Ausarbeitung des Seminars: Co-Kultivierung von Escherichia coli und Saccharomyces cerevisiae zur Paclitaxel-Synthese

Transkript

1 Ausarbeitung des Seminars: Co-Kultivierung von Escherichia coli und Saccharomyces cerevisiae zur Paclitaxel-Synthese Zhou, K., Qiao, K., Edgar, S. & Stephanopoulos, G. Distributing a metabolic pathway among a microbial consortium enhances production of natural products. Nature Biotechnology 33, (2015). Einleitung Auf der Suche nach neuen Wirkstoffen, die therapeutisch, unter anderem gegen Krebs, eingesetzt werden können, stellt man häufig fest, dass viele solcher Stoffe in Pflanzen gefunden werden können [2]. Ein Beispiel für einen solchen Wirkstoff ist der Antikrebswirkstoff Paclitaxel. Auf Folie 2 ist die chemische Struktur dieses Moleküls dargestellt. Anhand dieser Abbildung kann man bereits erkennen, dass es sich hierbei um ein sehr komplexes Molekül handelt. Obwohl dieser Wirkstoff bereits aus Pflanzen gewonnen bzw. in Pflanzenzellen produziert werden kann [3], wäre eine heterologe Produktion in Mikroorganismen vorteilhaft, um eine robuste und nachhaltige Produktion zu ermöglichen. Für eine solche heterologe Produktion gäbe es zwei naheliegende Möglichkeiten, zum einen Bakterien und zum anderen Hefen, wobei es in beiden Systemen bestimmte Probleme gibt. In Bakterien ist es allgemein schwierig komplexe eukaryotische Enzyme, welche für die Synthese von komplexen Molekülen wie Paclitaxel (siehe Folie 2) benötigt würden, funktional zu exprimieren [4]. Auf der anderen Seite ist es in Hefen schwierig eine hohe Ausbeute bei der Produktion von Bausteinen natürlicher Produkte zu erreichen. Um diese Probleme zu überwinden, war die Idee in der hier vorgestellten Veröffentlichung, Mikroorganismen in einem Konsortium zu kultivieren, um damit die Vorteile der Einzelorganismen auszunutzen, während ihre Nachteile ausgeglichen werden. Für den Ausbau eines solchen Konsortiums gibt es im Allgemeinen viele verschiedene Möglichkeiten. Eine erste Möglichkeit, die

