E MOLEKULARBIOLOGIE PCR-SBT ANALYSE VON HLA KLASSE II GENEN E - 5 PCR-SBT ANALYSE VON HLA KLASSE II GENEN
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- Ludo Falk
- vor 7 Jahren
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1 E - 5 RAINER FRANK, CHRISTIAN SEIDL UND EKKEHARD D. ALBERT E Einleitung Beim Sequence Based Typing (SBT) der HLA-Klasse II-Gene werden in der Regel PCR- Primer eingesetzt, die eine Sequenzierung des Exon 2-Bereichs der DR-, DQ- und DP-Gene ermöglichen. Daraus resultiert, daß einige Allelkombinationen wie z.b. DQB1*0201 und DQB1*0202, die sich an Position 404 im Exon 3 unterscheiden, nicht zu splitten sind. Zur Trennung einzelner Allelkombinationen ist aber die Durchführung spezieller Sequenzierungen zu aufwendig. Deshalb ist es sinnvoll, eine allelspezifische Detektion der HLA-Klasse II-DR/DQ/DP-Merkmale durch die Kombination von PCR-SSP-Technik und Sequenzierung zu erreichen. Die HLA-SBT-Technik benötigt qualitativ hochwertige Ergebnisse, da aufgrund der meist heterozygot vorliegenden Allele eines Merkmals Doppelpeaks innerhalb der Sequenz auftreten. Diese Doppelpeaks an heterozygoten Positionen sind im Vergleich zu homologen Peaks in der Signalstäke auf jeweils 50% pro Einzelpeak reduziert und können beim Auftreten von Background nicht immer eindeutig editiert werden. Ein weiteres Problem beim HLA-Klasse II-SBT entsteht aus dem Unvermögen der Methode, cis- oder trans-ständigkeit der Nukleotide zu detektieren. Dadurch treten HLA-Klasse II-Allelkombinationen auf, die durch eine einzelne Sequenzierung nicht zu trennen sind. Ist dies der Fall, müssen die auftretenden Allele durch zwei unterschiedliche PCR-Amplifikationen getrennt und anschließend in unterschiedlichen Sequenzierungen eindeutig bestimmt werden.. Beim Auftreten heterozygoter Allelkombinationen im SBT wird pro Bestimmung jeweils eine Forward- und eine Reverse-Sequenzierung empfohlen. Die Durchführung des HLA-SBT erfolgt in der Regel durch den Einsatz halbautomatischer Sequenzierer, die Fluoreszenzfarbstoffe anhand der nach Laseranregung emitierten Sekundärstrahlung detektieren können. Nach Amplifikation des zu bestimmenden HLA- Bereichs erfolgt die Vorbereitung der Sequenzierungsreaktion. Es wird je nach eingesetzter Polymerase zwischen Taq- und T7-Sequenzierungen unterschieden. Beide Techniken beruhen auf dem Prinzip der Sanger-Sequenzierung [1]. Die in einem bestimmten Prozentsatz im Reaktionsansatz enthaltenen Didesoxynukleotide (ddntp s) werden nach Wahrscheinlichkeit DGI Technisches Handbuch Histokompatibilität & Immungenetik
2 von der Polymerase als Bausteine zur DNA-Synthese verwendet und führen durch das Fehlen der 3 -OH-Gruppe zu einer Termination der Transkription. Während der Sequenzierungsreaktion entsteht dadurch für jede Nukleotidposition eine gelelektrophoretisch detektierbare Konzentration an DNA-Fragmenten. Die Markierung der generierten DNA mit Fluoreszenzfarbstoffen erfolgt unter Anwendung unterschiedlicher Techniken. Zum einen wird durch den Einbau markierter Desoxiribonukleotide in den entstehenden DNA-Strang eine Fluoreszenzmarkierung erzeugt. Bei anderen Methoden erfolgt eine Markierung am 3 - Ende durch den Einbau fluoreszenzmarkierter ddntp s (Perkin Elmer/Applied) oder am 5 Ende durch die Verwendung fluoreszenzmarkierter Primer. Von den angegebenen Möglichkeiten generiert die Sequenzierung mit fluoreszenzmarkierten