosomen Die hypotone Lösung wurde durch Zugabe von 1 ml der eisgekühlten Carnois-Mischung fixiert. Es folgte die Zentrifugation für 10 Minuten bei 1000 rpm. Der Überstand wurde verworfen, 7 ml des Fixativs zugegeben und erneut für 10 Minuten bei 1000 rpm zentrifugiert. Diese Schritte

32 Material und Methoden wurden dreimal wiederholt. Die Waschungen mit dem Fixativ dienten durch den Wasserentzug aus den Zellen der Stabilisierung der Chromosomen. Nach der letzten Zentrifugation wurde der Überstand verworfen und die Chromosomensuspension konnte auf Objektträger aufgebracht werden. Diese wurden zuvor ausgiebig in 70%igem Ethanol gereinigt und über Nacht in Aqua dest. gekühlt gelagert. Die Chromosomensuspension wurde aus ca. 20 cm Höhe auf einen schräg gehaltenen Objektträger (45 ) getropft, der für einige Minuten auf eine 40 C warme und mit feuchtem Papiertuch bedeckte Wärmeplatte gelegt wurde. Die Chromosomen wurden hinsichtlich Metaphasendichte und -qualität unter einem Phasenkontrastmikroskop beurteilt. Anschließend wurden die Objektträger vor weiteren zytogenetischen oder molekularzytogenetischen Färbungen bei 60 C für 24 Stunden gealtert Chromosomenbänderung Die Chromosomen wurden mit der Standardmethode der zytogenetischen Diagnostik GTGgebändert (G-banding using Trypsin-Giemsa). Die Bänderung entstand durch die Behandlung der Chromosomen mit der Proteinase Trypsin und der nachfolgenden Färbung mit Giemsa. Dazu wurde das zu behandelnde Präparat für 5-8 Sekunden in Versen-Trypsin-Lösung geschwenkt. Anschließend wurde die Enzymreaktion in 70%igem Alkohol gestoppt. Danach wurde der Objektträger in gekühltem PBS-Puffer gewaschen und es erfolgte für 5-7 Minuten die Färbung in Giemsalösung. Überschüssige Färbelösung wurde mit Aqua dest. weggespült. Zur Auswertung unter dem Mikroskop bettete man den Objektträger in Kunstharz ein. Die Reste der Zellsuspension wurden bei -20 C gelagert und für weitere zyto- oder molekularzytogenetischen Untersuchungen verwendet. Lösung Zeit Temperatur Funktion Trypsin-Versen-Lösung 5-8 sec 37 C Abbau von chromosomalen Proteinen 70 % Ethanol sec RT Stoppen der Trypsinreaktion PBS-Puffer ca. 30 sec 4 C Waschen Giemsa-Lösung (8%) 15 min RT Färbung Aqua dest. ca. 10 sec RT Waschen über Nacht RT Trocknen Tabelle 1: Ablauf der GTG-Bänderung.

33 Material und Methoden Zytogenetischer Befund Routinemäßig wurde vor den speziellen molekularzytogenetischen Untersuchungen eine Karyotypanalyse durchgeführt. Diese erfolgte an den GTG-Metaphasechromosomen, deren eindeutige Zuordnung anhand eines chromosomen-spezifischen Bandenmusters möglich war. Mit einem hochauflösenden Durchlicht-Mikroskop wurden die Chromosomenpräparate systematisch nach Metaphasen durchsucht und ausgewählte Metaphasen bei 1000facher Vergrößerung analysiert. Um sichere Angaben über den Karyotyp machen zu können, wurden pro Präparat mindestens zehn der Metaphasen bewertet und fünf dokumentiert. Die Aufzeichnung und Bearbeitung der Metaphasen erfolgte unter Verwendung des digitalen Bildverarbeitungssystems Ikaros der Firma MetaSystems. Die Formel für die Typisierung und die Festlegung der durchschnittlichen Bandenzahl erfolgte nach internationaler Standardnomenklatur (ISCN, 1995). 2.7 CBG-Färbung zur Darstellung der Zentromerregion Lösungen und Puffer HCl-Lösung (0,2N): Ba(OH 2 )-Lösung (5%ig): SSC-Lösung: 40 ml 1N HCl ml Aqua dest. 10 g Bariumhydroxid-Octahydrat in 200 ml Aqua dest. 8,82 g Na-Citrat + 5,53 g NaCl ad 1 l Aqua dest. di-natriumhydrogenphosphat-lösung: 11,8 g Na 2 HPO 4 ad 1 l Aqua dest. Kaliumhydrogenphosphat-Lösung: 9,1 g KH 2 PO 4 ad 1 l Aqua dest. Soerensenpuffer: 98,4 ml Na 2 HPO 4 -Lösung + 101,6 ml KH 2 PO 4 -Lösung; ph 6,8 Giemsa-Lösung (7%ig): 7 ml Giemsa ml Soerensenpuffer Experimentelle Methodik Nach dem Aufbringen der Chromosomen auf einen Objektträger (vgl. Kap ) wurden diese für 3-5 Tage bei Raumtemperatur gealtert. Das Chromosomenpräparat wurde zur partiellen Depurinierung der DNA und zum Abbau von Histonproteinen für eine Stunde bei Raumtemperatur in einer HCl-Lösung belassen und anschließend mit Aqua dest. gespült. Für drei Minuten wurden die Chromosomen in die Ba(OH 2 )-Lösung bei 50 C denaturiert und für eine Stunde in 60 C warmer SSC-Lösung inkubiert. Nach dem Abspülen unter heißem Wasser wurde das Präparat für 30 Minuten in der Giemsa-Lösung gefärbt. Die Auswertung erfolgte an

34 Material und Methoden einem hochauflösenden Durchlicht-Mikroskop bei 1000facher Vergrößerung. Die Dokumentation erfolgte über ein digitales Bildverarbeitungssystem (Ikaros, Firma MetaSystems). 2.8 mband Lösungen, Puffer und Sonden Lösungen und Puffer Der ph-wert der jeweiligen Puffer-Lösungen wurde mit Salzsäure bzw. Natronlauge eingestellt. Alkoholreihe 100%: 100 ml Ethanol, absolut 70%: 70 ml Ethanol, absolut + 30 ml Aqua dest. 50%: 50 ml Ethanol, absolut + 50 ml Aqua dest. 30%: 30 ml Ethanol, absolut + 70 ml Aqua dest. 20xSSC: 350,4 g NaCl + 176,4 g Na-Citrat ad 2 l Aqua dest. ; ph 7,4 2xSSC: 100 ml 20xSSC ml Aqua dest. 1xSSC : 50 ml 20xSSC ml Aqua dest. 0,1xSSC : 5 ml 20xSSC ml Aqua dest. 4xSSC/Tween: 200 ml 20xSSC ml Aqua dest. + 1 ml Triton X-100 MetaSystems B-tect detection Kit bestehend aus: blocking reagent = 4xSSC + BSA detection 1+3 reagent = Strepavidin mit angekoppeltem Cy5 TM detection 2 reagent = Anti-strepavidin an Biotin Sonden Für die mband-analysen standen chromosomen-spezifische Kits der Firma MetaSystems zur Verfügung. Je nach Größe des Chromosoms wurden bis zu fünf verschiedene Fluoreszenzfarbstoffe zur Markierung der einzelnen RPCPs benutzt: DEAC (Diethylaminocoumarin), Cy5, FITC (Fluoreszeinthiocyanat), Spectrum Orange und Texas Red. Cy5 wurde als einziges Fluorochrom indirekt detektiert. Als Reportermolekül fungierte Biotin, an das Cy5 über einen Antikörper gekoppelt wurde. Die Detektion des Biotins geschah mit dem MetaSystems B-tect detection Kit (vgl. Kap b). Dieses Verfahren war bei den Kits für die Chromosomen 1 bis 12 und X notwendig. Bei den Kits der Chromosomen wurden nur direkt markierte Fluoreszenzfarbstoffe eingesetzt.

35 Material und Methoden Experimentelle Methodik der Hybridisierung mit mband-sonden Vorbereitung der Objektträger Wie in Kapitel beschrieben wurde Chromosomensuspension auf einen Objektträger aufgebracht und für 24 Stunden gealtert. Um die Sonde gezielt aufbringen zu können, wurde das Areal mit den meisten Metaphasechromosomen bestimmt. Die Chromosomenpräparate wurden in einer absteigenden Alkoholreihe (100%, 70%, 50%, 30%) und 0,1xSSC für je eine Minute bei Raumtemperatur rehydriert Denaturierung der aufgebrachten Chromosomensuspension Zur Verbesserung der Chromosomenstruktur wurden die Chromosomenpräparate bei 75 C für 30 Minuten in 2xSSC gewaschen und nach dem Abkühlen für eine Minute in raumtemperiertem 1xSSC äquilibriert. Daran schloss sich der eigentliche Denaturierungsschritt für eine Minute in 0,07 N Natronlauge an. Es folgte die Überführung der Objektträger für ebenfalls eine Minute in eiskaltes 0,1xSSC und 2xSSC. Die Dehydrierung erfolgte in einer aufsteigenden Alkoholreihe (30%, 50%, 70%, 100%) für ebenfalls eine Minute bei Raumtemperatur. Abschließend wurde der Objektträger 10 Minuten an der Luft getrocknet (s. Tab. 2). Lösung Zeit (min) Temperatur Funktion Alkoholreihe (100% 70% 50% 30%) je 2 RT Rehydrierung 0,1xSSC 2 RT Rehydrierung 2xSSC C Verbesserung der Chromosomenstruktur 0,1xSSC 1 RT Äquilibieren 0,07 N NaOH 1 RT Denaturierung 0,1xSSC 1 4 C Stoppen und Waschen 2xSSC 1 4 C Waschen Alkoholreihe (30% 50% 70% 100%) je 2 RT Dehydrierung Lufttrocknen ca. 10 RT Tabelle 2: Vorbereitung und Denaturierung der Chromosomenpräparate Vorbereitung und Denaturierung der Sonden Die benötigte Menge an Sonde wurde aus dem Originalcup entnommen, in ein lichtundurchlässiges Eppendorf Cup überführt, kurz anzentrifugiert und gevortext. Je nach Größe des zu hybridisierenden Areals auf dem Objektträger benötigte man 7 µl (18x18mm), 10 µl (22x22mm) oder 12 µl (24x24mm). Die Sonden wurden für fünf Minuten bei 75 C im Wasserbad

36 Material und Methoden denaturiert, für eine Minute auf Eis inkubiert und bei 37 C im Wasserbad bis zum Gebrauch für weitere 30 Minuten zur Kompetition repetitiver Sequenzen präannealt Hybridisierung Vor dem Auftragen wurde die Sonde kurz zentrifugiert. Auf einer 37 C warmen Heizplatte wurde das benötigte Volumen der DNA-Sonde auf den ausgewählten Bereich des chromosomenbeladenen Objektträgers aufgetragen und ein entsprechend großes Deckglas aufgelegt. Dies wurde mit Fixogum versiegelt. Die Hybridisierung erfolgte für drei Tage in einer feuchten Kammer bei 37 C Posthybridisierungsschritte und Gegenfärbung Nach Entfernung des Fixogums wurde das Deckglas bei Raumtemperatur in 2xSSC für 10 Minuten abgeschwemmt. Es folgte eine stringente Waschung bei 75 C für fünf Minuten in 1xSSC und eine weitere Waschung für drei Minuten in 2xSSC bei Raumtemperatur. Die nachfolgenden Schritte unterschieden sich, je nachdem ob es sich um chromosom-spezifische Kits mit nur direkt oder mit teils indirekt markierten DNA-Sonden handelte. a) nur direkt markierte DNA-Sonden (Kits für die Chromosomen 13 bis 22) Die Chromosomen wurden für 5 Minuten in einer DAPI-Lösung gegengefärbt. Abschließend wurden die Objektträger nach Trocknung mit Eindeckmedium (Vectashield Mounting Medium, Vector Laboratories) eingedeckt. b) teils indirekt markierte DNA-Sonden (Kits für die Chromosomen 1-12 und X) Zur Beladung der Biotin-markierten Proben mit dem Fluorochrom Cy5 wurde das MetaSystems B-tect detection Kit verwendet. 50 µl des blocking reagent wurden auf den Objektträger gegeben, mit einem 24x60 mm Deckglas bedeckt und für 10 Minuten in der feuchten Kammer bei 37 C inkubiert. Es folgte nach Ablösen des Deckglases eine Waschung für 2 x 3 Minuten in auf 45 C erwärmtem 4xSSC/Tween. Auf den Objektträger wurden nun 50 µl blocking reagent + 1 µl Antikörperreagenz, detection 1+3 reagent, gegeben. Dies wurde mit einem 24x60 mm Deckglas bedeckt und bei 37 C in einer feuchten Kammer inkubiert. Darauf erfolgte eine erneute Waschung in 4xSSC/Tween für 2 x 3 Minuten bei 45 C. Um eine weitere Verstärkung des Cy5 TM Signals zu erreichen, bestand die Möglichkeit weitere Detektionsschritte durchzuführen (vgl. Tabelle 3). Es schloss sich die Gegenfärbung für 5 Minuten in DAPI-Lösung, eine kurze Lufttrocknung und die Eindeckung mit Vectashield an.

37 Material und Methoden Lösung Zeit (min) Temperatur Funktion 2xSSC 10 RT Entfernen der Deckgläschen 1xSSC C Stringente Waschung zur Entfernung ungebundener Sonden DNA 2xSSC 3 RT Waschen a) DAPI 5 RT Gegenfärbung der Chromosomen Vectashield RT Eindecken b) 50 µl blocking reagent 10 feuchte Kammer (37 C) Blocken unspezifischer Antikörper- Bindungsstellen 4xSSC / Tween 2 x 3 45 C Entfernung ungebundener Antikörper 50 µl blocking reagent + 1 µl detection 1+3 reagent 20 feuchte Kammer (37 C) Detektion des Biotins 4xSSC / Tween 2 x 3 45 C Entfernung ungebundener Antikörper 50 µl blocking reagent + 1 µl detection 2 reagent 20 feuchte Kammer (37 C) Verstärkung des Cy5 TM Signals 4xSSC / Tween 2 x 3 45 C Entfernung ungebundener Antikörper 50 µl blocking reagent + 1 µl detection 1+3 reagent 20 feuchte Kammer (37 C) Verstärkung des Cy5 TM Signals 4xSSC / Tween 2 x 3 45 C Entfernung ungebundener Antikörper DAPI 5 RT Gegenfärbung der Chromosomen Vectashield RT Eindecken Tabelle 3: Posthybridisierungsschritte und Gegenfärbung für chromosom-spezifische Kits mit nur direkt (a) und teils indirekt (b) markierten DNA-Sonden (optionale Schritte grau hinterlegt). Die so behandelten Objektträger wurden bis zur Auswertung bei 4 C gelagert Auswertung der fluoreszenzmarkierten Metaphasen Die Auswertung erfolgte an einem Fluoreszenz-Mikroskop mit Hilfe des computergestützten digitalen Bildanalysesystems ISIS, MetaSystems. Das Mikroskop war ausgestattet mit einem 100 Watt Quecksilberdampfbrenner und einem motorisierten Filterwürfel, der über die Computersoftware gesteuert wurde. Neben einem Filter für DAPI beinhaltete dieser fünf weitere, deren Exzitations- und Emissionsspektren die spezifischen Wellenlängen der eingesetzten Fluorochrome abdeckten (DEAC: 426nm/480nm; FITC: 502nm/530nm; Spectrum Orange : 559nm/588nm; TexasRed : 595nm/615nm; Cy5 : 649nm/670nm). Bei einer geeigneten Metaphase wurde mit jedem dem jeweiligen Fluorochrom entsprechenden Filter eine

38 Material und Methoden Einzelaufnahme gemacht. Diese wurden mit einer, einen hochempfindlichen Photochip besitzenden, elektronischen CCD-Kamera (charged-coupled device Kamera) in die Software übertragen. Diese legte die angefertigten Bilder automatisch übereinander, so dass alle Fluorochrome gleichzeitig in einem Bild betrachtet werden konnten. Das betreffende Chromosomenpaar aus der Metaphase wurde ausgeschnitten und in eine Karyogrammvorlage einsortiert. Die verschiedenen Optionen der ISIS-Software ermöglichten es, die Auswertung durchzuführen. Zum einen bestand die Möglichkeit, sich die Kurvenverläufe der Fluoreszenzintensitäten entlang des Chromosoms und zeitgleich die einzelnen fluoreszierenden Bereiche sowie die DAPI-Gegenfärbung anzeigen zu lassen. Am Beispiel einer mband-analyse zur Probe bei einem normalen Chromosom 12 wird dies in Abbildung 8 veranschaulicht. A Abbildung 8: Veranschaulichung der Optionen der ISIS-Software I. A. In den fünf Fenstern rechts neben der DAPI-Färbung ist der für jedes Fluorochrom typisch markierte Bereich bei einem normalen Chromosom 12 (Hybridisierung wurde zu Testzwecken durchgeführt) zu erkennen. Ganz rechts ist der Verlauf der Fluoreszenzintensitäten entlang des Chromosoms dargestellt. B B. Markierungsschema für das Chromosom 12 zeigt, wie sich die fünf verschieden markierten Segmente der Sonde bei einem nicht aberranten Chromosom anlagern sollten. Zum anderen bestand die Möglichkeit, das Chromosom in Bereiche ähnlicher Fluoreszenz- und Fluoreszenzkombinationsintensitäten einzuteilen. Dies geschah vollautomatisch und den so berechneten Bereichen wurden verschiedene sogenannte Falschfarben zugeordnet. Das Ergebnis dieser Berechnungen wurde als Falschfarben-Klassifikator bezeichnet. Die Anzahl der zu generierenden Falschfarben konnte frei gewählt werden. Bei zu hoher Anzahl gewählter Falschfarben passierte es, dass die Software nicht so viele Bereiche im Verlauf des Chromosoms unterscheiden konnte und deshalb manche der Falschfarben nicht angezeigt wurden (s. Abb. 9).

