Malaria. Plasmodium falciparum, Malaria tropica, Erythrozyten, Färbung nach Pappenheim.

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1 Malaria TEAS - 00 Themen Plasmodium falciparum, Malaria tropica, Erythrozyten, Färbung nach Pappenheim. Prinzip Die Malaria wird ausgelöst durch Plasmodien. Die Übertragung der Erkrankung erfolgt über die weibliche Form der Anophelesmücke. Das Plasmodium Falciparum ist der Erreger der Tropenkrankheit Malaria tropica, die gefährlichste Form der Malaria. Die Dicke-Tropfen Methode wird nicht nur für die Diagnose von Malaria verwendet sonder auch für andere parasitäre Infektionskrankheiten wie die Schlafkrankheit. Im Differenzialblut lassen sich ergänzend verschiedene Formen des Erregers und typische Anzeichnen wie die Maurersche Fleckung oder die Schüffnersche Tüpfelung besser beobachten. Material Schülerset 1 Messpipette 10 ml, Teilung 0,1 ml Pipettierball Reagenzglasgestell, PP, 12 Plätze Messkolben, 1000 ml Messzylinder, 250 ml Färbebank mit Wanne Spritzflasche, 500 ml Einweghandschuhe, M, Latex, 100 Stk Objekträger Immersionsöl, 50 ml Mikroskop Chemikalien Azur-Eosin-Methylenblau-Lösung, ml Fixierlösung Methanol May-Grünwald-Lösung Puffertabletten ph 7,2 für Mikroskopie Aufgaben 1. Diagnostizieren Sie Malaria anhand der Dicke-Tropfen-Methode 2. Bestimmen Sie die Erregerdichte und differenzieren Sie die Plasmodien anhand eines Differentialblutbildes Abb.1: P P PHYWE Systeme GmbH & Co. KG All rights reserved 1

2 TEAS Malaria Grundlagen Die Malaria wird ausgelöst durch Plasmodien. Die häufigsten humanpathogenen Erreger sind Plasmodium falciparum Malaria trpica, Plasmodium vivax und Plasmodium ovale Malaria tertiana sowie Plasmodium malariae Malaria quartana. Die Übertragung der Erkrankung erfolgt über die weibliche Form der Anophelesmücke, nach dem Einstich gelangen die Sporozoiten über das Blut in die Leberparenchymzellen. Dort entwickeln sie sich zu Gewebsschizonten, die die Merozoiten produzieren ( pro Zelle) Nach dem Absterben der Leberzelle dringen die Merozoiten in die Erythrozyten ein. Dort findet die asexuelle Reifung zu Trophozoiten und weiter zu Blutschizonten statt, die dann wieder neue Merozoiten produzieren. Je nach Erreger sterben die Erythrozyten nach Stunden ab, setzen die Merozoiten in das periphere Blut frei und lösen damit einen Fieberschub aus. Diese Merozoiten infizieren dann weitere Erythrozyten. In den Erythrozyten entwickeln sich aus den Merozoiten ebenfalls männliche und weibliche Gametozyten, die bei einem weiteren Stich der Anophelesmücke von dieser wieder aufgenommen werden. In ihrem Darm entstehen daraus Gemeten. Bei der sexuellen Vermehrung der männlichen und weiblichen Gemeten entstehen Zygoten, die sich zu Oozysten und weiter zu Sporozoiten entwickeln. Jetzt kann sich der Entwicklungszyklus wiederhole. Das Plasmodium Falciparum ist der Erreger der Tropenkrankheit Malaria tropica, die gefährlichste Form der Malaria. Die Inkubationszeit beträgt 7 15 Tage. Symptome: Schüttelfrost, heftige Fieberschübe, die meist keinen festen Rhythmus haben, starke Kopf und Rückenschmerzen, Schwindel und abdominale Schmerzen. Die Malaria tertiana kann durch zwei verschiedene Erreger ausgelöst werden: 1. Plasmodium vivax. Die befallenen Erythrozyten sind vergrößert und tragen nur einen Sielring, häufg ist eine Schüffnersche Tüpfelung zu sehen, die feinen Granula bestehen ebenfalls aus abgebautem Hämoglobin. 2. Plasmodium ovale: siehe Plasmodium vivax, die befallenen Erythrozyten haben aber häufig eine ovale Form. Die Malaria tertiana hat ihren Namen von den regelmäßig alle drei Tage auftretenden Fieberschüben, so wie bei der seltenen Malaria quartana die Fieberschübe alle vier Tage auftreten Die Dicke-Tropfen Methode wird nicht nur für die Diagnose von Malaria verwendet sonder auch für andere parasitäre Infektionskrankheiten wie die Schlafkrankheit. Die Methode wird als Dicker Tropfen bezeichnet, da anders als beim normalen Blutausstrich zwischen 5 und 10 µl Venen- oder Kapillarblut auf einem Objektträger als 1 cm großer Fleck eintrocknen. Dadurch erhält man eine Anreicherung des Erregers. Da das Dicke Tropfen-Präparat nicht fixiert wird, führt die anschließende Färbung zur Hämolyse der Erythrozyten. Die Parasiten sind weiter gut zu erkennen. Im Differenzialblut lassen sich ergänzend verschiedene Formen des Erregers und typische Anzeichnen wie die Maurersche Fleckung oder die Schüffnersche Tüpfelung besser beobachten. Der Dicke Tropfen ist allerdings erheblich einfacher auch unter schlechten Bedingungen durchzuführen und hat deshalb weiterhin große diagnostische Bedeutung von Malaria. In Dickem Tropfen und Blutausstrich: typisch sind häufig mehrere ringförmige Parasiten (Siegelringform) in einem Erythrozyten, eher sehr selten Maurersche Flecken, die aus abgebautem Hämoglobin in den Erythrozyten bestehen 2 PHYWE Systeme GmbH & Co. KG All rights reserved P