Primern und T7- Polymerase prinzipiell die qualitativ besten Sequenzen. Diese eindeutige Aussage relativiert sich aber bei der Methodendurchführung. So benötigt beispielsweise die T7-Sequenzierung Konzentrationen an Target-DNA im Mikrogramm-Bereich, während Taq-Sequenzierungen mit weit weniger als 100ng DNA durchzuführen sind. Die Sequenzierung mit markierten Primern erfordert den Ansatz von vier Reaktionen pro Probe, während es bei fluoreszenzmarkierten ddntp s durch Verwendung der Vier-Farben-Technik (Perkin Elmer, Applied) möglich ist, die spezifischen A-, T-, G-, C-Reaktionen in einem Ansatz durchzuführen. Diesem Nachteil der Dye-Primer-Technik wird durch Modifizierung der Methode, wie z.b. der Fixierung des DNA-Templates an Streptavidin beschichtete Probenkämme (Pharmacia Biotech), begegnet. Im Gegensatz zu den Unterschieden innerhalb der Sequenzreaktion und den eingesetzten Fluoreszenzfarbstoffen ist allen automatischen Sequenzierungseinheiten das Prinzip der Online-Detektion im unteren Bereich des Sequenziergels gleich. Durch die Digitalisierung der Sequenzdaten wird eine computerunterstützte Auswertung ermöglicht. Ein Protokoll zur Methode der Taq-Sequenzierung (siehe 2.1) mit fluoreszenzmarkierten ddntp s (Perkin Elmer/Applied) sowie ein Protokoll zur Sequenase (T7)-Sequenzierung (siehe 2.2) mit fluoreszenzmarkierten Primern als Festphasensequenzierung über Streptavidin beschichtete Probenkämme (Pharmacia Biotech) wird im folgenden dargestellt. Prinzipiell können alle PCR-Produkte unter Einsatz des jeweiligen 5 - oder 3 -PCR-Primers mit den angegebenen Techniken sequenziert werden. Die Qualität der erhaltenen Sequenzen steht dabei immer in direktem Zusammenhang mit der Qualität des PCR-Produkts. Im HLA-Klasse II-DPB1-Bereich werden SBT-Methoden beschrieben, die eine Sequenzierung des zweiten Exons über flankierende 5 - und 3 -Intron-Primer ermöglichen (2,3). Dagegen erfolgt eine Sequenzierung der HLA-Klasse II-DRB- und DQB1-Gene unter Verwendung beschriebener `low resolution SSP-Primerpaare (4-6). 154 DGI Technisches Handbuch Histokompatibilität & Immungenetik 1998
3 E Taq-Sequenzierung mit fluoreszenzmarkierten ddntp s Anmerkung: Es erfolgen keine Angaben zur Herstellung von Sequenziergelen oder zu geräteabhängigen Laufvorbereitungen. E Puffer und Lösungen Taq cycle sequencing dye terminator Prism Kit (Perkin Elmer-Applied od. Amersham) Proben-Puffer: 5 Teile Formamid + 1 Teil 50 mm EDTA ph 8 Ammoniumacetat-Lösung (frisch ansetzen): 8M Ammoniumacetat Ethanol (abs.) und 70% Ethanol E Darstellung der Methode Nach Amplifikation der Target-DNA erfolgt die direkte Pipettierung der Taq/Sequenzierungsreaktion. Hierzu werden 5 µl des PCR-Produkts mit 10µl Aqua dest. gemischt. Aus der Verdünnung erfolgt die Entnahme von 3 µl Target-DNA zur Sequenzierung. Sollten aufgrund hoher Primerkonzentrationen innerhalb der PCR (>10pM) Hintergrundsignale bei der Sequenzierung auftreten muß eine Entfernung der PCR-Primer durchgeführt werden. Hierzu kann eine Mini-Säule verwendet werden. Entfernung der PCR-Primer durch Säulenaufreinigung (optional) Säulenmaterial S400 (Pharmacia Biotech) 1) Deckel der Säule um halbe Umdrehung öffnen und Nippel an Unterseite abbrechen. 2) Als Reaktionsgefäß (RG) werden 2 ml Röhrchen verwendet. 3) Säule in RG setzen und bei 3200 rpm 1 Minute (Eppendorf 5415C) zentrifugieren. 4) Die Orientierung der RG s im Rotor durch eine Markierung am RG fixieren. 