39 Material und Methoden A B Abbildung 9: Veranschaulichung der Optionen der ISIS-Software II. A. Falschfarben-Klassifikator, der an einem Chromosom 12 angelegt wurde. Man erkennt, dass jeder Falschfarbe eine spezifische Fluoreszenzintensitätskombination zugeordnet wurde. B. Zwei identische nicht aberrante Chromosomen 12, auf die der Falschfarben-Klassifikator angewendet wurde. Man erkennt, dass die Software nicht jedem generierten Bereich (1-14) einen Bereich auf den Chromosomen zuordnen konnte. So fehlen die Bereiche 2, 5 und 8. Die Beurteilbarkeit ist dadurch allerdings nicht herabgesetzt. Der Klassifikator wurde bei jeder Hybridisierung erneut erstellt. Die Berechnung des Klassifikators geschah immer an dem nicht aberranten Chromosom, wurde dann aber auf beide Chromosomen eines Paares angewandt. Die Auswertung und Interpretation der Hybridisierungsergebnisse mit den chromosomspezifischen mband-sonden erfolgte unter Nutzung dieser Software-Möglichkeiten und der Kenntnis des bei der Herstellung der jeweiligen Sonde zugrundeliegenden Markierungsschemas. 2.9 Ergänzende Methoden zur Verifizierung und weiteren Abklärung der Ergebnisse Im Folgenden werden kurz die Abläufe weiterer Methoden aus dem Bereich der Fluoreszenz in situ Hybridisierung erläutert, die im Rahmen dieser Arbeit bei einigen Chromosomenaberrationen zur genaueren Abklärung beitrugen. Dazu zählten die FISH mit Einzelsonden bzw. die Dual FISH, bei der zwei Einzelsonden gleichzeitig hybridisiert wurden (in 19 Fällen durchgeführt), Mikrodissektion mit Reversem Painting (in drei Fällen genutzt) und CGH (in einem Fall genutzt) FISH Bei der Fluoreszenz in situ Hybridisierung konnte aus einem großen Spektrum verschiedener für die entsprechende Fragestellung geeigneten Einzelsonden gewählt werden (vgl. Kap ). Die

40 Material und Methoden Hybridisierung einzelner Sonden oder von Sondenkombinationen wurde nach den spezifischen Protokollen durchgeführt, die einen dem mband Protokoll ähnlichen Ablauf aufwiesen. Je nachdem ob die Sonden direkt oder indirekt mit Fluorochrom besetzt waren, ergaben sich unterschiedliche Posthybridisierungsschritte. Bei indirekt markierten Sonden folgte die Behandlung mit spezifischen fluorochrombehafteten Antikörpern. Zur genaueren Übersicht in welchem Fall, welche Sonde und eventuelle Markierung verwandt wurde, wird auf die entsprechenden Kasuistiken im Ergebnisteil und die tabellarische Aufstellung im Anhang verwiesen Mikrodissektion mit Reversem Painting Bei der Mikrodissektion handelt es sich um eine Methode, die es ermöglicht, von definierten Chromosomenregionen DNA zu erhalten. Sie stellt somit einen speziellen Aspekt der Zellchirurgie dar (Hagag und Viola, 1993). Das so gewonnene Material bildet die Grundlage für weitere Analysen, wie die Generierung spezifischer DNA-Sonden für Reverses Painting. Das Vorgehen bei der Mikrodissektion gliedert sich in drei Schritte: Präparation von geeigneten Metaphaseplatten, Dissektion der zu analysierenden Chromosomen/Chromosomensegmente und das Sammeln der isolierten Fragmente zur Weiterverarbeitung zu speziellen DNA-Sonden Präparation von geeigneten Metaphaseplatten Die Lymphozytenkultivierung und anschließende Chromosomenpräparation der zu untersuchenden Vollblutprobe erfolgte wie in den Kapiteln 2.4 bis beschrieben. Zur Mikrodissektion wurden die Chromosomen jedoch auf entfettete Deckgläschen aufgetropft Dissektion der zu analysierenden Chromosomen/Chromosomensegmente Das chromosomenbeladene Deckgläschen wurde in einer Petrischale fixiert und auf den Drehtisch eines Inversen Mikroskops (Axiovert S100) gelegt. Die fein ausgezogene Mikrodissektionsnadel konnte über einen Mikromanipulator in allen drei Ebenen glatt und vibrationsfrei gesteuert werden. Nach der Lokalisation des zu untersuchenden Chromosoms oder Fragments wurde dieses über den Drehtisch des Mikroskops in eine geeignete Position zur Nadel gebracht, welche dann zum Schneiden vorwärts bewegt wurde. Die Fragmentaufnahme erfolgte über eine Rückwärtsbewegung der Nadel, so dass das dissezierte Fragment an der Nadelspitze hängen blieb und von dort in ein Eppendorf Gefäß überführt wurde Herstellung einer DNA-Sonde Über eine DOP-PCR wurde die gewonnene DNA amplifiziert. In einer zweiten PCR-Reaktion wurde die DNA mit Biotin-11dUTP markiert. Die so hergestellte DNA wurde in Anwesenheit

41 Material und Methoden von COT-DNA (10-50µg / Konzentration 1mg/ml) und 100%igem, eisgekühlten Ethanol gefällt und in Hybridisierungspuffer (50% Formamid, 2xSSC und 10% Dextransulfat) gelöst Aufbringen der durch Mikrodissektion generierten Sonden (Reverses Painting) Die gewonnenen DNA-Sonden wurden zur Auswertung auf Chromosomen eines gesunden, männlichen Spenders hybridisiert, was man als Reverses Painting bezeichnet. Das Aufbringen der Spenderchromosomen erfolgte nach den Schritten aus Kapitel Die anschließende Hybridisierung nach dem Protokoll aus Kapitel Zur Kontrolle wurde die hergestellte DNA-Sonde ebenfalls auf Metaphasechromosomen des betroffenen Patienten rückhybridisiert. Da es sich um indirekt markierte Sonden handelte, wurde die Detektion des Biotins mit fluorochrommarkiertem Avidin (Avidin-FITC oder Avidin-Texas-Red) durchgeführt Auswertung Mit Hilfe des Fluoreszenzmikroskops konnten die durch die Sonden fluoreszenzmarkierten Bereiche auf den Spenderchromosomen sichtbar gemacht werden. Dies erlaubte die entsprechende Zuordnung zu dem chromosomalen Abschnitt, der in die jeweilige Aberration involviert war CGH-Analyse Vorbereitung und Denaturierung der Chromosomen Dieser Arbeitsschritte erfolgten wie in Kapitel und beschrieben DNA-Präparation aus Blut Genomische DNA lässt sich aus den kernhaltigen Leukozyten menschlichen Blutes extrahieren (modifiziert nach Miller et al. 1988). Zunächst erfolgte eine selektive Lyse der Erythrozyten durch Zugabe von 30 ml auf 4 C gekühltem RCL-Puffer (red cell lysis buffer = 1,21 g Tris + 1,01 g MgCl 2 + 0,58 g NaCl ad 1 l Aqua dest.) und eine 15-minütige Inkubationszeit auf Eis. Durch anschließende Zentrifugation (10 min/1000 rpm/4 C) sedimentierten die nicht lysierten Leukozyten. Der Überstand mit den Erythrozytentrümmern wurde verworfen. Das Sediment wurde mit 25 ml RCL-Puffer gewaschen und erneut zentrifugiert. Das Zellpellet wurde in 5 ml SE-Puffer (Sodium-EDTA-Puffer = Zellkernlysispuffer = 75 mm NaCl + 1 mm Na 2 EDTA ad 1 l Aqua dest.) resuspendiert und mit 500 µl 10% SDS-Lösung (10 g Sodiumdodecylsulfat ad 100 ml Aqua dest ml 5 M NaCl-Lösung) sowie 3 µl Pronase versetzt. Dieser Schritt diente dem Verdau der Zellmembran und der Freisetzung der DNA aus dem Zellkern. Die Proteolyse erfolgte bei 37 C im Schüttelbad über Nacht. Hierbei wurden auch die Nukleasen irreversibel

42 Material und Methoden inaktiviert, was von essentieller Bedeutung ist, damit die aus dem Zellkern stammenden DNAsen nicht die freigesetzte DNA verdauen. Um eine möglichst vollständige Lyse der Leukozyten zu erreichen, wurden dem Ansatz weitere 5 ml SE-Puffer zugesetzt, und es folgte eine nochmalige Inkubation für 10 min bei 55 C. Die durch die Zelllyse freigesetzten und von der Proteinase abgebauten Proteine wurden durch Zugabe von 3 ml einer 5 M NaCl-Lösung unter kräftigem Mischen dehydriert und gefällt. Sie ließen sich durch Zentrifugation (10 min./1000 rpm/rt) abtrennen. Aus dem Überstand wurde die DNA durch Zugabe von 40 ml eiskaltem 96% Ethanol gefällt. Nach einem Waschschritt mit 70% Ethanol wurde die DNA je nach abgeschätzter Menge in µl TE-Puffer (= 10 mm Tris-HCl, ph 7,4 + 1 mm EDTA, ph 8,0) gelöst (Inkubation für eine Stunde bei 37 C unter mehrmaligem Schütteln). Im Schnitt wurden nach dieser Methode aus 10 ml EDTA-Blut zwischen 400 und 600 µg hochmolekulare DNA gewonnen Markierung der genomischen DNA (Nicktranslation) Für eine CGH-Analyse wurde die genomische DNA mittels Nicktranslation markiert (Rigby et al., 1977). Hierzu wurde ein eigens für diese Anwendung optimierter vorgefertigter Reagenziensatz verwendet (nick translation kit, Fa. Vysis). Die Referenz-DNA wurde aus Vollblut einer gesunden männlichen Person gewonnen (vgl ) und mit Biotin markiert. Die Test- DNA wurde mit Digoxigenin markiert. Hierzu wurden 1 µg der jeweiligen DNA in einer Lösung bestehend aus vorgefertigtem Puffer und je 20 µm datp, dctp und dgtp sowie 14 µm dttp und jeweils 6 µm Biotin-11-dUTP (Fa. Sigma) bzw. Digoxigenin-11-dUTP (Fa. Boehringer Mannheim) unter Zugabe der mitgelieferten Mischung aus DNAse und DNA-Polymerase I für 2 h bei 15 C inkubiert. Die Reaktion wurde durch Erhitzen auf 70 C für 10 min gestoppt Herstellung der Hybridisierungsmischung und Hybridisierung Ca. 400 ng markierte Test- und Referenz-DNA wurden in gleichen Verhältnissen gemischt, mit 15 µg COT1-DNA (Fa. Life Technologies) versetzt und nach Zugabe von 1/10 Volumen 3M Lithiumchloridlösung mit eisgekühltem 100% Ethanol präzipitiert. Nach Auswaschen des LiCl mit eisgekühltem 70% Ethanol wurde das Pellet in 10 µl Hybridisierungspuffer, bestehend aus 50% Formamid, deonisiert, 10% Dextransulfat und 2xSSC, ph 7,0, bei 37 C über Nacht gelöst. Diese Hybridisierungsmischung wurde anschließend bei 75 C im Wasserbad für 10 min denaturiert und zur Reduktion der Hybridisierung unspezifischer, repetitiver DNA-Sequenzen bei 37 C für 30 min im Wasserbad inkubiert (Präannealing). Diese DNA-Mischung wurde dann auf Objektträger aufgetragen, auf denen sich, wie unter beschrieben, denaturierte Metaphasechromosomen einer normalen männlichen Person befanden. Nach Abdecken mit

43 Material und Methoden einem Deckglas und luftdichter Versiegelung mittels Fixogum (Fa. Marabu) wurden die Objektträger für 3-5 Tage bei 37 C inkubiert Waschung und Detektion Nach Entfernen der Deckgläser wurde die unspezifisch gebundene DNA durch Waschung in 1xSSC bei 75 C für 5 Minuten entfernt. Danach schloss sich eine Inkubation mit 2xSSC/0,1% TritonX100 bei Raumtemperatur an. Nach Inkubation in einer Lösung aus 3% BSA/4xSSC bei 37 C für 15 Minuten zur Abdeckung unspezifischer Proteinbindungen (Blockungslösung), folgte die Detektion der hybridisierten DNA durch Inkubation in 5 µg/ml Texas red-gekoppeltem Streptavidin (Fa. Vector-Laboratories) und 2 µg/ml FITC-gekoppeltem anti-digoxigenin- Antikörper (Fa. Boehringer Mannheim) in 4xSSC/1% BSA für 60 Minuten bei 37 C. Nichtgebundene Antikörper wurden durch Waschungen mit 4xSSC/0,1% TritonX100 für 2x5 Minuten bei 45 C entfernt. Die Chromosomen wurden mit DAPI für 2 Minuten bei Raumtemperatur gefärbt. Abschließend wurden die Objektträger nach Trocknung mit Eindeckmedium (Vectashield, Fa. Vector-Laboratories) eingedeckt Auswertung mit Digitaler Bildanalyse Die Auswertung erfolgte am Fluoreszenzmikroskop (Axiophot, Zeiss, Oberkochem) mit Hilfe des digitalen Bildanalysesystems ISIS. Die Filterkombination des Mikroskops erlaubte die selektive Darstellung von DAPI-, FITC- und Texas Red -Fluoreszenzen sowie mittels eines Doppelbandfilters die zweifarbige Darstellung von FITC und Texas Red und mittels eines Triplebandpassfilters die dreifarbige Ansicht von DAPI, FITC und Texas Red. Die mittels DAPI gefärbten Metaphasechromosomen, sowie die Fluoreszenzen der mit Texas Red und FITC markierten Referenz- bzw. Test-DNA, wurden mit einer CCD-Kamera als Grauwerte separat aufgenommen. Die Chromosomen einer Metaphase wurden anschließend in einer Karyogrammvorlage geordnet. Die Fluoreszenzintensitäten der Fluorochrome FITC und Texas Red wurden getrennt im kurzen und langen Arm ermittelt, woraus sich über die Länge des jeweiligen Chromosoms ein Profil der Verhältnisse der Fluoreszenzintensitäten ergab. Anschließend wurde für jede Metaphase ein Histogramm der Werte der Verhältnisse der Fluoreszenzintensitäten erstellt. Auf der Basis dieses Histogramms erfolgte für jeden Chromosomentyp einer Metaphase eine Normalisierung der Profile der Verhältnisse der Fluoreszenzintensitäten. Anschließend wurde für jeden Chromosomentyp der Mittelwert dieser Normalisierungen aus mehreren Metaphasen einschließlich der Standardabweichungen ermittelt und als Profil über die Länge des jeweiligen Chromosoms dargestellt. Zur Ermittlung von Überund Unterrepräsentationen wurde der Schwellenwert auf die dreifache Standardabweichung festgesetzt. Mindestens 10 Chromosomen eines Typs wurden für die CGH analysiert. Die Ergebnisse wurden für jedes Chromosom in Bezug auf das jeweilige Chromosomenideogramm

44 Material und Methoden grafisch dargestellt. Die Regionen der chromosomalen Imbalancen in der Test-DNA wurden mittels Balken verdeutlicht. Dabei wurde gemäß internationaler Übereinkunft Rot für Unter- und Grün für Überrepräsentation gewählt (vgl. Abb. 18).

45 Ergebnisse Ergebnisse 3.1 Qualität der Hybridisierungen mit mband-sonden Insgesamt wurden im Rahmen dieser Arbeit 37 Fälle mit unterschiedlichen intrachromosomalen Aberrationen mit chromosom-spezifischen mband-sonden der Firma MetaSystems hybridisiert. Bei 27 Hybridisierungen entstanden ausreichend gute Fluoreszenzsignale entlang der Chromosomen, so dass eine Beurteilung der zugrundeliegenden Chromosomenstruktur möglich war. In zehn der 37 Fälle brachte die Hybridisierung kein ausreichend intensives Fluoreszenzsignal, so dass eine Auswertung nicht möglich war. Davon lag bei sechs Fällen lediglich eine Signalabschwächung des Fluorochroms FITC vor bei guten Signalen der anderen eingesetzten Fluorochrome. Bei den verbleibenden vier Fällen waren insgesamt alle Fluoreszenzsignale so schwach, dass eine Auswertung unter dem Fluoreszenzmikroskop nicht möglich war. Abbildung 10: Säulendiagramm zur Veranschaulichung der Qualität der Hybridisierungen mit mband-sonden. Bei vier der zehn Hybridisierungen, die kein auswertbares Ergebnis lieferten, lag zum Aufbringen der Chromosomen auf Objektträger eine über neun bis zehn Jahre asservierte Suspension vor. Einer dieser Fälle wurde erneut mit einem mband Kit aus einer neuen Charge hybridisiert. Dies brachte allerdings ebenfalls keine auswertbaren Ergebnisse. Bei zwei weiteren der nicht gelungenen Hybridisierungen brachte die wiederholte Hybridisierung mit einer neuen Probe gute Ergebnisse. Bei diesen Fällen war die Chromosomensuspension drei Jahre alt bzw. frisch gewonnen. Bei den vier restlichen nicht gelungenen Hybridisierungen konnten auf Grund von Mangel an Chromosomensuspension keine erneuten Hybridisierungen durchgeführt werden. Insgesamt war bei den 27 gelungenen Hybridisierungen keine Chromosomensuspension älter als fünf Jahre.