2 bereits häufiger untersucht wurde, ist eine Interaktion der Spezies, indem die eine Spezies ausschließlich die Kohlenstoffquelle für die zweite Spezies zur Verfügung stellt. In dieser Veröffentlichung wurde allerdings darüber hinaus ein vollständiger Stoffwechselweg auf die zwei Spezies aufgeteilt, wobei eine Spezies ein metabolisches Zwischenprodukt synthetisiert, welches in die zweite Spezies diffundiert und dort weiter funktionalisiert wird. Umgesetzt wurde diese Idee, indem mit Hilfe von zwei Modellmikroorganismen ein Vorläufermolekül von Paclitaxel produziert wurde. Bei dem ersten Mikroorganismus, der dabei verwendet wurde, handelte es sich um E. coli. Dieser wurde verwendet um Taxadien, das Grundgerüstmolekül von Paclitaxel, herzustellen. Bei dem zweiten Mikroorganismus handelte es um S. cerevisiae, welche verwendet wurde, um Taxadien durch eine Oxygenierungsreaktion mit Hilfe eines Cytochrom P450 (CYP) weiter zu funktionalisieren. Auf diese Weise sollte die schnelle Produktion von Taxadien in E. coli und die effiziente Oxygenierung in S. cerevisiae kombiniert werden. Co-Kultur Design Beim Design der Co-Kultur wurden verschiedene Konzepte entwickelt und getestet. Als Erstes wurde dabei ein kompetitives Design genauer untersucht (siehe Folie 6). In diesem Fall nutzen sowohl E. coli als auch S. cerevisiae Glukose als Kohlenstoffquelle. Taxadien wird von E. coli produziert, diffundiert in S. cerevisiae und wird dort oxygeniert. Bei weiterer Untersuchung der Ergebnisse stellte sich hier allerdings heraus, dass S. cerevisiae Ethanol produzierte, welches das Wachstum von E. coli inhibierte. Trotz dieser Tatsache konnten in dieser Co-Kultur oxygenierte Taxane produziert werden, wie die Abbild auf Folie 6 zeigt. Die Hypothese, dass das von S. cerevisiae produzierte Ethanol das Wachstum von E. coli inhibierte, konnte damit belegt werden, dass E. coli in der Co-Kultur deutlich schwächer wuchs als in einer reinen E. coli Kultur und dass sich das extrazelluläre Ethanol in der Co- Kultur anreicherte (Folie 7). Ein Problem, dass sich daraus ergab, war dass die insgesamt Menge an Taxanen, also Taxadien und oxygenierte Taxane, in der Co-Kultur deutlich verringert war als in einer reinen E. coli Kultur. Um dieses Problem zu lösen wurde ein neues Co-Kultur Design entwickelt. Die Idee dieses neuen Designs für die Co-Kultur basierte auf der Idee einer mutualistischen Interaktion der Mikroorganismen untereinander (Folie 8). Dazu wurde das Substrat Glukose durch Xylose ersetzt, welche nur von E. coli als Kohlenstoffquelle genutzt werden kann. Dabei produziert E. coli Taxadien und Acetat. Dieses Acetat kann wiederum von S. cerevisiae als Kohlenstoffquelle genutzt werden. Außerdem konnten erneut oxygenierte Taxane produziert werden. Auf diese Weise konnte erreicht werden, dass beide Mikroorganismen voneinander profitieren bzw. voneinander abhängig sind, da S. cerevisiae das Acetat verwendet, welches ansonsten in zu hohen

3 Konzentrationen das Wachstum von E. coli inhibieren würde. Ein weiterer Vorteil ist, dass in dieser Konfiguration kein Ethanol von S. cerevisiae produziert wird. Anhand der Ergebnisse (Folie 9) konnte gezeigt werden, dass in dieser Co-Kultur Konfiguration das extrazelluläre Acetat, welches sich in einer reinen E. coli Kultur anreichert, in der Co-Kultur nach einem kurzen Anstieg abnimmt. Diese Verzögerung ist vermutlich darauf zurückzuführen, dass S. cerevisiae zuerst eine gewisse Zelldichte erreichen musste. Außerdem konnte gezeigt werden, dass der zusammengefasste Titer von Taxanen in diesem Co-Kulturdesign nicht deutlich geringer war als in einer reinen E. coli Kultur, wobei allerdings ein weiteres Problem identifiziert wurde, die geringe Oxygenierungseffizienz. Von den ungefähr 50 mg/l produzierten gesamten Taxanen sind nur ungefähr 4 mg/l oxygenierte Taxane. Optimierung der Taxadien Oxygenierung Um das Problem der geringen Oxygenierungseffizienz zu lösen, wurden mehrere Schritte durchgeführt. In einem ersten Schritt wurde das Inokulum erhöht und periodisch wichtige Nährstoffe zugeführt, um allgemein das Wachstum von S. cerevisiae zu verbessern und damit auch die Menge an oxygenierten Taxanen zu erhöhen. Auf diese Weise konnte bereits eine Verdreifachung des Titers an oxygenierten Taxanen auf 16 mg/l erreicht werden. In einem zweiten Schritt wurde anschließend ein stärkerer Promotor für das Gen des CYP-Enzyms eingebaut, wodurch der Titer an oxygenierten Taxanen weiter auf 25 mg/l erhöht werden konnte. Der dritte Schritt bestand darin, E.coli gentechnisch so zu manipulieren, dass mehr Acetat produziert wird, welches wiederum als Substrat für S. cerevisiae dient. Die Idee dabei war, dass in E. coli das Gen atpfh ausschaltet wurde, welches an der oxydativen Phosphorylierung beteiligt ist. Auf diese Weise sollte den Zellen die primäre Quelle von ATP entzogen werden, weshalb die Zellen eine andere Möglichkeit der ATP-Gewinnung benötigen, beispielsweise die Produktion von Acetat (Folie 11). Anhand der Ergebnisse (Folie 12) konnte gezeigt werden, dass mit Hilfe des Gen-Knockouts in E. coli das Wachstum von S. cerevisiae tatsächlich erhöht werden konnte, wodurch wiederum der Titer an oxygenierten Taxanen auf 33 mg/l erhöht werden konnte. Insgesamt konnte damit eine Oxygenierungseffizienz von ungefähr 75 % erreicht werden.

