Rekombinante Antikörper STEFAN DÜBEL PETRA ROHRBACH ANDREAS SCHMIEDL

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1 Werkzeuge gegen Krebs, Infektionen und Autoimmunerkrankungen? Rekombinante Antikörper STEFAN DÜBEL PETRA ROHRBACH ANDREAS SCHMIEDL Seit etwa zwanzig Jahren beschäftigen sich Wissenschaftler mit der Herstellung von rekombinanten Antikörpern. In dieser Zeit haben viele Fortschritte bei der Selektion, im molekularen Design und bei der Produktion dieser Proteine dazu beigetragen, dass sie sich zur wichtigsten Klasse therapeutischer Proteine entwickelt haben. Rekombinante Antikörper stellen derzeit mehr als 30 Prozent aller Proteine, die sich in der klinischen Erprobungsphase befinden. Die mit einem grünen Pfeil markierten Begriffe werden im Glossar erklärt. Wir haben bereits einen flüchtigen Eindruck von dem Land erheischt, von dem wir glauben, ja sogar erwarten, das es reiche Schätze für die Biologie und Therapie hervorbringt. Paul Ehrlich, 1900 Seit den Arbeiten von Behring und Kitasato vor über 100 Jahren ist bekannt, dass spezifisch bindende Moleküle aus Blutseren gewonnen werden können. Die klassische Methode zur Herstellung solcher Antikörper mit definierter Spezifität beruht daher auf der Immunisierung von Versuchstieren (siehe auch Abbildung 1). Einige Wochen nach der Injektion eines Antigens können die gewünschten Antikörper im Blutserum des Tieres nachgewiesen werden. Die so gewonnenen Antiseren stellen immer ein Gemisch verschiedener Immunglobuline unterschiedlicher Spezifitäten dar. Enthalten sind zunächst die Antikörper, die bereits vor der Immunisierung vorhanden waren, meist jedoch auch verschiedene, für das Antigen spezifische Immunglobuline. Da jeder dieser Antikörper von einem individuellen B-Lymphozytenklon produziert wird und die Immunantwort auf der Vervielfältigung mehrerer solcher Zellklone beruht, werden die entstehenden Antikörperseren als polyklonal bezeichnet [6, 9]. Für die meisten Anwendungen ist es nicht ratsam, ein polyklonales Antikörpergemisch aus dem Serum eines immunisierten Spenderorganismus einzusetzen, da es aufgrund der Vielzahl von vorhandenen Immunglobulinen auch zu unerwünschten Nebenreaktionen kommen kann. Es ist zwar möglich, einen bestimmten Antikörper aus einem polyklonalen Gemisch zu isolieren, jedoch erwies sich ein solches Verfahren zumeist als sehr aufwendig. Abhilfe schaffte hier die zur Herstellung monoklonaler Antikörper Mitte der 1970er Jahre entwickelte Hybridom-Technologie von Köhler und Milstein [7]. Diese Methode erfordert zwar ebenfalls die Immunisierung eines Versuchstieres, nach Entwicklung einer Immunantwort werden dann allerdings die B-Lymphozyten die Vorstufen der Antikörper produzierenden Zellen aus dessen Milz isoliert. Um diese in vitro vermehren zu können, werden sie durch die Fusion mit Plasmamyelomzellen immortalisiert. Einige der so gewonnenen Hybridomzellen produzieren Antikörper der gewünschten Spezifität. Diese werden durch aufwendige Analysen vieler einzelner Zellkulturen identifiziert und können anschließend zur Herstellung einer theoretisch beliebigen Menge der gewünschten Immunglobuline herangezogen werden. Einige gegen Oberflächenproteine auf Tumorzellen gerichtete, monoklonale Maus-Antikörper wurden bereits gut charakterisiert und haben im Tiermodell therapeutische Effekte gezeigt. Diese sind damit von besonderem Interesse für die Behandlung und Diagnostik maligner Tumoren. Eine Therapie ist jedoch problematisch, da das Immunsystem eines Patienten innerhalb weniger Tage nach der Verabreichung dieser Antikörper humane anti-maus-antikörper bildet (HAMA-Immunantwort, Abbildung 2). Diese verhindern eine wiederholte Behandlung, da die Antikörper des Patienten die Maus-Antikörper neutralisieren würden, noch bevor diese ihr Ziel erreichen. Die große Mehrzahl der humanen anti-maus-antikörper ist gegen die konstanten Regionen dieser Immunglobuline gerichtet. Um die Spezifitäten der monoklonalen Antikörper dennoch nutzen zu können, wurden vielfach so genannte chimäre Antikörper generiert, welche aus den antigenbindenden Fv-Fragmenten eines Maus-Antikörpers und den konstanten Bereichen eines humanen Immunglobulins zusammengesetzt sind (siehe auch Kasten auf S. 373). Die resultierenden Antikörper binden nach wie vor spezifisch an ihr Antigen, die von ihnen hervorgerufene HAMA-Antwort im Patienten fällt jedoch deutlich geringer aus. Da die konstanten Domänen dieser Antikörper nun humanen Ursprungs sind, können sie auch Effektorfunktionen des menschlichen Immunsystems aktivieren, wie beispielsweise die antikörperabhängige, zelluläre Zytotoxizität oder die Komplementkaskade. Die Chimärisierung von Maus-Antikörpern kann die menschliche Immunantwort zwar minimieren, jedoch letztlich nie ganz ausschließen, zumal immer einige Patien- 372 Biol. Unserer Zeit 34. Jahrgang 2004 Nr. 6 DOI: /biuz Wiley-VCH Verlag GmbH & Co. KGaA, Weinheim