46 Ergebnisse Im folgenden Ergebnisteil werden 26 Fälle der gelungenen Hybridisierungen, in Hinblick auf ihre zugrunde liegende Aberration sortiert, vorgestellt. Unter diesen finden sich fünf familiäre Fälle, bei denen neben dem Patienten auch ein oder zwei Elternteile untersucht wurden. Eine der 27 gelungenen Hybridisierungen wurde als Test durchgeführt und diente im Kapitel Material und Methoden zur Veranschaulichung der Auswertung von mband-analysen. Dieser Fall wird im weiteren Ergebnisteil nicht mehr erwähnt, da keine klinischen Auffälligkeiten vorlagen. Jede Fallbeschreibung beginnt mit einer kurzen Patientenvorstellung, die relevante Daten sowohl aus Schwangerschaftsverlauf, Perinatalperiode und weiterem Lebensweg enthalten kann. Anschließend folgt die Darstellung aller zytogenetisch und molekularzytogenetisch durchgeführten Untersuchungen, die zu einem vorläufigen Karyotyp oder einer Vermutung über die zugrundeliegende chromosomale Aberration führen. Daran schließt sich die Auswertung der Analyse mit Multicolour Banding an. Zum Abschluss werden alle Untersuchungen zusammengefasst und der resultierende Karyotyp genannt. 3.2 Deletionen Im Rahmen dieser Arbeit wurden zwei Fälle mit unterschiedlichen Deletionen hybridisiert Deletion 7p (Fall 07-01) Klinische Befunde Bei einem weiblichen Säugling im Alter von sechs Monaten wurde bei einer Untersuchung ein Gewicht von 7380 g (25. Perzentile), eine Größe von 68 cm (50. Perzentile) und ein Kopfumfang von 43,3 cm (oberhalb der 25. Perzentile) gemessen. Auffallend waren diskrete faziale Dysmorphiezeichen mit einem relativ breiten Augenabstand, breiter eingezogener Nasenwurzel und grazilem Nasenrücken, sowie einer leichten Abflachung der linken Stirnregion und etwas tiefer angesetzten Ohrmuscheln. Bei normaler Stellung von Armen und Beinen fiel auf, dass im Verhältnis zum normal proportionierten Körper die Finger und Zehen kurz sind Zyto- und molekularzytogenetische Untersuchungen Die Chromosomenuntersuchung ergab bei einer Auflösung von ca. 450 Banden nach ISCN einen auffälligen, weiblichen Karyotyp mit einem Strukturumbau am kurzen Arm eines der Chromosomen 7 (s. Pfeil in Abb. 11). Dabei handelte es sich um einen Verlust genetischen Materials im Sinne einer Deletion. Die Gesamtzahl der Chromosomen im Chromosomensatz betrug 46. Eine Analyse über Fluoreszenz in situ Hybridisierung mit einer Sonde, die spezifisch das komplette Chromosom 7 markiert (WCP 7, Oncor), ergab eine durchgängige Markierung

47 Ergebnisse beider Chromosomen 7. Die zytogenetisch gefundene Verkürzung des kurzen Arms eines Chromosoms 7 konnte mit dieser Untersuchung bestätigt werden. Nach diesen Ergebnissen lautet der Karyotyp: 46,XX,del(7)(p15.1p21.1) Abbildung 11: Partielles Karyogramm mit GTG gebändertem Chromosomenpaar 7. Pfeil deutet auf strukturell veränderten kurzen Arm mband-analyse Zur weiteren Aufklärung der Strukturaberration wurde eine für das Chromosom 7 spezifische mband-sonde eingesetzt. Diese setzte sich aus sechs überlappenden Mikrodissektionsbibliotheken zusammen, die mit fünf verschiedenen Fluorochromen markiert waren (s. Abb. 12 C). Die Auswertung des mband erfolgte an 12 Metaphasen. Es zeigte sich ein deutlich abgeschwächtes Signal des DEAC markierten Bereichs bei dem aberranten Chromosom 7. Das angrenzende Cy5 Signal im kurzen Arm war im Vergleich zum entsprechenden Signal im normalen Chromosom 7 gleich intensiv (s. Abb. 12 A). Dies sprach für den Verlust genetischen Materials im ausschließlich DEAC markierten Bereich, der laut Markierungsschema die Banden 7p21 und 7p22 umfasste (s. Abb. 12 C). Sowohl beim normalen als auch beim aberranten Chromosom 7 sah man im kurzen Arm ein schwaches Signal für FITC, das laut Markierungsschema nicht vorhanden sein sollte. Hierbei handelte es sich um ein Artefakt der Aufnahmetechnik, da es sich eigentlich um das DEAC Signal handelte, welches im FITC Filter mit durchgelassen wurde. Der Verlust genetischen Materials aus dem terminalen kurzen Arm spiegelte sich bei der Anwendung eines Falschfarbenklassifikators in der verschmälerten terminalen, `blauen Bande wider (s. Abb. 12 A+B).

48 Ergebnisse A B Abbildung 12: mband mit Chromosom 7 spezifischer Sonde zur Strukturabklärung der Deletion 7p (genauere Beschreibungen s. Text). DEAC Cy5 FITC Spectrum Orange Texas Red A. Normales Chromosom 7 B. Aberrantes Chromosom 7 C. Markierungsschema des Chromosoms 7 (Bereich der Deletion mit Balken markiert) C Zusammenfassung der Ergebnisse Die vorliegenden Befunde der FISH mit einer WCP-7-Sonde und des mband lassen keine Beteiligung weiterer Chromosomen an dieser Strukturanomalie zu. Aus der zytogenetischen Untersuchung und dem mband lässt sich folgern, dass es sich um eine partielle Deletion am kurzen Arm eines Chromosoms 7 handelt. Da beim Multicolour Banding eine Beteiligung der Cy5 Region des kurzen Arms mit hoher Wahrscheinlichkeit auszuschließen ist und parallel dazu eine deutliche Abschwächung des DEAC Signals vorliegt, dürften die Bruchpunkte innerhalb des Bandenbereichs liegen, der ausschließlich mit DEAC markiert ist. Eine Beteiligung der Region des Überlappungsbereichs von DEAC und Cy5, die die Bande 7p15.1 beinhaltet, kann ausgeschlossen werden. Es liegt somit eine Deletion der Region 7p21 p22 vor und der Karyotyp der Patientin unter Korrektur der Bruchpunkte lautet: 46,XX,del(7)(p21p22)

49 Ergebnisse Deletion 15 (Fall 15-03) Klinische Befunde Die Patientin wurde als erstes Kind der Familie am geplanten Geburtstermin mit einem Gewicht von 2990 g geboren. In der Neugeborenenperiode zeigten sich respiratorische Anpassungsstörungen, Hypoglykämien, eine Sepsis sowie eine deutliche Muskelhypotonie. Bei der Patientin lag das klinische Bild eines Prader-Willi-Syndroms vor mit partiellem Wachstumshormonmangel. Es zeigte sich eine primär verzögerte statomotorische Entwicklung: Freies Laufen mit 26 Monaten, Hüpfen und Roller fahren seit einem Alter von 4 ½ Jahren. Seit Ende des dritten Lebensjahres begann das Kind vermehrt zu lautieren. Bei einer Kontrolluntersuchung im Alter von 5 8/12 Jahren bestand ein Strabismus convergens links, eine Ptosis links, Mikroakrie und Neurodermitis. Bei orthopädischer Betrachtung zeigte sich eine Valgusstellung der unteren Extremitäten mit Pes planus. Die obere Extremität war deutlich hypotoner als die untere mit Scapulae alatae beidseits. An der Brustwirbelsäule fiel eine leichte rechtskonvexe Krümmung auf, die in eine kompensatorische linkskonvexe Krümmung der Lendenwirbelsäule überging. Im Stehen lag eine Muskelhypotonie bedingte LWS-Lordose vor. Herz, Lunge und Abdomen waren unauffällig. Eine Bestimmung des Knochenalters wies eine Retardierung um 2 2/12 Jahre im Vergleich zum kalendarischen Alter auf. Das Gewicht von 21,0 kg lag auf der 50. Perzentile und die Größe mit 111 cm zwischen 10. und 25. Perzentile unter Wachstumshormonsubstitution Zyto- und molekularzytogenetische Untersuchungen Bei der zytogenetischen Analyse fiel ein strukturell verändertes Chromosom 15 bei ansonsten unauffälligem Karyotyp auf. Man sah einen Verlust des kurzen Arms, der über das Zentromer in den langen Arm hinein reichte (s. Abb. 13). Zudem sah man im terminalen Bereich des langen Arms bei dem aberranten Chromosom 15 eine zentromerähnliche Einschnürung (s. Pfeil in Abb. 13). Nach zytogenetischen Gesichtspunkten konnte keine eindeutige Karyotypbestimmung vorgenommen werden. Über eine zusätzlich durchgeführte C-Färbung konnte gezeigt werden, dass das aberrante Chromosom 15 kein Zentromer enthielt (s. Abb. 14). Abbildung 13: Partielles Karyogramm der Patientin mit deletiertem Chromosom 15 (Pfeil).

50 Ergebnisse Abbildung 14: C-Färbung. Das aberrante Chromosom 15 (mit M1 markiert) zeigt keine Anfärbung im Zentromerbereich. Eine deutliche Anfärbung ist bei allen anderen Chromosomen zu vermerken. 13, 14 und 15 markieren die weiteren akrozentrischen Chromosomen. Zur ergänzenden Diagnostik wurden Hybridisierungen mit LSI-Sonden für die Region des Prader-Willi/Angelman-Syndroms in 15q11-q12 (SNRPN, Oncor und UBE3A, QBIOgene) durchgeführt. Für diese Loci zeigten sich keine spezifischen Signale auf dem aberranten Chromosom. Die Kontrollregion PML in 15q22 (Oncor) war ebenso wie die Kontrollregion in 15qter (QBIOgene) vorhanden (s. Abb. 15 A+B). Die Signale für die Markierung der alpha- Satelliten-DNA (D15Z1, Oncor) und der classical-satelliten-dna (D15Z3, Oncor) waren beim normalen Chromosom regelrecht und fehlten jedoch beim deletierten Chromosom (s. Abb. 15 C).

51 Ergebnisse A B Abbildung 15: FISH mit LSI-Sonden A. SNRPN (rot); Kontrollen: D15Z1 (grün) und PML (rot). Bei dem aberranten Chromosom 15 (Pfeil) sind Signale nur im Bereich der PML Region (15q22) nachweisbar. Die Markierung der spezifischen SNRPN- und der Kontrollregion im Zentromer fehlen. B. UBE3A (rot); Kontrollregion in 15qter (grün). Bei dem aberranten Chromosom 15 (Pfeil) war nur das Signal der Kontrollregion vorhanden. C C. Alpha-Satelliten-DNA, D15Z1 (grün); Classical-Satelliten-DNA, D15Z3 (rot). Keine Signale am aberranten Chromosom 15 (Pfeil) mband-analyse Die Hybridisierung wurde mit einer für das Chromosom 15 spezifischen mband-sonde durchgeführt, die vier verschiedene, unterschiedlich fluoreszenzmarkierte RPCPs beinhaltete (s. Abb. 16 C). Die Analyse der Metaphasen bestätigte den Verlust des kurzen Arms bis zum proximalen Anteil des langen Arms. Im aberranten Chromosom 15 zeigte sich ein deutlicher Verlust des FITC markierten Bereichs und ein dezenter Verlust der Texas Red markierten Region, die teilweise mit dem FITC markierten Bereich überlappte (Pfeile, Abb. 16 B). Dies spiegelte sich in dem Verlust der Falschfarbenbanden `Gelb, `Türkis, `Violett und teils `Grün wider, die im normalen Chromosom 15 vorhanden waren (Bereich zwischen den Pfeilen, Abb. 16 A).

52 Ergebnisse A B Abbildung 16: mband mit Chromosom 15 spezifischer Sonde zur Strukturabklärung der Deletion (genauere Beschreibungen s. Text). FITC Texas Red DEAC Spectrum Orange A. Normales Chromosom 15 B. Aberrantes Chromosom 15 C. Markierungsschema des Chromosoms 15 (Pfeil markiert den Bruchpunkt der Deletion) C Zusammenfassung der Ergebnisse Die vorliegenden zytogenetischen und molekularzytogenetischen Untersuchungen zeigen, dass es sich bei der vorliegenden strukturellen Aberration um eine Deletion des kurzen Arms, der Zentromerregion und des proximalen langen Arms eines Chromosoms 15 handelt. Entsprechend der mband-analyse mit Nachweis des Teilsignals von FITC und zu Hilfenahme des Markierungsschemas lässt sich der Bruchpunkt in der Bande 15q15 bestimmen. Trotz des Verlustes der Zentromerregion zeigt sich das aberrante Chromosom 15 in allen untersuchten Metaphasen, was die Formation eines Neozentromers nahe legt. Als wahrscheinlichster Locus einer solchen Neubildung wird die Bande 15q26 angenommen. Der Karyotyp der Patientin ist: 46,XX,neo(15)(q15 q26 neo q26 qter)

53 Ergebnisse Duplikationen Im Folgenden werden acht Kasuistiken mit unterschiedlichen Duplikationen dargestellt Direkte Duplikation 2p (Fall 02-03) Klinische Befunde Der Patient ist das zweite Kind gesunder Eltern. Bereits kurz nach der Geburt fielen diverse Dysmorphiezeichen wie Makrozephalie, eine breite Stirn, Hypertelorismus, kleine dysplastische tiefsitzende Ohren, Glossoptose bei insgesamt kleiner Zunge, Mikrognathie, Syndaktylie der Finger IV/V beidseits und eine Hypospadie auf. Weiterführende Untersuchungen zeigten außerdem eine Gaumenspalte, eine Hirnfehlbildung mit beidseits schmalen Vorderhörnern, vergrößerten Hinterhörnern und großem Cavum septum pellucidum und eine Pulmonalklappenstenose. Im Alter von fünf Monaten war der Junge mit einem Trachealtubus versorgt, der auf Drängen der Eltern bei unklarer Situation mit akuter Ateminsuffizienz angelegt wurde. Eine statomotorische Entwicklung fand bis zu diesem Zeitpunkt nicht statt. Weiterhin traten immer wieder Phasen schwerer Hypoglykämien auf Zyto- und molekularzytogenetische Untersuchungen Die zytogenetische Untersuchung zeigte einen strukturell auffälligen männlichen Karyotyp, mit einer als interstitiellen Duplikation gedeuteten Veränderung am kurzen Arm eines Chromosoms 2 (s. Abb. 17). Abbildung 17: Partielles Karyogramm mit dem Chromosomenpaar 2 des Patienten. Der Pfeil markiert den auffälligen kurzen Arm. Abbildung 18: Ausschnitt aus der CGH Auswertung mit Fluoreszenz-Ratioprofil des betroffenen Chromosoms 2. Zu sehen ist eine Überrepräsentation im Bereich 2p13 p22 (grüner Balken). Zur genaueren Überprüfung der Chromosomenanomalie wurde eine Comparative Genomische Hybridisierung (CGH) durchgeführt, die einen Zugewinn an genetischem Material des Bereichs 2p13 p22 nachwies (s. Abb. 18).

54 Ergebnisse Nach diesen Ergebnissen wurde die vorliegende strukturelle Veränderung als Duplikation der Region 2p13 p22 interpretiert ohne eine genauere Aussage über die Orientierung machen zu können. Der Karyotyp lautete demnach: 46,XY,dup(2)(p13p22) mband-analyse Zur Bestätigung der vorliegenden Ergebnisse wurde die Hybridisierung mit einer Chromosom 2 spezifischen mband-sonde durchgeführt. Diese beinhaltete acht verschiedene Mikrodissektionsbibliotheken, die mit den fünf bekannten Fluorochromen markiert waren. Drei der RPCPs waren parallel mit zwei Fluoreszenzfarbstoffen markiert (s. Abb. 19 C). Es zeigte sich eine Vermehrung genetischen Materials in einem Bereich des kurzen Arms, der mit den Fluorochromen Cy5 und einer Kombination von FITC und DEAC markiert war. So fielen zusätzliche Signale dieser Bereiche im kurzen Arm des aberranten Chromosoms auf (Pfeile, Abb. 19 B). Diese zusätzlichen Signale für FITC und DEAC waren im Verhältnis zu deren Signalen im normalen Chromosom 2 deutlich abgeschwächt, wogegen das zusätzliche Signal für Cy5 gleich intensiv erschien. Das untere der beiden Cy5 Signale im p-arm des aberranten Chromosoms stellte sich leicht verschmälert dar. Anhand der Verläufe der Fluoreszenzintensitäten konnte dieser Eindruck bestätigt werden. Entsprechend fiel bei der Anwendung der Falschfarben die Verdopplung der Farbbanden `Blau, `Grün, `Türkis (Region zwischen den Pfeilen, Abb. 19 A) im aberranten Chromosom 2 auf. In der mband-analyse wies der nahezu komplett duplizierte Cy5 Bereich für einen weit distal in dieser Cy5 markierten Region liegenden Bruchpunkt, allerdings noch unterhalb der überlappenden Region mit der Doppelmarkierung aus FITC und Spectrum Orange. Dies entsprach laut Markierungsschema der Bande 2p22 (s. Abb. 19 C). Für den zentromernäher liegenden Bruchpunkt deutete das schwächere Signal des FITC/DEAC Bereichs auf einen zentral in dieser Region liegenden Bruch. Dieser befand sich demnach in der Bande 2p13.