3 Malaria TEAS Aufgabe 1: Diagnostizieren Sie Malaria anhand der Dicke-Tropfen-Methode Untersuchungsmaterial Untersuchungsmaterial: Kapillarblut oder EDTA-Blut nach venöser Entnahme siehe dort. Es geht hier um eine Arbeitsanleitung. Das Üben mit positiven Präparaten ist sicher sinnvoll, man sollte aber als Schüler nicht mit der Blutentnahme bei hochinfektiösen Patienten anfangen. Durchführung Herstellung der verdünnten Giemsa-Lösung: 1 ml Giemsa-Stammlösung + 9 ml Phosphatpuffer ph 7,2 Präparation Für den dicken Tropfen werden ca. 10 µl EDTA- oder Kapillarblut auf einem beschrifteten Objektträger kreisförmig gründlich verrührt und ca. 40 Minuten bei Raumtemperatur getrocknet. Anschließend wird 30 Minuten in der Färbebank mit verdünnter Giemsalösung gefärbt. Vorsichtig mit Leitungswasser abspülen und das Präparat an der Luft trocknen lassen. Mikroskopieren Nach dem Einstellen des Präparates unter dem Mikroskop mit dem 20er Objektiv wird der Ausstrich mit Immersionsöl und dem 100er Objektiv mäanderförmig durchmustert (Abb. 2). Für einen negativen Befund müssen mindestens 200 Gesichtsfelder sorgfältig durchmustert werden, dies schließt aber eine Erkrankung keinesfalls aus! Bei unbestätigtem Verdacht auf Malaria mit der passenden klinischen Symptomatik müssen die Untersuchungen in stündigem Abstand wiederholt werden! Abb. 2: Dicker Tropfen mit Plasmodien P PHYWE Systeme GmbH & Co. KG All rights reserved 3

4 TEAS Malaria Aufgabe 2: Bestimmen Sie die Erregerdichte und differenzieren Sie die Plasmodien anhand eines Differentialblutbildes. Untersuchungsmaterial Kapillarblut oder EDTA-Blut nach venöser Entnahme siehe dort. Vorgehen: Der parallel durchgeführte Blutausstrich mit Pappenheim-Färbung (Standardmethode, siehe P ) dient zur Bestimmung der Erregerdichte (Parasitämiegrad) und zur Differenzierung der Plasmodien. Voraussetzung für die Berechnung des relativen Parasitämiegrades ist eine Erythrozytenzahl im Bereich der Normwerte. Am Mikroskop werden dann 5 Gesichtsfelder, in denen die Erythrozyten in einer Ebene dicht nebeneinander liegen (man sieht dann je Gesichtsfeld ca. 200 Erythrozyten), ausgewertet, indem die befallenen Erythozyten in diesen 5 Gesichtsfeldern gezählt werden. Gezählte Plasmodien in 5 Gesichtsfeldern à 200 Erythrozyten = Relativer Parasitämiegrad in Für die Berechnung des Parasitämiegrades bei erniedrigter Erythrozytenzahl gilt folgende Formel: Gezählte Plasmodien auf 1000 gezählten Erythrozyten multipliziert mit der Erythrozytenzahl (T/L) dividiert durch 1000 (Umrechnung auf G/L) = Absoluter Parasitämiegrad in G/L. Auswertung Der Erreger der Malaria tropica, Plasmodium falciparum, kann mit einiger Übung im Präparat erkannt werden (Abb. 3): in den Erythrozyten sind häufig mehrere ringförmige Parasiten (Trophozoiten) zu erkennen. Diese sogenannten Siegelringformen sind kleiner als 1/3 des Erythrozytendurchmessers und nicht so grob wie andere Plasmodien. Eine weitere Differenzierung im Ausstrich findet nach den bereits im Einführungsteil erwähnten Kriterien statt. Malariapigment in Granulozyten weist auf eine schlechte Prognose hin! Plasmodien Abb. 3: Plasmodien im Differenzialblutbild. 4 PHYWE Systeme GmbH & Co. KG All rights reserved P

5 Malaria TEAS Hinweis Die oft notwendige komplette Durchmusterung von Dickem Tropfen und Ausstrich dauert je 30 Minuten! Färbung und Durchmusterung von Dickem Tropfen und Ausstrich benötigen daher im Labor mindestens 2 Stunden! Fragen: - Wie wird Malaria übertragen? Die Übertragung der Erkrankung erfolgt über die weibliche Form der Anophelesmücke - Was sind typische Symptome? Schüttelfrost, heftige Fieberschübe, die bei Malaria tropica keinen festen Rhythmus haben, starke Kopf und Rückenschmerzen, Schwindel und abdominale Schmerzen Die Malaria tertiana hat ihren Namen von den regelmäßig alle drei Tage auftretenden Fieberschüben, so wie bei der seltenen Malaria quartana die Fieberschübe alle vier Tage auftreten P PHYWE Systeme GmbH & Co. KG All rights reserved 5

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7 Malaria TEAS Protokoll Sie können Ihre Beobachtungen und Ergebnisse hier notieren: Fragen - Wie wird Malaria übertragen? - Was sind typische Symptome? P PHYWE Systeme GmbH & Co. KG All rights reserved 7

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