2 REKOMBINANTE ANTIKÖRPER BIOTECHNOLOGIE MOLEKULARE IMMUNOLOGIE Antikörper sind die Erkennungselemente der Immunantwort der Wirbeltiere. Die Hauptaufgabe dieser Glykoproteine, die auch als Immunglobuline (Ig) bezeichnet werden, besteht darin, Pathogene spezifisch zu binden und für das restliche Immunsystem zu markieren. Sie werden von Plasmazellen als Antwort auf die Gegenwart einer fremden Substanz, des Antigens, produziert. B-Lymphozyten sind in der Lage, fünf verschiedene Isotypen von Antikörpern zu erzeugen, die als IgM, IgG, IgA, IgE und IgD bezeichnet werden, wobei die Immunglobuline G am häufigsten auftreten. Bedingt durch ihre charakteristischen schweren Ketten vermittelt jeder Isotyp einen anderen Effektormechanismus des Immunsystems. Im Laufe der Immunantwort kann der Isotyp eines einzelnen Antikörperklons gewechselt werden, um eine bestimmte Antigenspezifität mit einer anderen Effektorfunktion zu verbinden [1]. Immunglobuline G (IgG; 150 kda) bestehen aus zwei leichten (je 25 kda mit etwa 220 AS) und zwei schweren (je 50 kda mit etwa 440 AS) Polypeptidketten, die kovalent miteinander verbunden sind (siehe auch Abbildung). Jede leichte Kette besteht aus zwei Domänen. Anhand der vorgefundenen Primärstrukturen bezeichnet man die aminoterminale Region als variable (V L ), die carboxyterminale dagegen als konstante Domäne (C L ). Im Gegensatz dazu folgen bei den schweren Ketten eines IgGs drei konstante (C H 1, C H 2, C H 3) auf eine aminoterminale, variable Domäne (V H ). Die Antigenbindungsspezifität eines IgG wird durch seine beiden Fv-Regionen vermittelt, von denen sich jede jeweils aus einer variablen Domäne der leichten (V L ) und schweren Kette (V H ) zusammensetzt. Bei genauer Betrachtung der Aminosäuresequenz dieser Domänen zeigt sich, dass innerhalb jeder der variablen Regionen drei kurze Peptidabschnitte von circa 5 bis 15 Aminosäuren eine weitaus höhere Variabilität aufweisen als die übrigen Bereiche. Diese sechs so genannten hypervariablen Abschnitte (H1, H2 und H3 von V H ; L1, L2 und L3 von V L ) finden sich im nativen Protein auf der Außenseite zusammen und bilden das so genannte Paratop, die eigentliche Kontaktfläche des Antikörpers zum Antigen. Man nennt letztere Teile der Sequenz deshalb auch komplementaritätsbestimmende Regionen (CDR, complementarity determining regions): Sie formen eine komplementäre Oberfläche zur antigenen Determinante, zum so genannten Epitop, und sind somit für die Spezifität des Antikörpers verantwortlich. Die molekulare Erkennung der Antigene erfolgt über nicht-kovalente Wechselwirkungen. Die Spezifität wird dabei hauptsächlich durch die Anordnung von Wasserstoffbrückenbindungen, elektrostatischen Wechselwirkungen und van-der-waals-bindungen bestimmt. Typische Bindungskonstanten für natürliche Immunglobuline liegen im Bereich zwischen K D = 10 4 M und K D = M [1]. Rekombinante Varianten können übrigens noch um mehrere Größenordnungen stärkere Affinitäten erreichen. Durch die Bivalenz eines Immunglobulin-Monomers können Antigene miteinander vernetzt oder mit beiden Fab-Armen des Antikörpers gleichzeitig und damit besonders fest gebunden werden. Die Bildung von Antigen-Antikörperkomplexen wird hierbei durch ein flexibles Scharnier (hinge) zwischen den beiden Fab-Fragmenten und dem Fc-Teil begünstigt. Diese hinge-region erlaubt, dass der Winkel zwischen den antigenbindenden Fv-Fragmenten über einen weiten Bereich variiert werden kann, um den Abstand zwischen den Bindungsstellen des Antikörpers dem Abstand der antigenen Determinanten anzupassen. Die Affinität eines Antikörpers zu einem Antigen ist bis zu 10 4 mal höher, wenn beide Fv-Regionen an der Bindung beteiligt sind. Unser Körper nutzt diesen Effekt besonders in Form der pentameren, d.h. dekavalenten IgM-Antikörper in frühen Phasen der Immunreaktion gegen neue, fremde Antigene, wenn noch keine spezifischen Antikörper entwickelt werden konnten. Effekte nach Antigenbindung: Nur in wenigen Fällen übt nur ein Antikörper eine Schutzfunktion aus. Solche Antikörper neutralisieren bakterielle Toxine oder Viren, indem sie deren Oberfläche maskieren. Die meisten Antikörper erlangen jedoch erst durch die Zusammenarbeit mit dem restlichen Immunsystem ihre enorme