55 Ergebnisse A B Abbildung 19: mband mit Chromosom 2 spezifischer Sonde zur Strukturabklärung der interstitiellen Duplikation 2p (genauere Beschreibungen s. Text). FITC Cy5 Spectrum Orange DEAC Texas Red A. Normales Chromosom 2 B. Aberrantes Chromosom 2 C. Markierungsschema des Chromosoms 2 (Bereich der Duplikation mit Balken markiert) C

56 Ergebnisse Zusammenfassung der Ergebnisse Unter Einbeziehung aller zytogenetischen wie molekularzytogenetischen Untersuchungen ergibt sich eine Duplikation der Region 2p13 p22. Mit der mband-analyse konnte demnach der Vorbefund aus der CGH-Analyse verifiziert werden. Einzig über die Ergebnisse des mband lässt sich allerdings klären, ob es sich um eine direkte oder invertierte Duplikation handelt. Die Anordnung der Fluorochrome im aberranten Chromosom 2 belegt das Vorliegen einer direkten Duplikation des Bereichs 2p13 p22 (s. Schema in Abb. 20). Man erkennt, dass die entstehende Abfolge und verhältnismäßige Größe der fluoreszenzmarkierten Bereiche, dem Hybridisierungsmuster am aberranten Chromosom des vorliegenden Falls entsprechen. Daraus ergibt sich für die Karyotypformel: 46,XY,dup(2)(p13p22) Abbildung 20: Schema des aberranten Chromosoms 2 mit direkter Duplikation. Der duplizierte Bereich ist blau eingefärbt Direkte Duplikation 4p (Fall 04-01) Klinische Befunde Der Patient wurde nach einer unauffällig verlaufenden Schwangerschaft in der 37. SSW spontan mit einem Geburtsgewicht von 2450 g, einer Geburtslänge von 43 cm, einem Kopfumfang von 32 cm und einem Apgar von 8/9/10 entbunden. Ab der ersten Lebenswoche fiel eine chronische Dermatitis auf. Bei einem vordiagnostizierten Hyper-IgE-Syndrom wurde der Patient im Alter von drei Jahren und drei Monaten stationär wegen eines fieberhaften Infekts der oberen Atemwege aufgenommen. Episoden rezidivierender Infekte waren bis dahin häufig aufgetreten. Die seit Geburt bestehende Neurodermitis bestand weiterhin. Mit einem Gewicht von 11,15 kg (< P 3) und einer Körperlänge von 85 cm (< P 3) war der Patient für sein Alter körperlich deutlich unterentwickelt. Ebenfalls war er in seiner Sprach- und statomotorischen Entwicklung deutlich verzögert. Die erste Zahnung war erst mit 18 Monaten eingetreten. Dies wurde auf eine vorliegende floride Rachitis zurückgeführt. Im Alter von fast 14 Jahren war der Patient massiv adipös mit einem Gewicht von 54 kg (> P 90) bei einer niedrigen Körperlänge von 143 cm (< P3). Diese Gewichtszunahme hatte sich im Laufe der Jahre langsam entwickelt begründet durch ein gestörtes Appetit/Essverhalten. Bis zu diesem Zeitpunkt hatte sich zudem eine Muskelschwäche entwickelt, die sich dahingehend äußerte, dass nach längeren Ruheperioden, das alleinige Aufstehen, Stehen und Gehen deutlich erschwert und

57 Ergebnisse verzögert war. Äußerlich fielen eine relative Mikrozephalie mit einem Kopfumfang von 53,5 cm (< P 25), ein kurzer Nacken, dezent tiefsitzende Ohren und ein kleiner Penis mit hypoplastischem Skrotum auf. Endokrinologisch war eine intermittierend auftretende Erniedrigung von Cortisol, ACTH und TSH gefunden worden Zyto- und molekularzytogenetische Untersuchungen Bei der zytogenetischen Auswertung der nach Giemsa gebänderten Metaphasechromosomen mit einer Bandenauflösung von ca. 400 ergab sich ein männlicher Karyotyp mit einem strukturell auffälligen Chromosom 4. Der kurze Arm dieses Chromosoms 4 zeigte eine deutliche Verlängerung (s. Abb. 21). Zur Klärung der Herkunft dieses überschüssigen genetischen Materials wurde eine Hybridisierung mit einer WCP-4-Sonde durchgeführt. Diese ergab an beiden Chromosomen 4 eine durchgängige Markierung. Die genauere Abklärung des duplizierten Bereichs gelang Abbildung 21: Partielles Karyogramm mit dem strukturell veränderten Chromosom 4 (Pfeil). nicht. Es handelte sich somit um eine interstitielle Duplikation 4, deren Herkunft sich mit den angewandten Methoden nicht exakt definieren ließ mband-analyse Zur weiteren Klärung dieser Aberration wurde eine mband-analyse mit einer Chromosom 4 spezifischen Sonde durchgeführt. Diese setzte sich aus sechs RPCPs zusammen. Bei einer der Regionen lag eine Doppelmarkierung mit Spectrum Orange TM und DEAC vor. Die restlichen Mikrodissektionsbibliotheken waren mit den bekannten Fluorochromen einzeln markiert (s. Abb. 22 C). Die Auswertung erfolgte an zehn Metaphasen. Es zeigte sich eine Verdopplung der einzelnen Bereiche der Fluoreszenzen DEAC und Cy5 im kurzen Arm (s. Abb. 22 B). Dabei stellte sich das untere Signal der beiden DEAC markierten Bereiche ein wenig stärker im Vergleich zum oberen dar. Dies galt auch im Vergleich zum DEAC Signal im kurzen Arm des normalen Chromosoms 4. Im Falle der Cy5 Signale war das untere der beiden im aberranten Chromosom 4 annähernd gleich intensiv wie das im kurzen Arm des normalen Chromosoms 4. Das obere der beiden Signale lag etwas abgeschwächt im Vergleich dazu vor. Diesen Sachverhalt erkannte man auch im Verlauf der Fluoreszenzintensitätskurven. Bei Anwendung der Falschfarben zeigte sich im kurzen Arm des aberranten Chromosoms 4 eine Verdopplung der Banden mit den Farben `Violett und `Rot, die im normalen Chromosom nur einfach vorhanden waren (Pfeile, Abb. 22 A). All dies deutete auf eine Vermehrung genetischen Materials hin, welche die Region umfasste, die laut Schema mit DEAC und Cy5 markiert war und von 4p12 bis 4p16 reichte (Abb. 22 C +

58 Ergebnisse Abb. 23). Eine Beteiligung weiterer, distal gelegener Bereiche, die Spectrum Orange, Texas Red und FITC markiert waren, lag nicht vor. A B Abbildung 22: mband mit Chromosom 4 spezifischer Sonde zur Strukturabklärung der Duplikation 4 (genauere Beschreibungen s. Text). FITC Cy5 DEAC Spectrum Orange Texas Red A. Normales Chromosom 4 B. Aberrantes Chromosom 4 C. Markierungsschema des Chromosoms 4 C

59 Ergebnisse Zusammenfassung der Ergebnisse Die Hybridisierung mit der Chromosom 4 spezifischen mband sowie der WCP-4-Sonde macht eine Beteiligung weiterer Chromosomen an dieser Aberration unwahrscheinlich. Über die mband-analyse lassen sich die Bruchpunkte klären. Das nur leicht verschmälerte untere DEAC Signal im kurzen Arm lässt auf einen nahezu terminal liegenden Bruchpunkt schließen, was nach dem Markierungsschema der Bande 4p16 entspricht (Abb. 22 C). Das nur leicht verschmälerte obere Cy5 Signal lässt auf einen zentromernahen proximalen Bruchpunkt in 4p12 schließen. In der Rekonstruktion der Fluoreszenzabfolge für das aberrante Chromsom 4 ergibt sich ein Markierungsschema das dem vorliegenden Ergebnis entspricht (s. Abb. 23). Die strukturelle Aberration kann daher über das Multicolour Banding als eine direkte Duplikation der Region 4p12 p16 interpretiert werden und der entsprechende Karyotyp lautet: 46,XY,dup(4)(p12p16) Abbildung 23: Schema des aberranten Chromosoms 4. Der duplizierte Bereich ist blau eingefärbt Duplikation 8p (Fälle und 08-03) Hierbei handelt es sich um die Fälle eines Mannes (Fall 08-03) und seines Vaters (Fall 08-02), die eine identische strukturelle Aberration aufweisen Klinische Befunde Bei allen untersuchten Personen waren keine auffälligen klinischen Befunde zu erheben. Bei der Ehefrau des Mannes waren allerdings mehrmalig Frühaborte aufgetreten, so dass im Rahmen einer geplanten in vitro Fertilisation oder intrazytoplasmatischen Spermieninjektion eine zytogenetische Untersuchung des betroffenen Ehepaares veranlasst wurde. Ein auffälliger Befund beim Ehemann ließ eine zusätzliche zytogenetische Untersuchung dessen Eltern folgen Zyto- und molekularzytogenetische Untersuchungen Die zytogenetischen Analysen aus Lymphozytenkulturen ergaben bei Sohn und Vater einen gleichermaßen auffälligen männlichen Karyotyp mit einem strukturell veränderten Chromosom 8, dessen kurzer Arm verlängert erschien (s. Abb ). Es wurden jeweils 25 GTG-gebänderte Metaphasechromosomen mit einer Bandenzahl von 450 nach ISCN ausgewertet.

60 Ergebnisse Abbildung 24: Partielles Karyogramm mit dem strukturell veränderten Chromosom 8 des Falles Der kurze Arm des aberranten Chromosoms 8 erscheint verlängert (Pfeil). Abbildung 25: Partielles Karyogramm mit dem strukturell veränderten Chromosom 8 des Falles Der kurze Arm des aberranten Chromosoms 8 erscheint verlängert (Pfeil). Bei Fall wurde zur weiteren Strukturabklärung der Aberration eine FISH-Analyse mit einer Chromosom 8 spezifischen WCP-Sonde (WCP 8, Vysis) sowie einer Sonde für die Subtelomerregion des kurzen Arms (D8S596, 8p23 8pter, Oncor) durchgeführt. Nach Hybridisierung mit der WCP-8-Sonde ergab sich an beiden Chromosomen 8 eine durchgängige Markierung, wobei eine diskrete Verlängerung des kurzen Arms an einem Chromosom auffiel. Die Hybridisierung mit der Sonde für die Subtelomerregion des kurzen Arms zeigte an beiden Chromosomen regelrechte Signale mit einer dezenten Signalverstärkung an einem Chromosom 8 (s. Abb. 26). Abbildung 26: Dual-FISH mit WCP 8 (grün) und D8S596 (rot). Es zeigte sich eine komplette Markierung beider Chromosomen mit der WCP-8-Sonde. Das aberrante Chromosom 8 (Pfeil) wies eine leichte Signalverstärkung des p-subtelomer Signals auf. Als Ergebnis dieser Untersuchungen wurde für beide Fälle folgender Karyotyp erstellt: 46,XY,dup(8)(p23.1p23.3)

61 Ergebnisse mband-analyse Zur Verifizierung dieser Ergebnisse wurden Hybridisierungen mit Chromosom 8 spezifischen mband-sonden durchgeführt. Diese beinhalteten fünf verschiedene, überlappende Mikrodissektionsbibliotheken, die mit den bekannten Fluorochromen einzeln markiert waren (s. Abb. 27 C). Bei der Auswertung des Falles fand man einen verbreiterten FITC markierten Bereich und ein dezent vergrößertes Peak für FITC im Kurvenverlauf der Fluoreszenzintensitäten. Dies entsprach der Verbreiterung der terminalen Bande mit der Farbe `Türkis (s. Abb. 27 B). Eine Beteiligung des angrenzenden, mit dem Fluorochrom Cy5 markierten Bereichs oder weiter distal liegender Chromosomabschnitte lag nicht vor. Damit ergab sich eine Duplikation genetischen Materials des Bereichs, der ausschließlich mit FITC markiert war. Dieser Region entsprachen laut Markierungsschema die Banden 8p22 p23.3 (s. Abb. 27 C). Bei der mband Analyse des Falles stellte sich ein vergleichbarer Befund dar. A B Abbildung 27: mband mit Chromosom 8 spezifischer Sonde zur Strukturabklärung der interstitiellen Duplikation 8p (genauere Beschreibungen s. Text). FITC Cy5 DEAC Spectrum Orange Texas Red A. Normales Chromosom 8 B. Aberrantes Chromosom 8 C. Markierungsschema des Chromosoms 8 (möglicher Bereich der Duplikation mit Balken markiert) C

62 Ergebnisse Zusammenfassung der Ergebnisse Die Hybridisierung mit der WCP-8-Sonde sowie die mband-analyse machen das Mitwirken weitere Chromosomen an dieser Aberration unwahrscheinlich. Mit dem Multicolour Banding läßt sich nur eine Vermehrung genetischen Materials aus dem Bereich 8p22 p23.3 feststellen. Es ist nicht möglich die exakten Bruchpunkte zu bestimmen. Anhand der konventionellen zytogenetischen Färbung und der FISH wird in beiden Fällen die vorliegende strukturelle Anomalie als eine Duplikation der Region 8p23.1 p23.3 interpretiert. Ob eine direkte oder invertierte Duplikation vorliegt, lässt sich letztlich nicht klären. Auch über das mband ergibt sich kein Hinweis, da die Aberration nur einen Bereich betraf, der keine Überlappung mit einer angrenzenden Region aufwies. Der Karyotyp der beiden familiären Fälle lautet: 46,XY,dup(8)(p23.1p23.3) Duplikation 17p (Fall 17-01) Klinische Befunde Im Alter von 1 8/12 Jahren wurde bei dem Patienten eine Entwicklungsretardierung und Sprachentwicklungsstörung diagnostiziert. Des Weiteren fiel eine auffällige Facies mit insgesamt spitzem Gesicht, tief sitzenden Ohren und einer hohen vorgewölbten Stirn auf Zyto- und molekularzytogenetische Untersuchungen Die zytogenetische Analyse wurde an 25 Metaphasechromosomen aus einer Lymphozytenkultur mit einer Bandenzahl von 500 nach ISCN durchgeführt. Dabei ergab sich ein strukturell auffälliger männlicher Karyotyp mit einer subtilen Veränderung des kurzen Arms eines Chromosoms 17 (s. Abb. 28). Die FISH mit einer Chromosom 17 spezifischen WCP-Sonde (WCP 17, Vysis) ergab an sieben ausgewerteten Metaphasen eine vollständige Markierung des aberranten Chromosoms. Die nachfolgenden Untersuchungen der Miller-Dieker-Region in 17p13.3 (Oncor) und des p53-gens lokalisiert in 17p13.1 (Oncor) ergaben an ebenfalls sieben ausgewerteten Metaphasen keine Unregelmäßigkeiten. Aus diesen zyto- und molekularzytogenetische Ergebnissen ergab sich als Karyotyp: Abbildung 28: Partielles Karyogramm mit strukturell verändertem Chromosom 17 (rechts). 46,XY,dup(17)(p11.2p12)

63 Ergebnisse mband-analyse Zur genaueren Abklärung der vorliegenden strukturellen Veränderung an einem Chromosom 17 wurde eine mband-analyse mit einer Chromosom 17 spezifischen Sonde durchgeführt. Diese setzte sich aus drei verschiedenen, überlappenden RPCPs zusammen, die mit DEAC, Texas Red und FITC markiert waren (s. Abb. 29 C). Bei der Auswertung des mband Musters fiel eine deutliche Signalverstärkung für DEAC im aberranten Chromosom 17 auf. Die Signale für Texas Red und FITC waren unverändert. Entsprechend fand sich eine verbreiterte terminale, `gelbe Falschfarbenbande in dem aberranten Chromosom 17 im Vergleich zum normalen (s. Abb. 29 A+B). Somit lag eine Vermehrung genetischen Materials des Bereichs vor, der laut Markierungsschema ausschließlich mit DEAC markiert war. Dies entsprach einer Region, die die Banden von distal 17p11.2 bis 17pter umfasste (Abb. 29 C). Jedoch war eine komplette Duplikation dieses Bereichs aufgrund der nur dezenten Signalverstärkung auszuschließen. Eine nähere Eingrenzung der duplizierten Region war mit dem Multicolour Banding nicht möglich. A B Abbildung 29: mband mit Chromosom 17 spezifischer Sonde zur Strukturabklärung der interstitiellen Duplikation 17p (genauere Beschreibungen s. Text). DEAC Texas Red FITC A. Normales Chromosom 17 B. Aberrantes Chromosom 17 C. Markierungsschema des Chromosoms 17 (möglicher Bereich der Duplikation mit Balken markiert) C

64 Ergebnisse Zusammenfassung der Ergebnisse Eine Beteiligung weiterer Chromosomen an dieser Aberration ist aufgrund der vorliegenden durchgeführten Hybridisierungen auszuschließen. Die Auswertung des mband deutet auf eine Duplikation im ausschließlich DEAC markierten Bereich hin, der genetisches Material zwischen den Banden 17p11.2 und 17pter beinhaltet. In Anbetracht des vorliegenden zytogenetischen Befundes und der durchgeführten Fluoreszenz in situ Hybridisierungen mit LSI-Sonden, die eine Duplikation im Bereich 17p13.1 bis 17p13.3 ausschließen, wird die vorliegende Aberration als Duplikation des Bereichs 17p11.2 p12 interpretiert. Die Orientierung dieser Duplikation kann mit den verwendeten Methoden nicht abgeklärt werden. Der dazugehörige Karyotyp des Patienten lautet: 46,XY,dup(17)(p11.2p12) Duplikation 18q (Fälle 18-02, pränatal und 18-01, Mutter) Klinische Befunde Bei der 36-jährigen Mutter wurde in der unauffällig verlaufenden Schwangerschaft aus Altersgründen eine Amniozentese durchgeführt. Die Amnionzellen des Fetus (18-02) wurde ebenso wie eine Blutprobe der Mutter untersucht (18-01). Über den weiteren Verlauf der Schwangerschaft und nachgeburtliche Untersuchungsbefunde lagen keine Informationen vor. Die Mutter zeigte keine klinischen Auffälligkeiten Zyto- und molekularzytogenetische Untersuchungen Bei der zytogenetischen Untersuchung der Chromosomen sowohl des Fetus als auch der Mutter wurde jeweils ein strukturell auffälliger weiblicher Karyotyp gefunden. Die strukturelle Veränderung betraf den langen Arm eines Chromosoms 18, in dem eine Vermehrung genetischen Materials zu sehen war (s. Abb. 30). Die Bandenauflösung nach ISCN lag bei durchschnittlich 500 Banden. Eine FISH mit einer LSI-Sonde für die Region 18q22.3 ergab bei Fetus und Mutter ein auffälliges Hybridisierungsmuster in der Form, dass an je einem Chromosom 18 das Signal zweifach im langen Arm vorlag. Aus diesen Ergebnissen ergab sich eine Duplikation eines Bereichs des langen Arms ohne eine genaue Bruchpunktbestimmung. Abbildung 30: Partielles Karyogramm des Fetus. Chromosomenpaar 18 mit aberrantem Chromosom rechts mband-analyse Zur Bestätigung der vorangegangenen Resultate wurde die Hybridisierung mit einer für das Chromosom 18 spezifischen Sonde bei Fetus und Mutter durchgeführt. Diese beinhaltete drei