5) Säule in neues RG übertragen und darauf achten, daß die Matrix gepackt und trocken ist. Etwaige am Säulenausgang verbliebene Pufferreste mit Laborfließ absaugen oder nochmals zentrifugieren. 6) Der Probenauftrag auf die Säule erfolgt am Arbeitsplatz. Dabei wird die Probe auf die innere, der Zentrifugenachse zugewandten Seite der Matrix aufgetragen. 7) Beim Zurückstellen der Säulen in die Zentrifuge auf die Ausrichtung der Matrix achten. 8) 2 Minuten bei 3200 rpm (Eppendorf 5415C) zentrifugieren und die im RG aufgefangene Probe zur Weiterverarbeitung entnehmen. DGI Technisches Handbuch Histokompatibilität & Immungenetik
4 Durchführung der Sequenzierungs-PCR Es erfolgt die Pipettierung der Sequenzierungsansätze mit anschließender Amplifikation. Bei Forward- und Reverse-Sequenzierung erfolgt die Pipettierung von zwei Ansätzen aus jeweils einer PCR-Verdünnung. Reaktions-Ansatz (20 µl Endvol.) Programm-Thermozykler Terminator ready mix 4 µl 96 C 15 Sek. Verdünnung (PCR-Prod.)70-200ng 3 µl 50 C 10 Sek. Seq.-Primer 10pM 60 C 4 Min. dh 2 O add. 20 µl insgesamt 26 Zyklen abkühlen auf 4 C Nach erfolgter Sequenzierung müssen überschüssige Terminatoren (farbmarkierte ddntp s) aus dem Ansatz entfernt werden. Dies kann durch Ammoniumacetat-Fällung oder über Säulenaufreinigung erreicht werden. Entfernung überschüssiger ddntp s durch Säulenaufreinigung Säulenmaterial G50 (Pharmacia Biotech) 1) Deckel der Säule um halbe Umdrehung öffnen und Nippel an Unterseite abbrechen. 2) Als Reaktionsgefäß (RG) werden 2 ml tubes verwendet. 3) Säule in RG setzen und bei 5000 rpm 1 Minute (Eppendorf 5415C) zentrifugieren. 4) Die Orientierung der RG s im Rotor durch eine Markierung am RG fixieren. 5) Säule in neues RG übertragen und darauf achten, daß die Matrix gepackt und trocken ist. Etwaige am Säulenausgang verbliebene Pufferreste mit Laborfließ absaugen oder nochmals zentrifugieren. 6) Der Probenauftrag auf die Säule erfolgt am Arbeitsplatz. Dabei wird die Probe auf die innere, der Zentrifugenachse zugewandten Seite der Matrix aufgetragen. 7) Beim Zurückstellen der Säulen in die Zentrifuge auf die Ausrichtung der Matrix achten. 8) 1 Minute bei 5000 rpm (Eppendorf 5415C) zentrifugieren und die im RG aufgefangene Probe zur Weiterverarbeitung entnehmen. 9) Die Reaktionsansätze werden anschließend in der SpinVac getrocknet. 10) Gelöst werden die lyophilisierten DNA-Pellets in 3 µl Proben-Puffer. 11) Es erfolgt eine 2 minütige Denaturierung bei 94 C. 12) Die Proben werden direkt nach der Denaturierung auf Eis gestellt und anschließend auf das Sequenzierungsgel aufgetragen. 156 DGI Technisches Handbuch Histokompatibilität & Immungenetik 1998
5 Entfernung überschüssiger ddntp s durch Ammoniumacetat-Fällung 1) 30 µl Ammoniumacetat-Lsg. (8 M) und 150 µl Ethanol (100%) den Ansätzen zugeben. 2) 10 Min. auf Eis inkubieren. 3) 15 Min. mit rpm zentrifugieren und Überstand entfernen. 4) Mit 300 µl Ethanol (70%) waschen und 10 Min. zentrifugieren. 5) Ethanol entfernen (wenn nötig Tropfen mit Laborpapier absaugen) und das Pellet mit SpinVac trocknen. 6) Anschließend erfolgt das Lösen der DNA-Pellets in 3 µl Proben-Puffer und eine 2 minütige Denaturierung bei 94 C. 7) Die Proben werden direkt nach der Denaturierung auf Eis gestellt und anschließend auf das Sequenziergel aufgetragen. DGI Technisches Handbuch Histokompatibilität & Immungenetik