Wirksamkeit. Dabei vermitteln die konstanten Regionen eines Antikörpers die Aktivierung verschiedener Effektorfunktionen, wie zum Beispiel die Bindung von Makrophagen oder die Aktivierung des Komplementsystems, was die Bildung von Poren in der Plasmamembran von Mikroorganismen oder infizierten Zellen zur Folge hat und damit zu deren Lyse führt. Auch der Transfer von Antikörpern über die Plazentamembran wird durch die konstanten Regionen vermittelt. Die von unserem Immunsystem gebildeten Antikörper besitzen also mindestens zwei Funktionen: Die erste Funktion ist das spezifische Erkennen eines Antigens, die zweite Funktion ist die Aktivierung des Immunsystems. Unsere Abbildung vom Titel zeigt ein Fab-Fragment eines IgG-Moleküls also einen Bindungsarm des Antikörper-Ypsilons, und damit ein typisches in E. coli herzustellendes Antikörperteil. Die beiden Farben unterscheiden die beiden Ketten des Fab-Fragments. Am linken oberen Ende befindet sich die Antigenbindestelle, unten rechts würde die schwere Kette über die Hinge-Region weiter zum Fc-Fragment (dem Stamm des Antikörper-Ypsilons) führen. [1] C.A. Janeway und P. Travers, Immunologie. 2. Aufl., Spektrum Akademischer Verlag GmbH, Heidelberg, ABB. Schematische Darstellung eines Immunglobulins G und davon abgeleiteten Fragmenten. Fv: variabler Teil eines Antikörpers, der für dessen Spezifität verantwortlich ist; Fab-Fragment: Arme des Antikörpers mit den antigenbindenden Bereichen; V H : variable Domäne der schweren Kette; V L : variable Domäne der leichten Kette; Fc: schwere Ketten, die die Komplementaktivierung und Makrophagenbindung bewirken; C H 1-3, C L : konstante Domänen; S-S: Disulfidbrücke; scfv: durch eine Peptidverbindung stabilisiertes Fv-Fragment; linker: Peptidverbindung zwischen V H und V L ; dsfv: durch eine Disulfidbrücke stabilisiertes Fv-Fragment. Nr Jahrgang 2004 Biol. Unserer Zeit 373

3 ten signifikante Mengen von Antikörpern gegen die verbliebenen Mausanteile bilden werden. Die in solchen Fällen generierten Antikörper reagieren zumeist mit den konservierten Gerüstregionen der variablen Maus-Domänen, seltener mit ihren hypervariablen Regionen. Deshalb wurde versucht, die Immunogenität von Maus-Antikörpern durch Verpflanzung dieser hypervariablen Regionen zu reduzieren [3]. Dazu wurden die hypervariablen Regionen der Maus-Immunglobuline in ein humanes Fv-Gerüst eingebettet. Bei dieser Art der Humanisierung wurde jedoch beobachtet, dass auch Aminosäuren in den Gerüstregionen der variablen Regionen einen erheblichen Einfluss auf die Antigenbindung nehmen können. Da die Gerüstregionen die Anordnung und Konformation der hypervariablen Regionen bestimmen, können einzelne Aminosäurenaustausche an kritischen Positionen die Antikörper-Antigen-Wechselwirkungen nachteilig beeinflussen. Die Affinität dieser humanisierten Antikörper ist deshalb oft geringer als die ihrer Maus-Homologen. Durch zusätzliche Veränderungen in den Gerüstregionen der variablen Domänen ist es dennoch gelungen, einige Antikörper zu humanisieren, deren Affinitäten sich kaum mehr von denen ihrer ursprünglichen Antikörper unterscheiden. Dieses Verfahren erfordert jedoch individuelle Lösungen für jedes einzelne Maus-Immunglobulin und beansprucht viel Zeit. Vollständig humane polyklonale Antikörper wurden bereits aus dem Serum immunisierter Spender gewonnen, jedoch sind dieser Methode naturgemäß medizinische und ABB. 1 HISTORISCHE ENTWICKLUNG DER HERSTELLUNGSMETHODEN FÜR ANTIKÖRPER Seit Beginn des 19. Jahrhunderts werden polyklonale Antiseren durch die Immunisierung von Versuchstieren gewonnen. Die Entwicklung der Hybridom-Technologie ermöglicht seit 1975, monoklonale Maus-Antikörper herzustellen. Durch die Gentechnik können heute humane Antikörper gegen beliebige Strukturen quasi im Reagenzglas generiert und modifiziert werden. 374 Biol. Unserer Zeit 34. Jahrgang 2004 Nr. 6

4 REKOMBINANTE ANTIKÖRPER BIOTECHNOLOGIE ethische Grenzen gesetzt. Die Gewinnung von humanen monoklonalen Antikörpern aus Mäusen mit humanem Antikörpergen-Repertoire stellt dazu eine solide Alternative unter Verwendung der bewährten Hybridom-Technologie dar. Mit Hilfe komplizierter Kreuzungsexperimente werden zu diesem Zweck transgene Mäuse mit humanem Antikörpergen-Repertoire generiert [10], welche in der Lage sind, die entsprechenden Antikörper zu produzieren. Letztere unterscheiden sich dann von menschlichen Antikörpern lediglich durch ihr geringfügig unterschiedliches Glykosylierungsmuster. ABB. 2 UNTERSCHIEDLICHE IMMUNANTWORTEN Humane rekombinante Antikörper Seit einigen Jahren werden