65 Ergebnisse verschiedene, überlappende RPCPs, die mit FITC, Spectrum Orange TM und DEAC markiert waren (s. Abb. 31 C). Bei der Auswertung des mband wurde bei den Metaphasechromosomen des Fetus eine deutliche Verstärkung des Fluoreszenzsignals von DEAC im aberranten Chromosom beobachtet. Dazu zeigte sich entsprechend eine Verbreiterung des Peaks im Verlauf der Fluoreszenzintensitäten. Bei Anwendung der Falschfarben war eine Verbreiterung der terminalen Falschfarbenbande `Violett zu erkennen (s. Abb. 31 A+B). Eine Beteiligung der Bereiche, die mit Spectrum Orange und FITC markiert waren, lag nicht vor. Somit konnte von einer Vermehrung genetischen Materials in der Region, die im Markierungsschema rein mit DEAC markiert war und die Banden 18q umfasste, ausgegangen werden (s. Abb. 31 C). Bei der Untersuchung der mütterlichen Chromosomen mit der Methode des Multicolour Bandings war eine entsprechende Veränderung zu diagnostizieren. A B Abbildung 31: mband mit Chromosom 18 spezifischer Sonde zur Strukturabklärung der interstitiellen Duplikation 18q (genauere Beschreibungen s. Text). FITC Spectrum Orange DEAC A. Normales Chromosom 18 B. Aberrantes Chromosom 18 C. Markierungsschema des Chromosoms 18 (möglicher Bereich der Duplikation mit Balken markiert) C

66 Ergebnisse Zusammenfassung der Ergebnisse Die Ergebnisse aus den zytogenetischen und molekularzytogenetischen Voruntersuchungen deuten auf eine Duplikation genetischen Materials aus dem langen Arm eines Chromosoms 18 hin. Mittels mband-analyse kann der Bereich präzisiert werden. Der proximale Bruchpunkt liegt knapp unterhalb der Überlappungsregion von DEAC und Spectrum Orange, aber noch distal in der Bande q21.3. Der distale Bruchpunkt kann auf die Bande q23 festgelegt werden (s. Abb. 31 C). Somit liegt sowohl bei dem Fetus als auch der Mutter eine Duplikation des Bereichs 18q vor. Ob es sich dabei um eine direkte oder invertierte Duplikation handelt, kann mit den verwendeten Methoden nicht sicher bestimmt werden. Das GTG-Bandenmuster macht jedoch eine direkte Duplikation wahrscheinlich. Die entsprechenden Karyotypformeln lauten: 46,XX,dup(18)(q21.3q23) Fetus 46,XX,dup(18)(q21.3q23) Mutter Inverse Duplikation 19 (Fälle 19-01, pränatal, 19-02, Mutter und 19-03, Vater) Klinische Befunde In der unauffällig verlaufenden Schwangerschaft wurde bei einer Vorsorgeuntersuchung in der SSW ein auffälliger Sonographiebefund erhoben. Es zeigten sich eine Brachycephalie, ein `white spot im linken Ventrikel, ein kurzer Femur, Zystennieren beidseits, eine nur singulär vorliegende Arterie der Nabelschnur und ein Polyhydramnion. Aufgrund der vorliegenden Ergebnisse wurde das Risiko einer chromosomalen Störung als hoch eingestuft und in Rücksprache mit den Eltern eine Fruchtwasseruntersuchung durchgeführt. Dieser Eingriff verlief komplikationslos. Die 35-jährige Mutter wies keine klinischen Auffälligkeiten auf Zyto- und molekularzytogenetische Untersuchungen Die zytogenetische Untersuchung der Chromosomen des Fetus aus Amnionzellen ergab einen strukturell auffälligen männlichen Karyotyp mit einer Verlängerung eines kurzen Arms eines Chromosoms 19 (s. Abb. 32). Die daraufhin durchgeführte Chromosomenuntersuchung der Eltern zeigte unauffällige Karyotypen, so dass die Chromosomenveränderung beim ungeborenen Kind neu entstanden sein muss. Zur weiteren Diagnostik wurde eine FISH-Analyse mit einer Chromosom 19 spezifischen WCP-Sonde (WCP 19, Vysis) durchgeführt. Dabei zeigte sich das aberrante Chromosom 19 des Abbildung 32: Partielles Karyogramm des Fetus. Links im Bild das aberrante Chromosom 19 mit verlängertem kurzen Arm.

67 Ergebnisse Fetus durchgängig markiert. Die Untersuchung der Zentromerregion mittels FISH mit einer Probe für die alpha-satelliten DNA der Chromosomen 1, 5 und 19 (Oncor) wies am aberranten Chromosom 19 ein vergrößertes Signal auf, das in den kurzen Arm verlagert erschien (s. Abb. 33). Dies ließ eine inverse Duplikation vermuten. Ein eindeutiger Karyotyp konnte aus diesen Ergebnissen allerdings nicht abgeleitet werden. Abbildung 33: FISH mit Sonde für die Zentromerregionen der Chromosomen 1, 5 und 19 (D1Z1/D5Z2/D19Z3, Oncor). Das aberrante Chromosom 19 (Pfeil) zeigt im Vergleich zum normalen Chromosom 19 (mit 19 markiert) ein vergrößertes Zentromersignal, das in den verlängerten kurzen Arm hinein reicht. Ebenfalls im Ausschnitt zu sehen, ist das Zentromersignal für ein Chromosom 1 (mit 1 markiert) mband-analyse Über Multicolour Banding mit einer Chromosom 19 spezifischen Sonde sollte die Strukturaberration weiter abgeklärt werden. Die mband-sonde für das Chromosom 19 setzte sich aus vier verschiedenen, überlappenden Mikrodissektionsbibliotheken zusammen. Diese wurden mit den Fluorochromen Spectrum Orange, Texas Red, FITC und DEAC einzeln markiert (s. Abb. 34 C). Bei der mband-analyse zeigte sich beim aberranten Chromosom ein zweites Signal für DEAC, das zentromernah im kurzen Arm zu liegen kam. Dieses schien nahezu gleich intensiv wie das regelrechte Signal im langen Arm. Zudem war das Signal für Texas Red gespalten, wobei ein Anteil ebenfalls zentromernah im kurzen Arm und der andere terminal unterhalb des Signals für Spectrum Orange lag. Dazwischen lag der duplizierte DEAC markierte Chromosomenabschnitt. Die Signale für Texas Red stellten sich insgesamt verstärkt gegenüber dem einzelnen Signal im unauffälligen Chromosom dar (s. Abb. 34 A+B). Der Strukturveränderung lag demnach eine Vermehrung genetischen Materials der Region zugrunde, die im normalen Markierungsschema mit DEAC markiert war. Außerdem war ein Teil des Texas Red markierten Bereichs vermehrt (s. Abb. 34). Eine Beteiligung der terminalen Region des kurzen Arms (Spectrum Orange ) an dieser Strukturveränderung wurde ausgeschlossen. Bei der Analyse von 5 Metaphasen zeigte sich teils ein dezentes zweites Signal von FITC im kurzen Arm des aberranten Chromosoms, welches mit dem zusätzlichen Signal

68 Ergebnisse von DEAC überlappte. Zu erkennen war dies an einer leicht ansteigenden zusätzlichen Kurve von FITC im kurzen Arm im Fluoreszenzintensitätskurvenverlauf. Dies sprach für eine minimale Beteiligung des Überlappungsbereichs zwischen DEAC und FITC an dieser Aberration. Bei Anwendung der Falschfarben zeigte sich an einem der Chromosomen 19 des Fetus eine Duplikation der Banden `Braun, `Dunkelblau und `Rot aus dem langen Arm (Bereich zwischen Pfeilen, Abb. 34 A), die sich gespiegelt im kurzen Arm wiederfanden. Das Multicolour Banding der elterlichen Chromosomen mit der gleichen Chromosom 19 spezifischen mband-sonde ergab keine strukturellen Veränderungen an deren Chromosomen 19 (Daten nicht gezeigt). A B Abbildung 34: mband mit Chromosom 19 spezifischer Sonde zur Strukturabklärung der Duplikation 19 (genauere Beschreibungen s. Text). Spectrum Orange Texas Red DEAC FITC A. Normales Chromosom 19 des Fetus B. Aberrantes Chromosom 19 des Fetus C. Markierungsschema des Chromosoms 19 (Bereich der inversen Duplikation mit Balken markiert) C

69 Ergebnisse Zusammenfassung der Ergebnisse Die Ergebnisse der zytogenetischen und molekularzytogenetischen Untersuchungen führen zu dem Ergebnis, dass es sich bei dieser Strukturveränderung an einem Chromosom 19 um eine inverse Duplikation handelt. Die Verdopplung des DEAC Bereichs inklusive eines kleinen Überlappungsbereichs mit FITC spricht für einen distalen Bruchpunkt bei 19q13.2. Der proximale Bruchpunkt wird aufgrund der dezenten Beteiligung des Texas Red an der Signalzunahme knapp oberhalb des Zentromers im kurzen Arm bei 19p11 festgelegt. Damit liegt der Strukturaberration eine inverse Duplikation der Region 19p11 q13.2 vor. Das Schema der Fluoreszenzabfolge des aberranten Chromosoms 19 zeigt, dass sich aus dieser Strukturveränderung ein verbreitertes Zentromer ergibt, welches sich in der FISH für die Zentromerregion nachweisen lässt (s. Abb. 35). Der Karyotyp des Fetus lautet: Die Eltern zeigten unauffällige Karyotypen: Abbildung 35: Schema der Fluoreszenzabfolge am aberranten Chromosom 19. Der invers duplizierte Bereich ist blau eingefärbt. 46,XY,inv dup(19)(p11q13.2) 46,XX (Mutter) und 46,XY (Vater) Duplikation 9 durch überzähliges Markerchromosom (Fall 09-04) Klinische Befunde Bei der Patientin lagen keine klinischen Auffälligkeiten vor. Die 43-jährige Patientin war selbst schon schwanger, was allerdings mit einem Abort endete. Bei dem Fetus wurde postmortal eine zytogenetische Untersuchung durchgeführt, die ein überzähliges Markerchromosom (SMC=supernummary marker chromosome) zeigte. Dessen Herkunft sollte zunächst über eine Chromosomenuntersuchung der Mutter geklärt werden Zyto- und molekularzytogenetische Untersuchungen Die Chromosomenanalyse der mütterlichen Metaphasen ergab einen auffälligen Mosaikkaryotyp mit dem gleichen überzähligen Markerchromosom unbekannter Herkunft. Zugrunde lag ein ansonsten unauffälliger weiblicher Karyotyp (s. Abb. 36).

70 Ergebnisse Abbildung 36: Karyogramm der Patientin mit kleinem überzähligen Markerchromosom unbekannter Herkunft (Pfeil). Zur Identifizierung des SMC wurde eine Mikrodissektion mit Reversem Painting durchgeführt. Bei der mikroskopischen Auswertung zeigte sich, dass bei Hybridisierung an regelrechten Metaphasechromosomen eines gesunden, männlichen Spenders beide Chromosomen 9 eine Markierung im Bereich 9p12 q11.1 und 9q13 aufwiesen (s. Abb. 37 A+B). Die nachfolgende Hybridisierung mit einer Chromosom 9 spezifischen WCP-Sonde (WCP 9, Vysis) ergab eine dezente Markierung, die häufig durch das Signal der gleichzeitig hybridisierten CEP-9-Sonde (Vysis) für die alpha-satelliten-dna überlagert wurde (s. Abb. 37 C). Das Markerchromosom war außerdem negativ für eine Sonde, die spezifisch die classical-satelliten-dna in 9q12 (D9Z1, Oncor) detektierte (s. Abb. 37 D). Der sich daraus ergebene Karyotyp lautet: 46,XX / 47,XX,+ der (9)(:p12 q11.1::q13 q13:)

71 Ergebnisse A B C Abbildung 37: A. + B. FISH nach Mikrodissektion des Ringchromosoms (grün). Reverses Painting auf Metaphasechromosomen eines gesunden männlichen Spenders (A) wies eine spezifische Hybridisierung im Bereich 9p12 q11.1 und 9q13 der Chromosomen 9 (mit 9 markiert) auf. Bei der Rückhybridisierung auf Chromosomen der betroffenen Patientin (B) zeigte sich ebenfalls eine Markierung dieser Bereiche (mit 9 markiert) sowie die vollständige Markierung des SMCs (Pfeil). C. Dual FISH mit WCP-9- (rot) und CEP-9-Sonde (grün). Am Marker (Pfeil) war nur ein Signal für den Zentromerbereich zu erkennen. Die normalen Chromosomen 9 zeigten regelrechte Markierungen. D. Dual FISH mit Sonden für die alpha- (CEP 9, grün) und die classical-satelliten-dna (D9Z1, rot). Auf dem Marker war lediglich das grüne für die alpha-satelliten-dna spezifische Signal vorhanden. D mband-analyse Zur Verifizierung der vorangegangenen Ergebnisse wurde eine mband-analyse mit einer Chromosom 9 spezifischen Sonde durchgeführt. Diese setzte sich aus fünf verschiedenen RPCPs zusammen, die mit den Fluorochromen FITC, DEAC, Cy5 TM, Spectrum Orange TM und Texas Red markiert waren, zusammen. Die Analyse von 4 Metaphasen mit vorhandenem Markerchromosom ergab an diesem eine Markierung mit den Fluorochromen FITC und Cy5 (s. Abb 38 B). Eine Markierung mit den Fluorochromen DEAC, Spectrum Orange und Texas Red lag nicht vor, was für eine Nichtbeteiligung der Bereiche sprach, die im normalen Chromosom 9 mit diesen Fluoreszenzfarbstoffen markiert waren (siehe Abb. 38 C). Im Markierungsschema erkannte man außerdem, dass eine Markierung der classical-satelliten-dna

72 Ergebnisse in 9q12 mit der verwendeten mband-sonde nicht möglich war. Die Anwendung eines Falschfarbenklassifikators zeigte, dass die Region der Falschfarbe `Braun, die einen zentromernahen Bereich umfasste, einen Großteil des Markerchromosoms ausmachte (s. Abb. 38 B). A B Abbildung 38: mband mit Chromosom 9 spezifischer Sonde zur Strukturabklärung des SMC (genauere Beschreibungen s. Text). FITC Cy5 DEAC Spectrum Orange Texas Red A. Normale Chromsomen 9 B. Markerchromosom C. Markierungsschema des Chromosoms 9 C Zusammenfassung der Ergebnisse Das kleine üerzählige Markerchromosom beinhaltet nach den molekularzytogenetischen Analysen genetisches Material von Chromosom 9. Durch die Ergebnisse der Mikrodissektion gelingt eine genauere Festlegung, welche Region des Chromosoms 9 den Marker bildet.

73 Ergebnisse Demnach liegt bei dem Markerchromosom ein Derivat des Chromosoms 9 vor, welches komplex rearrangiert ist und aus zwei unterschiedlichen chromosomalen Regionen besteht (Banden 9p12 q11.1 und 9q13). Die mband-analyse konnte dieses Ergebnis bestätigen. Der Karyotyp lautet: 46,XX / 47,XX,+ der (9)(:p12 q11.1::q13 q13:) Komplexes Rearrangement mit inverser Duplikation 8p (Fall 08-01) Klinische Befunde In der Schwangerschaft fiel ab der 33. SSW ein Wachstumsstillstand auf. Bei unverändertem Zustand des Fetus wurde daher in der 36. SSW eine Sectio durchgeführt. Das Geburtsgewicht des Kindes lag bei 2000 g, die Länge bei 42 cm und der Apgarwert bei 9/10/10. Das Neugeborene zeigte bei einer kurz nach der Geburt durchgeführten Untersuchung auffällige faziale Dysmorphiezeichen mit prominenter Stirn und eingesunkener Nasenwurzel. Ebenfalls fiel bei einer kardiologischen Untersuchung eine Pulmonalarterienstenose auf. In der Neonatalperiode zeigten sich zusätzlich deutliche Ernährungsschwierigkeiten. Es wurde der Verdacht auf ein Williams-Beuren-Syndrom geäußert Zyto- und molekularzytogenetische Untersuchungen Bei der zytogenetischen Untersuchung an 24 GTG-gebänderten Chromosomensätzen mit einer durchschnittlichen Bandenzahl von 400 Banden nach ISCN ergab sich ein strukturell auffälliger weiblicher Karyotyp mit einer Verlängerung des kurzen Arms von einem Chromosom 8 (s. Abb 39). Zur Klärung der Frage, ob dieser Aberration eine Translokation zu Grunde lag, wurde eine FISH- Analyse mit einer Chromosom 8 spezifischen WCP-Sonde (WCP 8, Vysis) durchgeführt. Diese ergab an dem Derivativchromosom eine durchgängige Markierung, wobei eine Verlängerung des kurzen Arms Abbildung 39: Partielles Karyogramm der Patientin mit strukturell verändertem Chromosom 8 (Pfeil). zu vermerken war (s. Abb. 40). Anhand des Hybridisierungsmusters konnte geklärt werden, ob es sich um eine Translokation oder eine Duplikation handelte. Die Hybridisierung mit einer Subtelomersonde für den kurzen Arm von Chromosom 8 (D8S596, Oncor) ergab an dem aberranten Chromosom 8 kein spezifisches Signal (s. Abb 40). Somit konnte zusätzlich zu der Duplikation eine terminale Deletion des Bereichs 8p23.1 pter entdeckt werden. Die genauere Herkunft des duplizierten Bereichs des aberranten Chromosoms 8 ließ sich nicht abklären. Die Hybridisierung mit einer LSI-Sonde für die kritische Region des Williams-Beuren-Syndroms in 7q11.23 (LSI ELN, Vysis) ergab in allen untersuchten Metaphasen regelrechte Signale. Nach diesen Ergebnissen lautete der vorläufige Karyotyp: 46,XX, del (8)(p23.1pter) dup(? )

74 Ergebnisse Abbildung 40: Dual FISH mit WCP-8-Sonde (grün) und Subtelomer-Sonde für den kurzen Arm, D8S596 (rot). Es zeigte sich eine komplette Markierung beider Chromosomen mit der WCP-8-Sonde. Das aberrante Chromosom (Pfeil) wies den Verlust der Subtelomerregion auf mband-analyse Die Hybridisierung mit einer Chromosom 8 spezifischen mband-sonde ergab ein dezent verbreitertes Signal des terminal im kurzen Arm liegenden Fluorochroms FITC. Im Verlauf der Fluoreszenzintensitätskurven des Derivativchromosoms 8 fiel entsprechend ein verbreiterter Peak für FITC, bei unveränderten Peaks für das angrenzende Fluorochrom Cy5, sowie DEAC, Spectrum Orange und Texas Red auf (Abb. 41 A + B, rechter Teil). Bei Betrachtung der Falschfarbenbanden zeigte sich eine verbreiterte, p-terminale Bande mit der Farbe `Türkis beim aberranten Chromosom 8 im Vergleich zum normalen Chromosom 8 (Abb. 41 A + B, linker Teil).