6 E Festphasen T7-Sequenzierung mit fluoreszenzmarkierten Primern Es erfolgen keine Angaben zur Herstellung von Sequenziergelen oder zu geräteabhängigen Laufvorbereitungen. E Puffer und Lösungen Sequenase-AutoLoad-Kit (Pharmacia Biotech) Bindungs-/Wasch-Puffer: 2M NaCl, 10mM Tris-HCl (ph 7,5), 1mM EDTA NaOH 0,1M: Stammlösung aliquotieren und bei -20 C lagern TE-Puffer: 10mM Tris-HCl, 1mM EDTA (ph 8) E Darstellung der Methode 1) Zur Durchführung einer Sequenzierung werden µl PCR-Produkt benötigt. 2) Die Mengenangaben innerhalb der Beschreibung beziehen sich auf einen Parallelansatz von 10 Proben. 3) 40µl Bindungs-/Wasch-Puffer und 40µl Aqua dest. in jedes Well einer 10-Well-Platte (Kit-Bestandteil) einfüllen. 4) 40-50µl PCR-Produkt den Wells zugeben. 5) Insgesamt 5 Kämme mit jeweils 8 Zähnen (Kit-Bestandteil) werden für 10 Proben benötigt. Die richtige Orientierung ergibt sich, indem die zu einer quadratischen Kassette zusammengesteckten Kämme, mit den Zapfen zum Anwender zeigend, in die 10-Well-Platte eingetaucht werden. Jeweils vier Zähne pro Kamm tauchen nun in eine Vertiefung der 10-Well-Platte ein und werden mit der Proben-Nr. dieses Wells beschriftet. 6) Die Proben-Kamm-Kassette 2-3 mal in der Platte hoch und runter bewegen und 30 Min. bei 65 C inkubieren (Bindung des PCR-Produktes). 7) Die zur Denaturierung benötigte NaOH (0,1M) auftauen. Denaturierung 1) Proben-Kamm-Kassette zweimal in Petrischalen mit TE-Puffer waschen. 2) In einer neuen 10-Well-Platte werden 120µl/Well 0,1M NaOH vorgelegt. 3) Die Proben-Kamm-Kassette 5 Min. in der 10-Well-NaOH-Platte bei RT inkubieren. 4) Anschließend 1 x Waschen in Petrischale mit NaOH (0,1M) 1 x Waschen in Petrischale mit TE-Puffer 1 x Waschen in Petrischale mit Aqua dest. (höchstens 5 Minuten) Primer-Anlagerung 1) Für ALFExpress müssen Cy5-markierte Primer verwendet werden. 158 DGI Technisches Handbuch Histokompatibilität & Immungenetik 1998
7 2) Beschicken einer neuen 10-Well-Platte mit 115µl / Well von folgender Lösung: Annealing Buffer 120 µl Cy5-Seq.-Primer 40pmol Aqua dest. ad 1200 µl 115 µl pro Well Bei Einsatz unterschiedlicher Sequenzierprimer muß der für 10 Reaktionen ausgelegte Mix gesplittet werden. 3) Bestückte Platte 2 Min. auf 65 C vorwärmen. 4) Die Proben-Kamm-Kassette in die Platte einsetzen (3mal auf u. ab bewegen) und bei 65 C für 10 Min. inkubieren. 5) Innerhalb von 10 Min. die Platte auf RT abkühlen lassen. Sequenzierung Im folgenden werden die einzelnen Ansätze zur A-, C-, G-, T-spezifischen Sequenzreaktion pipettiert. T7-Praemix mit kaltem Enzym-Dilution-Buffer ansetzen und auf Eis pipettieren (T7-Endkonz. 2U/µl) Anzahl Seq. Volumen an T7 Dilution-Buffer Endvol. 2 2,5 7,5 µl 10 µl 4 4,5 13,5 µl 18 µl 6 6,5 19,5 µl 26 µl 8 8,5 25,5 µl 34 µl µl 44 µl Für jedes ddntp (A, C, G, T) wird ein eigener Praemix hergestellt. Das Rezept für 10 Sequenzierungen ist im folgenden angegeben. Dieser Ansatz muß vier mal (einmal pro ddntp) hergestellt werden. Nukl.-Mix (A, C, G, oder T) 30µl Anneal.-Buffer 20µl Extension Buffer 10µl Aqua dest. 120µl DMSO 10µl Praemix T7 10µl Bestückung einer 40-Well-Platte (Kit-Bestandteil) DGI Technisches Handbuch Histokompatibilität & Immungenetik