neue Wege zur Selektion von Antikörpern beschritten, die nicht mehr auf Immunisierungen von Versuchstieren beruhen. So werden heute kombinatorische Bibliotheken von Antikörperfragmenten beispielsweise auf der Oberfläche von Phagen exprimiert (phage display, siehe auch Abbildung 3). Mit Hilfe von gentechnischen Methoden lassen sich nicht nur einzelne Antikörpergene aus Hybridomzellen, sondern auch das komplette Antikörpergen-Repertoire aus B-Lymphozyten immunisierter oder nicht-immunisierter Spender vervielfältigen. Die Klonierung der amplifizierten Gene in entsprechenden Expressionsvektoren erlaubt dann die Expression von Antikörperfragmenten als Fusionsproteine auf der Phagenoberfläche. Aus einem Gemisch der unterschiedlichen Antikörperspezifitäten können dann mit Hilfe eines immobilisierten Antigens solche Phagen angereichert und isoliert werden, die einen entsprechend bindenden Antikörper auf ihrer Oberfläche tragen. Diese Methode ermöglichte erstmals die Herstellung einer größeren Zahl menschlicher Antikörper. Das phage display eröffnet ferner die Möglichkeit, monoklonale Maus-Antikörper schnell und erfolgreich zu humanisieren [1, 4]. Dazu werden die Gene eines zu humanisierenden Fv- oder Fab-Fragments in geeigneten Vektoren kloniert und als Fusionsprotein auf der Phagenoberfläche exprimiert. Das Genfragment der leichten bzw. der schweren Kette wird dann gegen eine Bibliothek menschlicher Antikörpergene ersetzt. Durch eine Affinitätsanreicherung am Antigen wird dann wieder eine spezifisch bindende Antikörpervariante selektioniert. Setzt man die so gefundenen Antikörpergene zusammen, so lassen sich vollständig humane Antikörperfragmente erhalten, die das gleiche Epitop erkennen wie der ursprüngliche Hybridomantikörper. Seit der Entwicklung dieser Technologien wurden Antikörperfragmente gegen alle möglichen Antigene gewonnen: Therapeutische Antikörper gegen hochgiftige oder pathogene Substanzen, mit denen Immunisierungen unmöglich gewesen wären, wurden ebenso hergestellt wie gegen körpereigene Stoffe, wie beispielsweise Steroidhormone, die im Organismus nicht immunogen wirken. Zur Analyse und Modifikation der DNA- beziehungsweise der Primärstruktur der Antikörper steht ferner die ausgereifte Tech- Oben: Humane anti-maus-antikörper (HAMA) werden vom menschlichen Immunsystem innerhalb weniger Tage als Antwort gegen Maus-Antikörper gebildet. Unten: Gegen humane Antikörper erfolgt keine Immunantwort. ABB. 3 G ENERIERUNG HUMANER ANTIKÖRPER-BIBLIOTHEKEN MITTELS PHAGE DISPLAY Oben: Um mittels phage display Antikörperbibliotheken zu generieren, werden zunächst die Genfragmente aus Antikörper produzierenden Zellen amplifiziert. Mitte: Das zufällige Zusammenfügen dieser Genfragmente in einem so genannten phagemid-expressionsvektor führt zunächst zu Gen-Bibliotheken mit hoher Komplexität. Die in den Vektoren klonierten Teile eines Antikörpers werden dann gemeinsam auf der Oberfläche eines Phagen exprimiert und bilden dort ein funktionelles Antikörperfragment. Unten: Durch mehrfache Affinitätsreinigungen mit Hilfe eines immobilisierten Antigens können spezifisch bindende Antikörperfragmente angereichert und schließlich selektioniert werden. Die Phagen exprimieren also ein spezifisches, rekombinantes Antikörperfragment aus der Bibliothek auf ihrer Oberfläche und tragen das dafür codierende Gen in ihrem Genom. Nr Jahrgang 2004 Biol. Unserer Zeit 375

5 ABB. 4 nologie der modernen Genetik zur Verfügung, welche auch die Verknüpfung von Antikörpergenen mit Genen anderer Proteine ermöglicht, um so Fusionsproteine mit neuen, erweiterten Funktionen hervorzubringen. Ganz aktuell gewinnt die Methode der in-vitro-selektion von Antikörpern noch in einem weiteren Gebiet an Bedeutung: die zunehmende Anzahl der weltweit durchgeführten Genomprojekte hat in den vergangenen Jahren zu einer ständig steigenden Nachfrage nach spezifischen Antikörpern zur Identifizierung neu entdeckter Proteine geführt. Obwohl die Evolution des Immunsystems ein nahezu EINE AUSWAHL UNTERSCHIEDLICHER FORMATE REKOMBINANTER ANTIKÖRPER unerschöpfliches Potenzial zur Generierung spezifisch bindender Moleküle hervorgebracht hat, suchen Forscher in vielen Laboratorien nach neuen Möglichkeiten einer schnelleren und vor allem billigeren Produktion von Antikörpern oder deren Fragmenten außerhalb eines Wirbeltierorganismus. Hier verspricht das für die automatisierte Herstellung mit Roboter-Pipettiersystemen geeignete Phagendisplay Produktionszahlen, die mit Tieren kaum zu erreichen sind. Zudem ermöglicht die in-vitro-selektion einen sehr