4 Produktion von monoacetylierten, dioxygenierten Taxanen Das entwickelte Co-Kultur Design wurde weiter untersucht, indem versucht wurde, ob auch komplexere Vorläufermoleküle produziert werden können. Dazu wurden in S. cerevisiae weitere Enzyme exprimiert, welche eine Acetylierung an der C-5α Position und eine weitere Oxygenierung an der C-10β Position durchführen sollten. Das damit produzierte Molekül konnte in einer HPLC nachgewiesen werden. In diesem Fall musste damit nur das Hefe-Modul verändert werden, um auch komplexere Moleküle in der Co-Kultur produzieren zu können. Produktion von anderen oxygenierten Produkten durch die Co-Kultur In einem nächsten Schritt wurde untersucht, ob das entwickelte Co-Kultur Design auch zur Produktion anderer Stoffe verwendet werden könnte. Eine Voraussetzung hierfür wäre lediglich, dass ein Zwischenprodukt bei der Produktion des Endproduktes Zellmembranen überwinden kann. Dies wurde gezeigt, indem zwei andere Stoffe, Ferruginol mit Miltiradien als Zwischenprodukt das Zellmembranen überwinden kann und Nootkaton mit Valencen als entsprechendem Zwischenprodukt, mit Hilfe der Co-Kultur produziert werden können. Dabei konnte ein Ferruginol Titer von bis zu 18 mg/l und ein Nootkaton Titer von bis zu 4 mg/l erreicht werden. Allgemein mussten in diesen Beispielen wieder nur die entsprechenden Enzyme für die Produktion des jeweiligen Stoffes bzw. Zwischenproduktes in E. coli und S. cerevisiae exprimiert werden. Fazit In der hier vorgestellten Veröffentlichung konnte eine mutualistische Co-Kultur von E. coli und S. cerevisiae entwickelt werden, indem eine Zusammenarbeit bzw. Abhängigkeit der Mikroorganismen erzwungen wurde. Außerdem konnte der Stoffwechselweg für die Produktion komplexer Stoffe in zwei Module aufgeteilt werden, welche auf die zwei Mikroorganismen der Co-Kultur verteilt wurden, wodurch die Vorteile der verschiedenen Spezies ausgenutzt werden konnten. Dadurch konnten wiederum komplexe, natürliche Moleküle produziert werden, welche zu diesem Zeitpunkt noch nicht effizient in einzelnen Mikroorganismen hergestellt werden konnten.

5 Literatur: [1] Zhou, K., Qiao, K., Edgar, S. & Stephanopoulos, G. Distributing a metabolic pathway among a microbial consortium enhances production of natural products. Nature Biotechnology 33, (2015). [2] Cragg, G. M., Newman, D.J. Plants as a source of anti-cancer and anti-hiv agents. Ann Appl Biol 143, (2003). [3] Frense, D. Taxanes: perspectives for biotechnological production. Appl Microbiol Biotechnol. 73, (2007). [4] Chang, M. C. Y., Eachus, R. A., Trieu, W., Ro, D. & Keasling, J. D. Engineering Escherichia coli for production of functionalized terpenoids using plant P450s. Nature Chemical Biology 3, (2007). [5] Kingston, D. G. I. The Shape of Things to Come: Structural and Synthetic Studies of Taxol and Related Compounds. Phytochemistry 68, (2007). [6] Ajikumar, P.K. et al. Isoprenoid pathway optimization for Taxol precursor overproduction in Escherichia coli. Science 330, (2010).