75 Ergebnisse A B Abbildung 41: mband mit Chromosom 8 spezifischer Sonde zur Strukturabklärung des komplexen Rearrangments (genauere Beschreibungen s. Text). FITC Cy5 DEAC Spectrum Orange Texas Red A. Normales Chromsom 8 B. Aberrantes Chromosom 8 C. Markierungsschema des Chromosoms 8 (Bereich der Duplikation mit Balken markiert) C Zusammenfassung der Ergebnisse Nach den molekularzytogenetischen Ergebnissen ist eine Beteiligung weiterer Chromosomen an dieser Strukturaberration mit großer Wahrscheinlichkeit auszuschließen. Bei dem aberranten Chromosom kann von einem Verlust der terminalen Region 8p23.1 pter ausgegangen werden, da bei der FISH mit der spezifischen Sonde für diese Region das entsprechende Signal fehlt. Sowohl in der konventionellen Bänderung, der FISH mit einer WCP-8-Sonde als auch der mband-analyse liegt ein deutlicher Hinweis auf einen verlängerten kurzen Arm vor, der aus einer intrachromosomalen Duplikation entstanden sein muss, die signifikant größer ist als die gleichzeitig vorhandene Deletion. Über mband kann gezeigt werden, dass die Duplikation nur die ausschließlich FITC markierte Region betraf, ohne den angrenzenden Cy5 TM markierten Bereich. Dies entspricht einer Region, die die Banden von 8p22 bis 8p23.1 umfasst (s. Abb. 41 C). In Zusammenhang mit dem G-Bandenmuster basiert die Verlängerung des kurzen Arms des aberranten Chromosoms 8 auf einer Inversionsduplikation der Banden 8p22 p23.1 bei gleichzeitigem Verlust der terminalen Region 8p23.1 pter. Der Verlust der terminalen Region

76 Ergebnisse bei gleichzeitiger Duplikation proximal gelegener, identisch markierter Chromosomenabschnitte läßt sich über das mband nicht nachweisen. Dafür gelang die genauere Identifizierung des duplizierten Bereichs. Der Karyotyp der Patientin lautet: 46,XX, inv dup del(8)(p22p23.1)(p23.1pter) 3.4 Inversionen Im Rahmen dieser Arbeit wurden in drei Familienfällen verschiedene Inversionen gefunden Perizentrische Inversion 2 (Fall 02-01, Sohn und Fall 02-02, Mutter) Klinische Befunde Bei dem Jungen zeigte sich im Alter von 3 11/12 eine leichte allgemeine Entwicklungs- und darüber hinausgehende Sprachentwicklungsstörung. Zudem lag eine minimale zerebrale Bewegungsstörung vor. Ein auffälliges Verhaltensmuster mit Eigensinn, Lebhaftigkeit und Distanzarmut konnte ebenfalls beobachtet werden. Eine ehemals vorhandene Gaumenspalte war zu diesem Zeitpunkt bereits operativ versorgt worden. Um den proportionierten Minderwuchs abzuklären, wurde ein Arginin-Insulin-Belastungstest durchgeführt, der allerdings keine Pathologika der Wachstumshormonausschüttung aufwies. Ebenfalls konnte ein Malabsorptionssyndrom in Form einer Zöliakie ausgeschlossen werden. Bei der Mutter sind keine klinischen Auffälligkeiten bekannt Zyto- und molekularzytogenetische Untersuchungen Sowohl bei Kind als auch bei der Mutter wurde an 18 ausgewerteten Metaphasen auf einem Bandenniveau nach ISCN von 450 ein strukturell verändertes Chromosom 2 gefunden (s. Abb 42+43). Abbildung 42: Partielles Karyogramm von Fall (Sohn) mit dem aberranten Chromosom 2 (rechts). Abbildung 43: Partielles Karyogramm von Fall (Mutter) mit dem aberranten Chromosom 2 (rechts).

77 Ergebnisse Bei dem Kind wurde zusätzlich eine FISH mit einer WCP-2-Sonde (WCP 2, Vysis), die das komplette Chromosom 2 markiert, durchgeführt. Diese ergab eine vollständige Markierung des aberranten Chromosoms 2 (s. Abb. 44). Abbildung 44: FISH mit WCP 2 (grün). Es zeigte sich eine komplette Markierung beider Chromosomen mit der WCP-2-Sonde. Das aberrante Chromosom (Pfeil) zeigte eine Veränderung bezüglich der Relation zwischen kurzem und langem Arm. Es wirkte nahezu metazentrisch. Der Karyotyp nach diesen Untersuchungen lautete für den Sohn: Für die Mutter war der entsprechende Karyotyp definiert worden: 46,XY,inv(2)(p13q21) 46,XX,inv(2)(p13q21) mband-analyse Zur präziseren Bestimmung der Bruchpunkte der Inversion wurde sowohl bei Kind als auch Mutter eine Multicolour Banding Analyse mit einer für das Chromosom 2 spezifischen Sonde durchgeführt. Bei der Auswertung der einzeln angezeigten Fluorochrombereiche zeigte sich im aberranten Chromosom die Verlagerung des Texas Red Signals aus dem langen in den kurzen Arm. Außerdem war im Vergleich zu dem Markierungsschema zu sehen, dass das obere Signal für DEAC in zwei annähernd gleich intensive Signale im aberranten Chromosom gespalten wurde, von denen eines im kurzen und eines im langen Arm lag. Das mittlere und untere FITC Signal schien unverändert. Im Fluoreszenzintensitätsverlauf zeigte sich jedoch, dass es sich beim mittleren FITC Signal des aberranten Chromosoms um eine Summation von Teilsignalen aus der Kombination mit DEAC und der Überlappung mit Texas Red und beim unteren Signal um eine Summation der Teilsignale aus der Kombination mit DEAC und der Überlappung mit Spectrum Orange handelte. Die restlichen Signale für Spectrum Orange und Cy5 lagen unverändert vor (s. Abb. 45 A+B). Bei der mittleren irregulär auftretenden Bande im Cy5 Fenster handelte es sich um ein Durchscheinen des Texas Red Signals im Cy5 Filter. Bei Anwendung der Falschfarben zeigte sich, dass der zwischen den Banden mit den Farben `Orange und `Rot liegende Bereich im aberranten Chromosom invertiert war, wobei Teile

78 Ergebnisse dieser beiden Falschfarbenbanden sowohl mit invertiert als auch an den ursprünglichen Stellen verblieben waren (s. Abb. 45 A+B). Die Auswertung der Hybridisierung an den mütterlichen Chromosomen ergab ein entsprechendes Ergebnis. A B Abbildung 45: mband mit Chromosom 2 spezifischer Sonde zur Strukturabklärung der perizentrischen Inversion 2 (genauere Beschreibungen s. Text). FITC Cy5 DEAC Spectrum Orange Texas Red A. Normales Chromosom 2 B. Aberrantes Chromosom 2 C. Markierungsschema des Chromosoms 2 (möglicher Bereich der Inversion mit Balken markiert) C

79 Ergebnisse Zusammenfassung der Ergebnisse Aufgrund der Hybridisierungsmuster der WCP-2-Sonde und des mband ist eine Beteiligung weitere Chromosomen an dieser Strukturaberration auszuschließen. Das veränderte GTG- Bandenmuster und das veränderte Falschfarbenmuster sind auf eine perizentrische Inversion zurückzuführen. Die genaue Bruchpunktbestimmung gelingt über das Multicolour Banding. Da die an der Inversion beteiligten FITC-Signale unverändert scheinen, liegen die Bruchpunkte vermutlich in der Mitte des im Markierungsschema mit DEAC kombinierten FITC Bereichs und in der Mitte des unteren FITC Bereichs, genau zwischen den Überlappungen mit Texas Red und Spectrum Orange (s. Abb. 46 C). Daraus ergibt sich eine perizentrische Inversion des Chromosomenabschnitts 2p13 2q22. Der Karyotyp für das Kind lautet: 46,XY,inv(2)(p13q22) Der Karyotyp für die Mutter ist: 46,XX,inv(2)(p13q22) Abbildung 46: Schema der Fluorochromabfolge beim aberranten Chromosom mit perizentrischer Inversion. Der invertierte Bereich ist blau eingefärbt Parazentrische Inversion 2p (Fall 02-04, pränatal und Fall 02-05) Klinische Befunde Aus Altersindikation wurde bei der 36-jährigen Schwangeren in der 22. SSW eine Amniozentese durchgeführt. Der Schwangerschafsverlauf war bis zu dem Zeitpunkt unauffällig. Eine Ultraschalluntersuchung zeigte einen normal entwickelten Feten ohne sonographische Zeichen einer syndromalen Erkrankung Zyto- und molekularzytogenetische Untersuchungen Bei der zytogenetischen Untersuchung zeigte sich beim Fetus an Metaphasechromosomen, die aus den Amnionzellen gewonnen wurden, ein auffälliger weiblicher Karyotyp, der sich durch eine strukturelle Veränderung am kurzen Arm eines Chromosoms 2 auszeichnete (s. Abb. 47). Die Auflösung der GTG-Bänderung lag bei ca. 450 nach ISCN. Bei der daraufhin durchgeführten Chromosomenanalyse der Eltern fiel bei der Mutter die gleiche strukturelle Auffälligkeit an einem kurzen Arm eines Chromosoms 2 auf. Das Bandenmuster legte eine Inversion des Bereichs 2p22 p25.3 oder 2p24.2 p25.3 nahe. Abbildung 47: Partielles Karyogramm des Fetus mit dem aberranten Chromosom 2. Es fällt ein strukturell veränderter kurzer Arm auf (Pfeil).

80 Ergebnisse mband-analyse Zur genaueren Bestimmung der Bruchpunkte wurde das Multicolour Banding mit einer Chromosom 2 spezifischen Sonde sowohl beim ungeborenen Kind als auch bei der Mutter durchgeführt. Es ergaben sich jeweils die gleichen Hybridisierungsmuster. Die Auswertung zeigte beim aberranten Chromosom eine Unterbrechung des Cy5 Signals im kurzen Arm durch die kombinierten Signale von FITC und Spectrum Orange. So lagen zwei Signale für den Cy5 Bereich im kurzen Arm vor. Von dem Bereich, der gleichzeitig mit FITC und Spectrum Orange markiert war, lag ein Großteil mehr proximal im kurzen Arm und nur ein kleiner Teil verblieb regelrecht am terminalen Ende des kurzen Arms wie es im normalen Markierungsschema vorgesehen war (s. Abb. 48). Eine insgesamte Verstärkung oder Abschwächung eines der Signale lag nicht vor, so dass von keiner Vermehrung oder Verminderung genetischen Materials ausgegangen werden konnte. Die vorhandenen schwachen Signale des Texas Red im kurzen Arm bei allen Chromosomen waren als ein Artefakt des Spectrum Orange Signals, das durch eine zu hohe Spektrendurchlässigkeit im Filter für Texas Red entstand, zu interpretieren. Im Verlauf der Fluoreszenzintensitäten sah man beim aberranten Chromosom 2 die Zweigipfeligkeit des Cy5 Signals und ein schwaches aber vorhandenes Peak für FITC und Spectrum Orange am Ende des kurzen Arms. Bei der Anwendung der Falschfarben fiel das zweifache Auftreten der Bande mit der Farbe `Violett auf, was in Zusammenhang mit dem unterbrochenen Cy5 Signal stand. Eine Inversion des beim normalen Chromosom mit Pfeilen begrenzten Bereichs (Abb. 48 A) würde zu dem veränderten Hybridisierungsmusters beim aberranten Chromosom führen. Die mband-analyse legte eine parazentrische Inversion terminal in 2p nahe, die die Region 2p22 p25.3 umfasste (s. Abb 48 C).

81 Ergebnisse A B Abbildung 48: mband mit Chromosom 2 spezifischer Sonde zur Strukturabklärung der parazentrischen Inversion 2p (genauere Beschreibungen s. Text). FITC Spectrum Orange Cy5 DEAC Texas Red A. Normales Chromosom 2 B. Aberrantes Chromosom 2 C. Markierungsschema des Chromosoms 2 (Bereich der Inversion durch Balken begrenzt) C Zusammenfassung der Ergebnisse Das veränderte Hybridisierungsmuster bei den aberranten Chromosomen von Fetus und Mutter und der zytogenetische Befund sprechen für eine parazentrische Inversion im terminalen Teil des kurzen Arms von Chromosom 2. Anhand der mband-analyse konnte eine präzisere Bestimmung der Bruchpunkte erfolgen. Das sehr schwache Signal von FITC und Spectrum Orange am Ende des Chromosoms spricht für einen nahezu terminal gelegenen, oberen

82 Ergebnisse Bruchpunkt der Inversion in 2p25.3. Das Verhältnis der beiden Cy5 Signale im aberranten Chromosom von ca. 1:2 spricht dafür, dass sich der zweite Bruch im oberen Drittel des Cy5 markierten Chromosomenabschnitts in 2p22 ereignet hat. Das G-Bandenmuster stimmt mit diesen Bruchpunkten überein (s. Abb. 47). Der Bereich der familiär vorliegenden parazentrischen Inversion umfasst somit die Region 2p22 p25.3 (s. Abb. 48 C). Der Karyotyp lautet für den Fetus und die Mutter: 46,XX,inv(2)(p22p25.3) Komplexes Rearrangment mit Inversion 17p (Fälle und 17-03) Hierbei handelt es sich um eine familiäre, strukturelle Aberration bei Kind (Fall 17-02) und Mutter (Fall 17-03) mit unterschiedlichen Ausprägungen Klinische Befunde Nach einer unauffällig verlaufenden Schwangerschaft wurde in der 41+6 SSW das reife Kind geboren. Das Geburtsgewicht lag bei 2840 g. Ein Apgarwert von 5/6, Nabelschnur-pH bei 7,49 und respiratorische Anpassungstörungen erforderten die Intubation. Der nachgeburtliche klinische Befund zeigte vielseitige Anomalien. So fielen am Skelett beidseits Klumpfüße, Kniekontrakturen, Hüftluxationen und überstreckbare Fingerendgelenke auf. Es zeigte sich eine auffällige Facies mit Hypertelorismus, tiefsitzenden Ohren, Retrogenie und Verdachts auf Hydrophthalmus. An beiden Händen war eine Vierfingerfurche vorhanden. Es bestand kein Anhalt für innere Fehlbildungen. In der Neugeborenenperiode zeigte die Patientin zudem Zeichen eines Krampfanfalls und wies einen Bronchospasmus bei Verdacht auf Laryngomalazie auf. Bei der Mutter war kein auffälliger klinischer Befund bekannt Zyto- und molekularzytogenetische Untersuchungen Sowohl bei Kind als auch bei der Mutter wurde an 25 ausgewerteten Metaphasen auf einem Bandenniveau nach ISCN von 450 ein auffälliger weiblicher Karyotyp 46,XX, mit einem strukturell veränderten kurzen Arm des Chromosoms 17 gefunden (s. Abb ).