wichtigen Vorteil: Die Selektion erfolgt unter biochemisch vollständig definierbaren Bedingungen und nicht in einem lebenden System. Rekombinante Antikörper Das Fv-Fragment ist die kleinste Einheit eines menschlichen Immunglobulins, welche eine komplette Antigenbindungsstelle beinhaltet. Sie besteht aus den variablen Domänen der schweren (V H ) und leichten Kette (V L, siehe auch Kasten auf S. 373). Aufgrund des relativ schwachen Zusammenhalts der variablen Domänen sind in der Regel zusätzliche Stabilisierungselemente notwendig, um die Dissoziation der beiden Untereinheiten zu verhindern. Daher wären auf der Oberfläche von Phagen exprimierte Fv- Fragmente zu instabil, um eine Selektion am Antigen zuzulassen. Abkürzungen: V H : variable Domäne der schweren Kette; V L : variable Domäne der leichten Kette; C H 1,3, C L : konstante Domänen; S-S: Disulfidbrücke; Fv: variabler Teil eines Antikörpers; scfv: durch eine Peptidverbindung stabilisiertes Fv-Fragment; dsfv: durch eine Disulfidbrücke stabilisiertes Fv-Fragment. scfv-fragmente Eine Möglichkeit, Fv-Fragmente zu stabilisieren, besteht darin, ihre V H - und V L -Domänen mit Hilfe eines kurzen Peptids unter Bildung von single-chain Fv-Fragmenten ( scfv, siehe auch Abbildung im Kasten auf Seite 373) zu verknüpfen. In der Regel werden flexible, hydrophile, 15 bis 20 Aminosäuren lange Peptide verwendet, um den Carboxyterminus der V H - mit dem Aminoterminus der V L - Domäne zu verbinden [2]. Da die beiden Proteindomänen auf einer Polypeptidkette liegen, erfordert die Assoziation der V H - und V L -Domäne nun keine bimolekulare Reaktion mehr (wie bei der Assoziation beider Domänen zu einem Fv-Fragment), sondern nur noch eine intramolekulare Umlagerung. Die Konzentrationen beider Domänen im vorhandenen Reaktionsraum sind hoch, was deren Assoziation zum Fv-Modul begünstigt und die scfv-fragmente kinetisch stabilisiert. ScFv-Fragmente (~25 kda) sind kleiner als Fab- Fragmente (~50 kda), weisen aber gewöhnlich vergleichbare Antigenbindungsaktivitäten wie die entsprechenden Fab-Fragmente des gleichen Antikörpers auf [5]. Sowohl scfv- als auch Fab-Fragmente können auf der Oberfläche von Phagen exprimiert und zur in-vitro-selektion eingesetzt werden. Ein Nachteil dieses Formats liegt jedoch darin, dass labile scfv-moleküle bei höheren Konzentrationen zur Aggregatbildung neigen. Eine niedrige Affinität der beiden variablen Domänen eines scfv-moduls zueinander führt nicht selten zur deren kurzzeitiger Dissoziation, nach der die variablen Domänen eines scfv-fragments mit denen eines anderen assoziieren können, so dass Dimere, Oligomere und schließlich Aggregate entstehen. 376 Biol. Unserer Zeit 34. Jahrgang 2004 Nr. 6

6 REKOMBINANTE ANTIKÖRPER BIOTECHNOLOGIE Disulfidbrücken-stabilisierte Fv-Fragmente Ein Ansatz zur Stabilisierung von Fv-Fragmenten liegt in der Einführung von Mutationen in die Gerüstregionen beider variabler Domänen, welche schließlich zur Ausbildung einer kovalenten Verknüpfung ihrer Kontaktflächen führen. Aus Strukturanalysen ließen sich einige Paare von Aminosäuren in komplementären Gerüstregionen der V H - und V L -Domäne identifizieren, die umgewandelt in Cysteine genau die richtige Entfernung zueinander aufweisen, um Disulfidbrücken auszubilden. Die auf diese Weise dargestellten disulfidbrücken-stabilisierten Fv-Fragmente ( dsfv) besitzen in der Regel ähnliche Antigenbindungsaktivitäten wie ihre homologen single-chain Fv-Fragmente und zeichnen sich gegenüber letzteren vor allem durch ihre verbesserte Stabilität gegenüber Hitze, Denaturierungsmitteln und Proteasen aus. Multivalente Antikörperfragmente Natürliche Immunglobuline, insbesondere die pentameren IgM-Antikörper, besitzen aufgrund ihrer Multivalenz eine im Vergleich zu den entsprechenden monovalenten Fab- Fragmenten signifikant höhere Affinität [5, 12]. Eine ähnliche Aviditätserhöhung wird erwartet, wenn Fab- oder scfv-fragmente zu Dimeren, Trimeren oder größeren Komplexen assoziieren. Ein elegantes Verfahren zur Darstellung multivalenter Antikörperfragmente liegt in der Reduzierung der Länge der Peptidverbindung zwischen den variablen Domänen eines scfv-fragments. Schon eine Verkürzung auf weniger als zwölf Aminosäurereste hat zur Folge, dass die beiden variablen Domänen einer scfv-polypeptidkette aus sterischen Gründen nicht mehr in der Lage sind, zu einem Fv-Fragment zu assoziieren. Stattdessen lagern sich die komplementären Domänen zweier scfv-moleküle zusammen und bilden so ein Homodimer, einen so genannten diabody (~50 kda) mit zwei Antigenbindungsstellen. Kürzt man