8 1) Jeweils 19µl der hergestellten Praemix-Lösungen werden pro Well eingesetzt. Die Reihenfolge ist A, C, G, T. 2) Die Proben-Kamm-Kassette in einer Petrischale mit TE-Puffer spülen. 3) Die bestückte Platte auf 37 C vorwärmen (innerhalb von 1 Min.) und anschließend die Proben-Kamm-Kassette einsetzen und 5 Min. inkubieren. 4) Die Proben-Kamm-Kassette in Petrischale mit TE-Puffer inkubieren und anschließend auf Eis stellen. NB: Nach Vorlage von 10 µl Auftragspuffer (Kit-Bestandteil) pro Geltasche können die einzelnen Proben-Kämme direkt in das Sequenziergel eingesetzt werden. E Kommerziell angebotene HLA-Klasse II-SBT-Kits Von Perkin Elmer Applied Biosystems (Weiterstadt, Deutschland) wird ein HLA- Klasse II-DRB1-SBT kommerziell angeboten, der methodisch auf die Taq- Sequenzierung aufbaut und sowohl auf den PAGE-Sytemen ABI-Prism 370/373/377 als auch auf dem Kapillarelektrophorese System ABI-Prism 310 eingesetzt werden kann. Mit der Software Sequence Navigator und Match Maker wird eine HLA spezifische Auswertung der erhaltenen HLA-Klasse II-DRB1 Sequenzen ermöglicht. Amersham Pharmacia Biotech (Freiburg, Deutschland) bietet ebenfalls verschiedene Sequenzierautomaten an. Für den ALF Express steht ein HLA-Klasse II-DRB1-SBT Kit und ein HLA-Klasse II-DQB1-SBT Kit zur Verfügung, welche methodisch auf die T7-Sequenzierung aufbauen. Mit der Software HLA SequiTyper (Pharmacia Biotech) wird eine computergestützte Auswertung erhaltener HLA-Klasse II Sequenzen ermöglicht. Weiterhin wird der Sequenzierautomat Vistra sowie das System SEQ4x4 Personal Sequenzer angeboten. Bei dem System SEQ4x4 Personal Sequenzer handelt es sich um ein Fertiggelkassettensystem. Von Visible Genetics (Leiden, Niederlande / Auetal, Deutschland) wird ein Sequenzierautomat OpenGene Automated DNA Sequenzing System mit Fertiggelkassette sowie ein HLA-Klasse II-DRB1-SBT Kit angeboten. Die Software GeneObjects DNA ermöglicht die Auswertung der HLA-Klasse II-DRB1 Sequenzen. Im HLA-Klasse II-DPB1 Bereich besitzt Perkin Elmer Applied Biosystem wie auch Amersham Pharmacia Biotech funktionstüchtige Analysekits, die aber derzeit nicht kommerziell erhältlich sind. 160 DGI Technisches Handbuch Histokompatibilität & Immungenetik 1998
9 Inwieweit in Verbindung mit dem Sequenzierer von LI-COR (LI-COR 4200, Vertrieb über MWG.BIOTECH, Ebersberg, Deutschland) ein spezielles HLA-Analysesystem angeboten wird ist nicht bekannt. Zur Auswertung der Sequenzen steht die Base ImagIR Sequence Analysis Software sowie die DNASIS Software zur Verfügung. E Literatur 1. Sanger F, Nicklen S, Coulson AR: DNA Sequencing with chain-terminating inhibitors. Proc Natl Acad Sci USA 1977;74: Versluis LF, Rozemuller E, Tonks S, Marsh SGE, Bouwens AGM, Bodmer JG, Tilanus MG: High resolution HLA-DPB typing based upon computerized analysis of data obtained by fluorescent sequencing of the amplified polymorphic exon 2. Hum Immunol 1993;38: Versluis LF, Rozemuller E, Duran K, Tilanus MG: Ambiguous DPB allele combinations resolved by direct sequencing of selectively amplified alleles. Tissue Antigens 1995;46(4): Bein G, Gläser R, Kirchner H: Rapid HLA-DRB1 genotyping by nested PCR amplification. Tissue Antigens 1992;39: Bein G, Haase D, Schult J, Eiermann TH, Kirchner H: Semiautomated HLA-DQB1 typing by fluorescent dye photometry of amplified DNA on microtiter plates. Hum Immunol 1994;39: Picard JK: Single-step Allele-specific polymerase chain reaction HLA-DQ genotyping using ARMS primers. Hum Immunology 1993;38: DGI Technisches Handbuch Histokompatibilität & Immungenetik
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