83 Ergebnisse Abbildung 49: Partielles Karyogramm von Fall (Kind) mit strukturell verändertem Chromosom 17 (rechts). Abbildung 50: Partielles Karyogramm von Fall (Mutter) mit strukturell verändertem Chromosom 17 (rechts). Die FISH-Analyse mit einer Chromosom 17 spezifischen WCP-Sonde (WCP 17, Vysis) ergab sowohl bei Kind als auch Mutter eine vollständige Markierung des aberranten Chromosoms 17. Bei der Mutter ergaben sich bei nachfolgenden Hybridisierungen mit LSI-Sonden für die SMCR (Smith-Magenis critical region) in 17p11.2 (D17S258, Oncor), das p53-gen in 17p13.1 (QBIOgene), die MDCR (Miller-Dieker critical region) in 17p13.3 (D17S379, Oncor) und einer Sonde für die Zentromerregion (D17Z1, Oncor) regelrechte Signale (s. Abb. 51). A Abbildung 51: Dual-FISH mit LSI-Sonden an Fall A. MDCR (grün) und SMCR (rot); Kontrollregion D17Z1 (grün). Es zeigten sich an beiden Chromosomen 17 regelrechte Signale für die jeweiligen spezifischen Regionen. B. SMCR (rot) und p53 (grün); Kontrollregion D17Z1 (grün). An beiden Chromosomen lagen für alle untersuchten Loci regelrechte Signale vor. B Die FISH-Untersuchungen der Miller-Dieker Region in17p13.3 (MDCR, D17S379, Oncor) sowie der Subtelomerregion im kurzen Arm des Chromosoms 17 (282M15, Vysis) ergab beim Kind keinen Hinweis auf eine Involvierung dieser Regionen an der strukturellen Aberration (s. Abb. 52). Die Hybridisierung mit einer DNA-Sonde für die kritische Smith-Magenis- Syndrom-Region in 17p11.2 (SMCR, D17S258, Oncor) zeigte jedoch bei dem Kind ein

84 Ergebnisse auffälliges Hybridisierungsmuster. Diese Region wies ein vergleichsweise nur äußerst schwaches Signal auf, das weiter distal als zu erwarten, im kurzen Arm zu liegen kam (s. Abb. 52). A B Abbildung 52: FISH-Analysen bei Fall A. WCP 17 (rot). Durchgängige Markierung der Chromosomen 17. B. FISH mit Subtelomersonde 17p (grün+rot). Beide Chromosomen 17 (Pfeile) zeigten regelrechte Signale für die Subtelomerregion. C C. Dual FISH mit LSI-Sonden für SMCR (rot) und MDCR (grün); Kontrollregion D17Z1 (grün). Das aberrante Chromosom 17 (Pfeil) wies regelrechte Signale der distal im p-arm gelegenen MDCR und des Zentromerbereichs auf. Das rote Signal spezifisch für die SMCR erschien vergleichsweise schwach und distal in den p-arm verschoben mband-analyse In der mband-analyse mit einer Chromosom 17 spezifischen Sonde zeigten die aberranten Chromosomen 17 im Vergleich zu den normalen Chromosomen sowohl beim Kind als auch bei der Mutter keinerlei Auffälligkeiten. Eine Abänderung in der Signalabfolge im Fluoreszenzmuster war ebenso wenig festzustellen wie eine Variation in den Falschfarbenbanden (s. Abb. 53).

85 Ergebnisse A B Abbildung 53: mband mit Chromosom 17 spezifischer Sonde zur Strukturabklärung des veränderten kurzen Arms (genauere Beschreibungen s. Text). DEAC Texas Red FITC A. Im mband normal erscheinende Chromosomen 17 der Mutter B. Im mband normal erscheinende Chromosomen 17 des Kindes C. Markierungsschema des Chromosoms 17 C Zusammenfassung der Ergebnisse Mutter: Aufgrund der Hybridisierungsmuster der WCP-17-Sonde und des mband ist bei der Mutter eine Beteiligung weiterer Chromosomen an dieser Strukturaberration auszuschließen. Das Vorliegen der zytogenetischen Untersuchung und die regelrechten Signale bei der FISH mit den benutzten LSI-Sonden lassen auf eine parazentrische Inversion mit Bruchpunkten distal der

86 Ergebnisse SMCR in 17p11.2 und 17p12 schließen. Der Karyotyp der Mutter lautet: 46,XX,inv(17)(p11.2p12) Kind: Basierend auf den FISH Ergebnissen und dem Multicolour Banding ist bei dem Kind ebenfalls eine Beteiligung weiterer Chromosomen an dieser Strukturaberration auszuschließen. Dem veränderten GTG-Bandenmuster im kurzen Arm eines Chromosoms 17 liegt wahrscheinlich die gleiche parazentrische Inversion wie bei der Mutter zu Grunde, wobei der distale Bruchpunkt ebenfalls in 17p12 bestimmt werden kann. Der proximale Bruchpunkt kann innerhalb der SMCR-Region in 17p11.2 angenommen werden, da sich das entsprechende Signal in der FISH schwächer darstellte. Das Hybridisierungsmuster für die SMCR legt zudem eine interstitielle Deletion in diesem Bereich nahe. Aufgrund der mband-analyse dürfte der proximale Bruchpunkt allerdings mehr distal in der Bande 17p11.2 nahe 17p12 liegen, da keine Veränderung der Texas Red markierten Region diagnostiziert werden konnte. Der zusätzliche Verlust genetischen Materials beim Kind kann durch illegitime crossing-over-ereignisse während der mütterlichen Keimzellreifung entstanden sein. Somit würde beim Kind eine Rekombinate des mütterlich aberranten Chromosoms vorliegen, die ursächlich für die klinischen Auffälligkeiten des Kindes ist. Der Karyotyp des Kindes lautet: 46,XX,rec(17)del(17)(p11.2p11.2)inv(p11.2p12) 3.5 X-chromosomale Aberrationen Insgesamt konnten sechs Fälle mit unterschiedlichen strukturellen Veränderungen eines X-Chromosoms untersucht werden Ringchromosom X (Fall X-02) Klinische Befunde Bei der Patientin zeigten sich in einer unmittelbar postpartal durchgeführten, körperlichen Untersuchung eine atopische Dermatitis, multiple kleine Hämangiome und laterale Hautanhängsel. Es fanden sich außer einer Nagelfalzdysplasie keine weiteren Auffälligkeiten die typisch für ein Ullrich-Turner-Syndrom wären Zyto- und molekularzytogenetische Untersuchungen Es fand sich ein numerisch und strukturell auffälliger weiblicher Karyotyp. In ¼ der ausgewerteten Metaphasen wurde ein 45,X-Karyotyp festgestellt. In ¾ der analysierten Metaphasen trat zusätzlich ein Ringchromosom auf (s. Abb. 54).

87 Ergebnisse Durch Fluoreszenz in situ Hybridisierung mit LSI-Sonden konnte die genetische Zusammensetzung des Ringchromosoms näher erfasst werden. Es wurde eine FISH mit DNA-Sonden für die X-Inaktivierungsregion (XIST, Oncor) in Xq13.2, sowie die Region für die Muskeldystrophie Duchenne (DMD, Oncor) in Xp durchgeführt. Das Ringchromosom wies ein spezifisches Signal für die XIST-Region auf, der DMD-Locus lies sich dagegen nicht nachweisen (s. Abb. 55 A+B). Aus diesen Ergebnissen ergab sich der Karyotyp: 45,X[25%] / 46,X,r(X)(p11q28)[75%] Abbildung 54: Partielles Karyogramm mit Ringchromosom X (rechts) neben einem unauffälligen Chromosom X. A B Abbildung 55: FISH mit LSI-Sonden A. XIST-Region in Xq13.2 (grün). Am Ringchromosom ließ sich das Signal für die XIST-Region darstellen (Pfeil). B. DMD Region in Xp (grün). Es war kein spezifisches Signal am Ringchromosom (Pfeil) zu sehen mband-analyse Zur weiteren Abklärung des Ringchromosoms wurde eine mband-analyse mit einer Chromosom X spezifischen Sonde durchgeführt. Die Probe setzte sich aus fünf verschiedenen, überlappenden Mikrodissektionsbibliotheken zusammen, die jeweils einzeln mit den bekannten Fluorochromen markiert waren (s. Abb. 56 C). Bei der Auswertung zeigte sich in der Darstellung der einzelnen Fluoreszenzbereichen, dass in der Ringformation der Spectrum Orange markierte Bereich nicht vorhanden war. Die Regionen von DEAC und Texas Red stellten sich komplett und die Bereiche FITC und Cy5 deutlich abgeschwächt dar. Bei dem unteren Cy5 Signal im Ringchromosom handelte es sich um ein Artefakt des durchscheinenden Texas Red Signals, das bei der Aufnahme am Fluoreszenzmikroskop entstand (s. Abb. 56 B). Die Anwendung der Falschfarben wies deutlich darauf hin, welcher Teil des normalen Chromosoms an der Ringbildung beteiligt war. Der entsprechende Chromosomenabschnitt lag zwischen den Banden mit den Farben `Grün und `Orange (Region zwischen den Pfeilen, Abb. 56 A).

88 Ergebnisse A B Abbildung 56: mband mit X-Chromosom spezifischer Sonde zur Strukturabklärung des Ringchromosoms X (genauere Beschreibungen s. Text). Spectrum Orange Cy5 DEAC Texas Red FITC A. Normales X-Chromosom B. X-chromosomales Ringchromosom (Pfeil markiert den Punkt des Ringschlusses) C. Markierungsschema des X-Chromosoms (Bereich der Ringbeteiligung mit Balken markiert) C Zusammenfassung der Ergebnisse Die mband-analyse zeigt, dass eine Beteiligung weiterer Chromosomen an dieser Ringbildung nicht vorlag. Das mband weist zudem darauf hin, dass das Ringchromosom vorwiegend aus Material der Region des langen Arms, die mit DEAC und Texas Red markiert ist, besteht. Ansonsten sind nur ein minimaler Bereich des kurzen Arms, der mit Cy5 markiert ist, und ein kleiner FITC markierter Abschnitt distal in Xq am Ring beteiligt. Die Bruchpunkte, die sich aus der zytogenetischen und FISH-Untersuchung ergeben haben (Xp11 und Xq28), können mit dem Multicolour Banding auf Xp11.2 und Xq26 korrigiert werden. Der Mosaikkaryotyp lautet: 45,X[25%] / 46,X,r(X)(p11.2q26)[75%]

89 Ergebnisse Ringchromosom X (Fall X-06) Klinische Befunde Die Patientin wurde als erstes Kind gesunder Eltern in der 39. SSW spontan geboren. Das Geburtsgewicht lag bei 2770 g (10. Perzentile), die Geburtsgröße bei 47 cm (3. Perzentile), der Kopfumfang bei 32 cm (3. Perzentile) und die Werte der postpartalen Adaptation waren mit einem APGAR von 9/10/10 und dem arteriellen Nabelschnur-pH von 7,3 gut. Es handelte sich um ein vitales, kräftiges, waches Neugeborenes mit rosigem Hautkolorit und guter dermaler Mikrozirkulation ohne äußerlich erkennbare Geburtsverletzungen. Herz und Lunge waren unauffällig in der Auskultation und die Pulse seitengleich gut tastbar. Andeutungsweise waren syndromale Stigmata mit kleiner Geburtslänge, weitem Mamillenabstand, kurzen proximalen Extremitäten, Handrücken- und dezenten Fußrückenödemen beidseits vorhanden. Es erfolgte eine Verlegung auf die Neugeborenenstation wegen des Ausschlusses einer konnatalen Toxoplasmose-Infektion, da bei der Mutter in der 23. SSW ein positiver Toxoplasmose IgG-Titer bei allerdings negativem IgM festgestellt wurde. Wegen eines initial postpartal erhöhten Hämatokritwerts von 73% wurde eine isovolämische Hämodilution durchgeführt. Die Fußrückenödeme bildeten sich bis zum vierten Lebensmonat zurück. Die Körpergröße blieb mit 55 cm für dieses Alter im unteren Bereich Zyto- und molekularzytogenetische Untersuchungen Die Analyse von GTG-gebänderten Chromosomen ergab einen strukturell und numerisch auffälligen Karyotyp. Zehn Metaphasen (66%) zeigten einen 45,X Karyotyp. In fünf Metaphasen (34%) konnte ein kleines Ringchromosom diagnostiziert werden (s. Abb. 57). Die weitere Charakterisierung erfolgte über FISH-Analysen. Die Hybridisierung mit einer Chromosom X spezifischen WCP-Sonde (WCP X, Vysis) wies eine durchgängige Markierung des Ringchromosoms auf. Eine Sonde für die XIST-Region (Oncor) in Xq13.2 zeigte ein regelrechtes Signal im Ringchromosom (s. Abb. 58 A). Die Hybridisierung mit einer Sonde für den DMD-Locus (Oncor) in Xp21.2/21.3 ergab kein spezifisches Signal am Ringchromosom, wohingegen der Zentromerbereich mit einer spezifischen Sonde (DXZ1, Vysis) regelrecht dargestellt wurde (s. Abb. 58 B). Mit chromosomaler Mikrodissektion und reverser Hybridisierung an regelrechten Prometaphasen eines gesunden männlichen Spenders war eine Markierung im Bereich der Banden p11.2 q21 festzustellen (s. Abb. 58 C+D). Die Auswertung der FISH bestätigte zudem die Häufigkeit der Mosaikverteilung. Von 84 ausgewerteten Metaphasen wiesen 54 (69%) keinen Ring und 26 (31%) einen Ring auf. Abbildung 57: Partielles Karyogramm der Patientin mit Ringchromosom X (rechts).

90 Ergebnisse A B C Abbildung 58: A. Dual-FISH mit WCP-X-Sonde (grün) und LSI-Sonde für die XIST-Region (rot). Das Ringchromosom (Pfeil) erschien nach der Hybridisierung mit der WCP-X-Sonde durchgängig markiert. Der XIST-Locus ließ sich regelrecht darstellen. B. Dual-FISH mit LSI-Sonden für die DMD Region (rot) und den Zentromerbereich (DXZ1, grün). Das mit Pfeil markierte Ringchromosom zeigte keine Markierung der DMD Region, bei vorhandenem Zentromersignal. C. + D. FISH nach Mikrodissektion des Ringchromosoms (grün). Reverses Painting auf Metaphasechromosomen eines gesunden männlichen Spenders (C) wies eine spezifische Hybridisierung um die Zentromerregion des X-Chromosoms (X) sowie im proximalen Anteil des langen Arms auf, was den Banden Xp11.2 q21 entsprach. Bei der Rückhybridisierung auf Chromosomen der betroffenen Patientin (D) erschien zudem das Ringchromosom (Pfeil) vollständig markiert. D Nach diesen Ergebnissen wurde folgender Karyotyp bestimmt: 45,X [67%] / 46,X,r(X)(p11.2q21) [33%] mband-analyse Nach Hybridisierung mit einer Chromosom X spezifischen mband-sonde wies das Ringchromosom Signale der Fluoreszenzen DEAC, Texas Red (schwach) und Cy5 (sehr schwach) auf. Dies zeigte die Beteiligung der Region im langen Arm, die mit DEAC und überlappend mit Texas Red markiert war, und einer kleinen Region des Cy5 markierten Chromosomensegments (s. Abb. 59 B). Entsprechende Peaks für diese Fluorochrome waren im

91 Ergebnisse Kurvenverlauf der Fluoreszenzintensitäten nachzuweisen. Außerdem spiegelte es sich in der Darstellung der Falschfarben wider. Das Segment, das von der `dunkelbraunen bis zur `hellbraunen Bande reichte, bildete das Ringchromosom (zwischen Pfeilen, Abb. 59 A und Abb. 59 B). A B Abbildung 59: mband mit X-Chromosom spezifischer Sonde zur Strukturabklärung des Ringchromosoms X (genauere Beschreibungen s. Text). Spectrum Orange Cy5 DEAC Texas Red FITC A. Normales Chromosom X B. Ringchromosom X C. Markierungsschema des Chromosoms X (Bereich der Ringbeteiligung mit Balken markiert) C Das Ringchromosom erwies sich mitotisch als nicht stabil. So konnte bei der Auswertung von zehn Metaphasen ein Doppelring beobachtet werden (s. Abb. 60). Die zuvor beobachteten Fluoreszenzsignale lagen doppelt vor. So waren auch in der Falschfarbendarstellung dieser Bereiche zweimal im Ring vorhanden (s. Abb. 60).

92 Ergebnisse A B Abbildung 60: FITC Texas Red DEAC Cy5 Spectrum Orange A. Normales Chromosom X (Pfeile markieren den Bereich der Falschfarbenbanden, die am Ring beteiligt sind) B. Doppelring des Chromosoms X Es wurde ein anderer Falschfarbenklassifikator als in Abb. 59 verwendet Zusammenfassung der Ergebnisse Die Hybridisierungen zeigten, dass das Ringchromosom ausschließlich aus X-chromosomalem genetischem Material besteht. Dabei handelt es sich vor allem um den zentromernahen Teil des langen Arms des X-Chromosoms. Die Bruchpunkte konnten durch die FISH mit LSI-Sonden und der mband-analyse präzisiert werden. Für die Festlegung des Bruchpunkts im langen Arm erweist sich insbesondere das Multicolour Banding als hilfreich. Das Vorhandensein eines schwachen Texas Red Signals zeigt, dass der Bruch in der Region Xq22 erfolgte. Damit kann das Ergebnis der Mikrodissektion präzisiert werden. Der zweite Bruchpunkt liegt zentromernah im kurzen Arm in Xp11.2. Der Mosaikkaryotyp lautet: 45,X [67%] / 46,X,r(X)(p11.2q22) [33%] Ringchromosom X (Fall X-04) Klinische Befunde Bei der 6-jährigen Patientin lag ein Minderwuchs vor, der zu dem Verdacht eines Ullrich-Turner- Syndroms führte.