das Peptid weiter auf weniger als drei Aminosäuren oder fusioniert man die variablen Regionen direkt miteinander, so assoziieren die scfv-fragmente gewöhnlich zu trimeren triabodies (~75 kda) oder auch zu tetrameren tetrabodies (~100 kda, Abbildung 4). Bispezifische Antikörper Bispezifische Antikörper, die gleichzeitig zwei verschiedene Antigene binden können, haben für die Therapie von Tumorerkrankungen in den vergangenen Jahren eine besondere Bedeutung erlangt, da sie in der Lage sind, zwei Zellen effektiv miteinander zu verbinden. Sie können Zellen des Immunsystems an Tumorzellen heranzuführen, um die körpereigene Immunabwehr gegen den Tumor zu mobilisieren. Als Zielstrukturen kommen dabei spezifische Oberflächenmoleküle auf zytotoxischen T-Zellen, natürlichen Killerzellen oder auf Makrophagen in Betracht. Zur Darstellung bispezifischer Immunglobuline fusionierten Milstein und Cuello 1983 erstmals zwei unterschiedliche Hybridomzelllinien miteinander. Die so entstandene Hybrid-Hybridoma- (oder auch Quadroma-) Zelle produzierte zwar den gewünschten bispezifischen Antikörper, jedoch ebenfalls weitere Immunglobuline, die von dem gewünschten bispezifischen Molekül aufwendig abgetrennt werden mussten. Stellt man die Antikörper rekombinant her, tritt dieses Problem nicht auf zudem kann man das molekulare Design variieren. Bei tumor imaging-versuchen erwies es sich als vorteilhaft, die Größe des Antikörpers zu reduzieren, um dessen Diffusionseigenschaften in das erkrankte Ge- GLOSSAR Affinität: die Stärke, mit der ein Molekül an einer einzelnen Stelle an ein anderes bindet. Avidität: die Gesamtbindungsstärke zwischen zwei Molekülen oder Zellen, die mehrere Bindungen miteinander eingehen können. bispezifisch: mit Bindungsstellen zweier unterschiedlicher Spezifitäten. bivalent: mit zwei gleichen Bindungsstellen. B-Lymphozyt: Zelle, die Antikörper auf ihrer Oberfläche exprimiert. Cystein: Aminosäure mit funktioneller Thiolgruppe. dsfv-fragment: (disulfide stabilized Fv) besitzt Cysteine an komplementären Stellen der Kontaktflächen beider variabler Regionen, die eine Disulfidbrücke ausbilden und damit dem Fv-Fragment eine verbesserte Stabilität verleihen. Epitop: eine Stelle auf einem Antigen, die von einem Antikörper erkannt wird. Fab-Fragment: (fragment antigen binding) sind die Arme mit den antigenbindenden Bereichen des Antikörpers, die bei einem partiellen Verdau mit Papain entstehen. Sie bestehen aus einer leichten Kette sowie V H und C H 1-Regionen der schweren Kette. Fv-Fragment: (fragment variable) ist der variable Teil eines Antikörpers, der für dessen Spezifität verantwortlich ist. Heterodimer: ein Molekül, das aus zwei unterschiedlichen Polypeptidketten besteht. Homodimer: ein Molekül, das aus zwei identischen Polypeptidketten besteht. Hybridome: hybride Zelllinien, die monoklonale Antikörper produzieren. immobilisierte Antigene: an Festphasen gebundene Antigene. Isotypen: die verschiedenen Klassen von Antikörpern, die sich in ihrer konstanten Region unterscheiden. kombinatorische Bibliothek: die Gesamtheit der in einem Expressionsvektor zufällig zusammengefügten Genfragmente, deren Transkripte eine komplexe Vielfalt funktioneller Antikörperfragmente unterschiedlichster Spezifitäten ergeben. maligne Tumoren: bösartige Krebserkrankungen, die Sekundärtumore bilden. monoklonale Antikörper: Antikörper mit einer bestimmten Spezifität, die von einer B-Zelle abstammen. monovalent: mit einer Bindungsstelle, somit auch monospezifisch. Plasmamyelomzellen: entartete Plasmazellen, mit denen Milzzellen fusioniert werden, um Hybridome herzustellen. polyklonale Antikörper: enthalten immer ein Gemisch von Antikörpern verschiedener Bindungsspezifitäten. scfv: (single chain Fv) sind stabilisierte Fv-Fragmente, die durch eine Peptidverbindung zu einem einzigen Proteinstrang verbunden sind. Tumor imaging-versuche: Methoden, die das Ausmaß von Krebserkrankungen durch bildgebende Verfahren erfassen. Nr Jahrgang 2004 Biol. Unserer Zeit 377

7 webe zu verbessern. Daher werden derzeit verschiedene bispezifische Antikörperkonstrukte mit Molmassen zwischen 60 und 120 kda entwickelt. Diese sind einerseits klein genug, um eine schnelle Tumorpenetration zu ermöglichen, sind aber andererseits groß genug, um nicht zu rasch durch die Nieren gefiltert zu werden [5, 12]. Die Techniken, um Fab- oder scfv-fragmente zu hochaffinen dimeren oder multimeren Komplexen in vitro oder in vivo zu konjugieren, reichen hierbei von einfachen chemischen Kopplungen bis zu einer Vielzahl von komplexen Fusionen mit Peptiden oder Proteindomänen [10, Abbildung 4]. Ein eleganter und oft verwendeter Weg zur Darstellung bispezifischer Antikörperfragmente liegt in der Entwicklung von bispezifischen diabodies. Durch die genetische Fusion der variablen Domänen (V H und V L ) zweier Antikörper A und B unter Bildung zweier Polypeptidketten V H A- V L B und V H B-V L A entstehen neben den Homodimeren (bestehend aus zwei gleichen Ketten), signifikante Mengen des gewünschten bispezifischen Moleküls, welches zwei unterschiedliche Antigenbindungsstellen in einem Heterodimer vereinigt. Bispezifische diabodies bieten viele Vorteile gegenüber bispezifischen Immunglobulinen: Aufgrund ihrer geringeren Größe wird die Immunantwort des Wirtes gegen die diabodies selbst minimiert und gleichzeitig die Tumorpenetration erhöht. Derartige Antikörperfragmente sind daher mannigfaltig einsetzbar und insbesondere gut für diagnostische oder therapeutische in vivo- Applikationen geeignet [12]. Ein konstruktionsbedingter Nachteil des diabody-formats liegt jedoch darin, dass die Kontaktflächen ihrer variablen Domänen nicht kovalent miteinander verbunden sind, was bei Verwendung labiler Fv-Module die für scfv-fragmente typische Dissoziation ihrer variablen Domänen mit nachfolgender Aggregatbildung zur Folge haben kann. Dieses Stabilitätsproblem wurde teilweise durch die Expression von disulfidbrücken-stabilisierten diabodies (ds diabodies) gelöst (Abbildung 4). In einem alternativen Ansatz zur Herstellung bivalenter und bispezifischer Moleküle wird die Interaktion verschiedener konstanter Domänen der Immunglobuline selbst ausgenutzt, um Homo- oder Heterodimere zu erzeugen [8]. Beispielsweise wurden bivalente, so genannte minibodies durch die Fusion eines scfv-fragments mit der C H 3-Domäne eines IgGs generiert, die als Dimerisierungsdomäne zur Generierung von Homodimeren verwendet wurde (s. auch Abbildung 4 unten). Die Darstellung bivalenter Antikörper gelang außerdem durch Fusion eines scfv-fragments mit der konstanten Domäne der leichten Kette oder mit beiden konstanten Domänen des Fc-Teils der schweren Kette eines IgGs. Diese Strategien sind allerdings aufgrund des symmetrischen Aufbaus der Produkte nicht sehr gut geeignet, um bispezifische Heterodimere zu produzieren. Solche können aber in Form von minibodies durch die Fusion eines scfv-fragments mit der konstanten Domäne der leichten Kette (C L ) sowie die Fusion eines anderen scfv-fragments mit der konstanten C H 1-Domäne der schweren Kette hergestellt werden (Abbildung 4 unten). Alternative Ansätze verwenden kurze Peptide oder Proteine zur Herstellung von multivalenten oder bispezifischen Antikörpern. Besonders interessant sind hier die kurzen Leucin-Zipper der beiden Transkriptionsfaktoren fos und jun, welche zur Dimerisierung neigen. Derartige Peptide konnten bereits zur Herstellung von bivalenten und bispezifischen Antikörpern herangezogen werden [11]. Größere multivalente beziehungsweise multimere scfv-fusionsproteine wurden durch die Verwendung von Proteindomänen, wie z.b. des Streptavidins, gewonnen [1]. TAB. 1 IN EUROPA ODER DEN USA FÜR KLINISCHE ANWENDUNGEN ZUGELASSENE REKOMBINANTE ANTIKÖRPER Handelsname/Name Typ Indikation Zulassung ReoPro (Abciximab) chimär, Fab Verhinderung von Blutplättchen-Aggregation 1994 / -97 Humaspect (Votumumab) human, radiomarkiert Kolon-Karzinom-in-vivo-Diagnostik 1996 Rituxan (Rituximab) chimär Non-Hodgkin s-lymphom 1997 Zenapax (daclizumab) humanisiert Verhinderung von Transplantatabstoßung (Niere) 1997 Simulect (Basiliximab) chimär Verhinderung von Transplantatabstoßung (Niere) 1998 Synagis (Palivizumab) humanisiert Respiratory syncytia virus 1998 Remicade (Infliximab) chimär Rheumatoide Arthritis, Morbus Crohn 1998 / -99 Herceptin (Trastuzumab) humanisiert Brustkrebs 1998 Mylotarg (gemtuzumab humanisiert Leukämie 2000 ozogamicin) Immunotoxin Campath (Alemtuzumab) humanisiert Leukämie 2001 Humira (Adalimumab) human Rheumatoide Arthritis 2002 Xolair (Omalizumab) humanisiert Asthma 2003 Raptiva (efalizumab) humanisiert Psoriasis 2003 Erbitux (Cetuximab) chimär Dickdarmkrebs 2003 Quelle: Firmeninformationen, Informationssekretariat Biotechnologie der Dechema, FDA 378 Biol. Unserer Zeit 34. Jahrgang 2004 Nr. 6