93 Ergebnisse Zyto- und molekularzytogenetische Untersuchungen Die Chromosomenanalyse aus peripheren Lymphozyten ergab einen 45,X/46,X+mar Karyotyp (s. Abb. 61). Das kleine Chromosom ließ sich in 50% der analysierten Zellen nachweisen. Die übrigen Chromosomen waren strukturell unauffällig. Abbildung 61: Karyogramm der Patientin mit kleinem Ringchromosom X (Pfeil). Durch weitere FISH-Analysen sollte die genetische Zusammensetzung des kleinen Chromosoms weiter abgeklärt werden. Hybridisierungen mit Sonden für die Consensus-Telomersequenzen (All human telomers, Oncor) und der Zentromerregion (DXZ1, Oncor) ergab für die Telomersequenzen am Markerchromosom keine Signale (s. Abb 62 B). Dadurch konnte die vermutete Ringstruktur verifiziert werden. Das kleine Ringchromosom wies ein schwaches Signal für die Zentromerregion auf (s. Abb. 62 A). Die Hybridisierung mit einer LSI-Sonde für die X- Inaktivierungsregion (XIST, Oncor) in Xq13.2 in Kombination mit einer X spezifischen WCP- Sonde (WCP X, Vysis) zeigte, dass das Markerchromosom X-chromosomal euchromatisches Material enthielt, das die XIST-Region einschloss (s. Abb 62 B). Durch chromosomale Mikrodissektion konnte gezeigt werden, dass nach Reversem Painting an regelrechten Prometaphasen das Chromosom X eine Markierung im Bereich der Banden p11.2 q13.2 aufwies (s. Abb 62 C+D). Aus dem Vorliegen dieser Ergebnisse ergab sich der Karyotyp: 45,X [50%] / 46,X,r(X)(p11.2q13.2) [50%]

94 Ergebnisse A B C Abbildung 62: A. Dual-FISH mit einer all human telomers Sonde (rot) und Zentromersonde (DXZ1, grün). Das Ringchromosom (Pfeil) zeigte keine spezifischen Signale im Telomerbereich. Das Zentromer war auf dem kleinen Ring darstellbar. B. Dual-FISH mit WCP-X- (grün) und LSI-Sonde für die XIST-Region (rot). Der Ring (Pfeil) zeigte sich WCP X positiv. Ebenso war ein spezifisches Signal für die XIST-Region in Xq13.2 vorhanden. C. + D. FISH nach Mikrodissektion des Ringchromosoms (grün). Reverses Painting auf Metaphasechromosomen eines gesunden männlichen Spenders (C) wies eine spezifische Hybridisierung um die Zentromerregion des X-Chromosoms (Pfeil) sowie im proximalen Anteil des langen Arms auf. Bei der Rückhybridisierung auf Chromosomen der betroffenen Patientin (D) zur Kontrolle erschien zudem das Ringchromosom komplett markiert. D mband-analyse Bei der Hybridisierung mit der spezifischen X-chromosomalen mband-sonde beschränkte sich die Markierung des Ringchromosoms auf das Fluorochrom DEAC (s. Abb. 63 B). Das im kurzen Arm vorhandene Signal für Texas Red basierte auf einem Durchscheinen der Spectrum Orange Fluoreszenz und ist daher als technisches Artefakt zu werten. Bei der Anwendung einer Falschfarbenklassifikation zeigte sich, dass die Region der Falschfarbe `Dunkelblau den größten Teil des Ringchromosoms ausmachte. Dies bedeutete, dass das Ringchromosom aus X- chromosomalem Material hervorgegangen war, das ausschließlich mit DEAC markiert war und laut Falschfarbenanwendung einem zentromernahen Bereich entsprach (s. Abb. 63 A+C).

95 Ergebnisse A B Abbildung 63: mband mit X-Chromosom spezifischer Sonde zur Strukturabklärung des Ringchromosoms X (genauere Beschreibungen s. Text). Spectrum Orange Cy5 DEAC Texas Red FITC A. Normales Chromosom X B. Ringchromosom X C. Markierungsschema des Chromosoms X (Bereich der Ringbeteiligung mit Balken markiert) C Zusammenfassung der Ergebnisse Unter Einbeziehung aller zytogenetischen und molekularzytogenetischen Befunde handelt es sich bei dem kleinen Marker um ein Ringchromosom X, das hauptsächlich aus genetischem Material des langen Arms vom X-Chromosom besteht. Der Bereich der am Ringschluss beteiligt ist, reicht vom zentromernahen Bereich im kurzen Arm bis in die Bande Xq13.2, wobei der Bruch distal der XIST-Region erfolgte. Der Mosaikkaryotyp lautet: 45,X [50%] / 46,X,r(X)(p11.1q13.2) [50%] Markerchromosom X (Fall X-05) Klinische Befunde Es lagen keine Angaben vor.

96 Ergebnisse Zyto- und molekularzytogenetische Untersuchungen Die zytogenetische Analyse der Patientin ergab einen numerisch und strukturell auffälligen weiblichen Karyotyp. In einem Teil der Metaphasen (30%) wurde ein 45,X-Karyotyp festgestellt. In einer weiteren Zelllinie trat zusätzlich ein kleines Markerchromosom auf, das durch herkömmliche Bänderungsmethoden nicht weiter charakterisiert werden konnte (s. Abb. 64). Abbildung 64: Karyogramm der Patientin mit Verlust eines X-Chromosoms und Markerchromosom unbekannter Herkunft (Pfeil). Zur Abklärung des kleinen Markerchromosoms wurden FISH-Analysen mit einer Chromosom X spezifischen WCP-Sonde (WCP X, Vysis) und einer LSI-Sonde für die XIST-Region in Xq13.2 (Oncor) durchgeführt, die beim SMC positive Signale zeigten. Zusätzlich wurde jeweils eine Sonde für die Zentromerregion (DXZ1, Vysis) hybridisiert, die ebenfalls regelrechte Markierungen aufwies (s. Abb. 65).

97 Ergebnisse A Abbildung 65: A. Dual-FISH mit WCP X (grün) und Zentromersonde (DXZ1, rot). Das Markerchromosom (Pfeil) war positiv für WCP X und das Zentromersignal. B. Dual-FISH mit Sonden für die XIST-Region in Xq13.2 (rot) und den Zenromerbereich (DXZ1, grün). Sowohl am normalen Chromosom X als auch dem Markerchromosom lagen für beide Regionen regelrechte Signale vor. B mband-analyse Im Multicolour Banding mit einer X-Chromosom spezifischen mband-sonde zeigte sich vergleichbar mit Fall X-04 eine ausschließliche Markierung des Markerchromosoms mit dem Fluorochrom DEAC. Sowohl der Einzeldarstellung der Fluorochrome als auch dem Verlauf der Fluoreszenzintensitäten konnte entnommen werden, dass alle weiteren Fluorochromsignale in dem Marker nicht vorhanden waren (s. Abb. 66 B). Daraus ergab sich ein möglicher Bereich für die Bildung des Markerchromosoms, der ausschließlich DEAC markiert war und vom Zentromer bis zur Bande Xq21.3 reichte (s. Abb. 66 C). Die Anwendung der Falschfarben bestätigte dies und legte einen eher zentromernahen Bereich für die Zusammensetzung des Markers nahe, da nur die zentromernahen Falschfarbenbanden `Braun und `orange auf dem Markerchromosom zu finden waren (s.abb. 66 A+B).

98 Ergebnisse A B Abbildung 66: mband mit X-Chromosom spezifischer Sonde zur Strukturabklärung des Markerchromosoms X (genauere Beschreibungen s. Text). Spectrum Orange Cy5 DEAC Texas Red FITC A. Normales Chromosom X B. Markerchromosom X C. Markierungsschema des X-Chromosoms (möglicher Bereich für die Beteiligung am Markerchromosom mit Balken markiert) C Zusammenfassung der Ergebnisse Nach den vorliegenden molekularzytogenetischen Untersuchungen handelt es sich bei dem Markerchromosom um ein Derivat des X-Chromosoms. Die Bruchpunkte ergeben sich aus der Größe des Markerchromosoms, der FISH mit LSI-Sonden und dem Multicolour Banding. Sie liegen zentromernah in Xp11.1 und distal der XIST-Region in Xq13.2. Auch wenn keine FISH mit Sonden für die Consensussequenzen der Telomerregionen durchgeführt wurde, dürfte es sich von der Struktur her um ein kleines Ringchromosom handeln. Der Mosaikkaryotyp lautet: 45,X [30%] / 46,X,+r(X)(p11.1q13.2) [70%] Isochromosom X (Fall X-03) Klinische Befunde Bei einer körperlichen Untersuchung im Alter von 12 Jahren fiel wiederholt ein Kleinwuchs, Adipositas sowie kleine Hände und Füße auf. Daher wurde zunächst der Verdacht auf ein Prader-Willi-Syndrom geäußert.

99 Ergebnisse Zyto- und molekularzytogenetische Untersuchungen Nach durchgeführter GTG-Bänderung ergab sich ein normaler weiblicher Karyotyp mit einem strukturell auffälligen X-Chromosom (s. Abb. 67). Der kurze Arm war deutlich verlängert. Das Bandenmuster erschien spiegelsymmetrisch zum langen Arm. Die Fluoreszenz in situ Hybridisierung mit Chromosom X spezifischen DNA-Sonden (WCP X, Vysis) zeigte bei beiden Chromosomen eine durchgängige Markierung. Eine Hybridisierung mit einer LSI-Sonde für die XIST-Region in Xq13.2 (Oncor) erbrachte am aberranten Chromosom ein Signal an jedem Arm. Nach Hybridisierung mit einer locus-spezifischen DMD Sonde in Xp (Oncor) zeigte sich beim veränderten Chromosom kein Signal. FISH-Analyse mit Sonden, die spezifisch für die Chromosomenregion des Prader-Willi/Angelman-Syndroms in 15q11-q12 waren (D15S10 und SNRPN, Vysis) ergaben keinen Hinweis auf eine Mikrodeletion in diesem Bereich. All diese Ergebnisse deuten auf das Vorliegen eines Isochromosoms Xq hin. Der Karyotyp lautet: 46,X,i(X)(q10) Abbildung 67: Partielles Karyogramm der Patientin mit strukturell auffälligem Chromosom X (Pfeil) mband-analyse Zur Verifizierung dieser Ergebnisse wurde das Multicolour Banding mit einer Chromosom X spezifischen Sonde durchgeführt. Bei der Auswertung fiel auf, dass alle Signale des kurzen Arms, Spectrum Orange TM und Cy5 TM, beim aberranten Chromosom fehlten. Alle Einzelfluorochrome des langen Arms, DEAC, Texas Red und FITC, hingegen waren im aberranten Chromosom doppelt vorhanden. Sie zeigten sich spiegelsymmetrisch vom Zentromer aus (s. Abb. 68 B). Die Darstellung des aberranten Chromosoms in Falschfarben bestätigte diesen Eindruck. Deutlich ist auch hier das spiegelsymmetrische Muster zu erkennen (s. Abb. 68 B), das ausschließlich die Farbabfolge des langen Arms wiederholt.

100 Ergebnisse A B Abbildung 68: mband mit X-Chromosom spezifischer Sonde zur Verifizierung des Isochromosoms X (genauere Beschreibungen s. Text). Spectrum Orange Cy5 DEAC Texas Red FITC A. Normales Chromosom X B. Aberrantes Chromosom X C. Markierungsschema des Chromosoms X (im Isochromosom doppelt vorliegender Bereich mit Balken markiert) C Zusammenfassung der Ergebnisse Alle vorliegenden Ergebnisse weisen auf das Vorliegen eines Isochromosoms X hin, das aus zwei langen Armen eines X-Chromosoms besteht. Über mband ließ sich der spiegelsymmetrische Aufbau des Isochromosoms Xq genau darlegen. Es liegt somit eine unbalancierte Situation mit einer Trisomie Xq und einer Monosomie Xp vor. Der Karyotyp lautet: 46,X,i(X)(q10) Komplexes, X-chromosomales Rearrangement (Fall X-01) Klinische Befunde Bei der Patientin bestand ein Kleinwuchs. In ihrem 19. Lebensjahr gebar sie einen gesunden Sohn. Nach normalem Verlauf der Regelblutung seit ihrem 12. Lebensjahr sistierte diese plötzlich im Alter von 34 Jahren und es traten die vorzeitigen Wechseljahre ein. Im Alter von 35 Jahren

101 Ergebnisse fand eine Vorstellung in einer psychiatrischen Einrichtung statt. Der Anlass hierfür war eine bekannte Depression, die sich über die Zeit als therapieresistent herausgestellt hatte. Bei den vorliegenden klinischen Befunden wurde von dort mit dem Verdacht auf eine Geschlechtschromosomenanomalie Blut zur genetischen Untersuchung eingesandt Zyto- und molekularzytogenetische Untersuchungen Bei der zytogenetischen Untersuchung zeigte sich an 18 ausgewerteten GTG-gebänderten Metaphasen ein strukturell auffälliger weiblicher Karyotyp mit einer Verlängerung des kurzen Arms eines X-Chromosoms (siehe Pfeil, Abb. 69). Im Gegensatz zu Fall X-03 (Kapitel 3.5.5) konnte jedoch kein symmetrisches Bandenmuster festgestellt werden. Zur weiteren Abklärung dieser Strukturaberration wurde eine FISH-Analyse mit einer WCP-X-Sonde (Vysis) durchgeführt, die eine durchgängige Markierung des aberranten Chromosoms X ergab. Y-chromosomale Loci ließen sich mit einer WCP Y Sonde (Vysis) nicht nachweisen. Die Hybridisierungen mit drei verschiedenen im kurzen Arm lokalisierten LSI-Sonden für die Regionen DMD in Xp21.2 p21.3 (Oncor), KAL in Xp22.3 (Oncor) und den Subtelomersequenzen Xp und Yp (DXYS129, Vysis) ergaben am aberranten X- Chromosom keine Signale (s. Abb. 70 A+B+C). Bei der FISH-Analyse mit einer für die XIST- Region spezifischen Sonde in Xq13.2 (Oncor) zeigten sich am aberranten Chromosom regelrechte Signale (s. Abb. 70 C). Bei allen Hybridisierungen wurde als Kontrolle eine Sonde für die X-chromosomale Zentromerregion (DXZ1, Vysis) mitgeführt. Diese wiesen regelmäßig positive Signale am aberranten Chromosom auf (s. Abb. 70). Diese zytogenetischen Ergebnisse und FISH Befunde mit LSI-Sonden belegten einen komplexen Strukturumbau des X- Chromosoms. Für den kurzen Arm konnte mit diesen Methoden eine Deletion Xp21.1 pter nachgewiesen werden. Es blieb allerdings offen, welches X-chromosomale Material sich an den kurzen Arm anheftete. Abbildung 69: Partielles Karyogramm mit dem strukturell auffälligen X- Chromosom (Pfeil).

102 Ergebnisse A B C Abbildung 70: Duale Fluoreszenz in situ Hybridisierungen mit LSI-Sonden. A. DMD Sonde in Xp21.2-p21.3 (grün) und DXZ1 (rot). B. KAL Sonde in Xp22.3 (grün) und DXZ1 (grün). C. Sonde für Subtelomerregionen in Xp und Yp (DXYS129, grün) und alpha-satelliten (DXZ1, rot). Bei der Hybridisierung mit jeder dieser drei Sonden, fehlte das jeweilige Signal am aberranten Chromosom (Pfeil). Die Zentromersignale waren stets vorhanden. D. XIST- (grün) und DXZ1-Sonde (rot). Sowohl für die XIST- als auch für die Zentromerregion zeigte das aberrante Chromosom (Pfeil) regelrechte Signale. D mband-analyse Zur genaueren Abklärung dieses komplexen Rearrangments wurde das Multicolour Banding mit einer Chromosom X spezifischen Sonde durchgeführt. Bei der Auswertung der einzelnen Fluoreszenzbereiche zeigte sich ein kompletter Verlust des Spectrum Orange Signals und ein Teilverlust des Cy5 Signals, welcher der Überlappung mit dem Spectrum Orange Bereich entsprach. Zusätzlich konnte im verlängerten kurzen Arm des aberranten Chromosoms ein komplettes Signal von FITC und dem entsprechenden Überlappungsbereich des an FITC angrenzenden Texas Red Bereichs aus dem langen Arm registriert werden (s. Pfeile in Abb. 71 B). Die Signale für DEAC waren sowohl im normalen als auch im aberranten Chromosom regelrecht. Dieses Signalmuster konnte auch im Fluoreszenzintensitätsverlauf nachvollzogen werden. Nach Anwendung einer Falschfarbenklassifikation wies das aberrante Chromosom einen Verlust der p-terminalen Farbbanden `Hellgrün und `Dunkelgrün und eine Verdopplung

103 Ergebnisse der Falschfarben `Pink, `Braun und `Gelb auf, die sich invertiert an die verbliebenden Banden im kurzen Arm lagerten (Bereich zwischen den Pfeilen, Abb. 71 A). A B Abbildung 71: mband mit X-Chromosom spezifischer Sonde zur Strukturabklärung des komplexen Rearrangments (genauere Beschreibungen s. Text). Spectrum Orange Cy5 DEAC Texas Red FITC A. Normales Chromosom X B. Aberrantes Chromosom X C. Markierungsschema des Chromosoms X C

104 Ergebnisse Zusammenfassung der Ergebnisse Die Hybridisierungen mit der WCP-X-Sonde und das mband können eine Beteiligung weiterer Chromosomen an dieser Strukturaberration ausschließen. Aufgrund der vorliegenden FISH Befunde ist festzustellen, dass eine Deletion des terminalen Bereichs des kurzen Arms vorliegt. Als Bruchpunkt kann aufgrund der Hybridisierungen mit den LSI-Sonden im kurzen Arm, der mband- Sonde sowie den Ergebnissen der GTG-Bänderung Xp21.1 festgelegt werden. Nur mit dem Multicolour Banding kann allerdings gezeigt werden, dass anstelle des deletierten Bereichs bei dieser Aberration ein invertiert duplizierter Bereich aus dem terminalen Abschnitt des langen Arms tritt. Die im kurzen Arm vorliegenden zusätzlichen Signale aus dem langen Arm lassen auf eine Duplikation von Xq25 bis Xqter schließen. Bei der Patientin liegt somit ein komplexes, X- chromosomales Rearrangement mit partieller Monosomie für die Region Xp21.1 pter und einer partiellen Trisomie für den Bereich Xq25 qter vor. Der Karyotyp lautet demnach: 46,XX,der(X)(qter q25::p21.1 qter) Abbildung 72: Schema der Fluorochromabfolge am aberranten Chromosom. Der invers dupliziere Bereich ist blau eingefärbt.