8 REKOMBINANTE ANTIKÖRPER BIOTECHNOLOGIE Ausblick Einige rekombinante Antikörper, vor allem humanisierte IgGs, sind bereits für unterschiedliche klinische Anwendungen zugelassen (Tabelle 1); viele weitere werden in naher Zukunft folgen und mit einer Reihe verschiedener Komponenten wie Radioisotopen, Enzymen, Toxinen, Viren oder Lipiden fusioniert werden, was ihre Anwendungsmöglichkeiten für klinische Applikationen gegenüber herkömmlichen Immunglobulinen stark erweitert. Nicht zuletzt wird die automatisierte in-vitro-selektion vieler verschiedener Antikörper die Herstellung von Proteomic - Microarrays ermöglichen und damit auch der Forschung, insbesondere der Systembiologie, neue Wege eröffnen. Zusammenfassung In den vergangenen Jahren stieg sowohl das wissenschaftliche als auch das kommerzielle Interesse an rekombinanten Antikörpern vor allem aufgrund des einfachen Weges zur Gewinnung komplett humaner IgGs. Innovative Selektionsmethoden wie das phage display ermöglichen heute sogar die Isolierung von humanen Antikörpern gegen giftige oder stark pathogene Antigene, wie sie unser eigenes Immunsystem nicht hervorzubringen vermag. Der Einsatz der Gentechnik ermöglicht die Herstellung kleiner Immunglobulinfragmente, welche die notwendige Information eines Antikörpers zur Antigenbindung auf ein Minimum reduzieren. Diese Fragmente können dann zu multivalenten, hochaffinen Molekülen mit optimierten pharmakokinetischen Eigenschaften aufgebaut werden, was ihre Anwendungsmöglichkeiten in Forschung, Diagnostik und Therapie gegenüber herkömmlichen Immunglobulinen stark erweitert. Literatur [1] F. Beitling, S. Dübel, Rekombinante Antikörper, Spektrum Akademischer Verlag GmbH, Heidelberg, [2] D. Filpula, J. McGuire, Single-chain Fv designs for protein, cell and gene therapeutics. Exp. Opin. Ther. Patents 1999, 9, [3] J.V. Gavilondo, J.W. Larrick, Antibody Engineering at the milenium. BioTechniques 2000, 29, [4] H.R. Hoogenboom, P. Charmes, Natural and designer binding sites made by phage display technology. Immunology today 2000, 21, [5] P.J. Hudson, A.A. Kortt, High avidity scfv multimers; diabodies and triabodies. J. Immunol. Meth. 1999, 231, [6] C.A. Janeway, P. Travers, Immunologie. 2. Aufl., Spektrum Akademischer Verlag GmbH, Heidelberg, [7] G. Köhler, C. Milstein, Continuous cultures of fused cells secreting antibody of predifined specificity. Nature 1975, 256, [8] R. Kontermann, Recombinant antibody fragments for cancer therapy. Mod. Asp. Immunobiol. 2000, 1, [9] E. Liddell, I. Weeks, Antikörper-Techniken, Spektrum Akademischer Verlag GmbH, Heidelberg, [10] M. Little, S.M. Kipriyanov, F. Le Gall, G. Moldenhauer, Of mice and men: hybridomas and recombinant antibodies. Immunology today 2000, 21, [11] A. Plückthun, P. Pack, New protein engineering approaches to multivalent and bispecific antibody fragments. Immunotech. 1997, 3, [12] A. Todorovska, R.C. Roovers, O. Dolezal, A.A. Kortt, H.R. Hoogenboom, P.J. Hudson, Design and application of diabodies, triabodies and tetrabodies for cancer targeting. J. Immunol. Methods 2001, 248, Die Autoren Andreas Schmiedl, geboren 1971 in Herford Studium der Chemie an der Universität Bielefeld; 1998 bis 2001 Doktorarbeit in der Arbeitsgruppe von Stefan Dübel im Institut für Molekulare Genetik der Fakultät für Biologie an der Universität Heidelberg; 2001 Promotion; 1998 bis 2000 Stipendium der Deutschen Forschungsgesellschaft und Mitglied im Graduiertenkolleg Biotechnologie molekulare und biochemische Grundlagen ; seit Juli 2002 Projektleiter bei der Firma Progen Biotechnik GmbH in Heidelberg. Petra Rohrbach, geboren 1967 in Montreal, Kanada Bachelor of Science, Major in Biology an der McGill University in Montreal, Kanada; Hauptstudium der Biologie an der Universität Heidelberg; Doktorarbeit in der Arbeitsgruppe von Melvyn Little im Deutsches Krebsforschungszentrum, Heidelberg; 2000 Promotion; 1998 bis 2000 Mitglied im Graduiertenkolleg Biotechnologie molekulare und biochemische Grundlagen ; Postdoc in der Arbeitsgruppe von Stefan Dübel im Institut für Molekulare Genetik der Fakultät für Biologie der Universität Heidelberg. Seit April 2002 Principle Investigator in der Arbeitsgruppe von Michael Lanzer im Hygiene Institut, Abteilung Parasitologie des Universitätsklinikum Heidelberg. Stefan Dübel, geboren 1960 in Hanau Studium der Biologie in Mainz und Heidelberg. Nach der Promotion sieben Jahre am Deutschen Krebsforschungszentrum Heidelberg. Von Arbeitsgruppenleiter im Institut für Molekulare Genetik, Heidelberg. Seit 2002 Lehrstuhl für Biotechnologie, Technische Universität Braunschweig. Korrespondenz: Dr. Andreas Schmiedl Progen Biotechnik GmbH Forschung und Entwicklung Maaßstr. 30, Heidelberg schmiedl@progen.de Mehr zum Thema finden Sie auch in dem von Michael Wink herausgegebenen Titel Molekulare Biotechnologie, Wiley-VCH, Weinheim S., 69, Euro/ 102, SFR. ISBN Nr Jahrgang 2004 Biol. Unserer Zeit 379