Dünnschichtchromatographie

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1 PB III/Seminar DC Dünnschichtchromatographie Dr. Johanna Liebl

2 Chromatographie - Prinzip physikalisch-chemische Trennmethoden Prinzip: Verteilung von Substanzen zwischen einer ruhenden (stationären) und einer sich an dieser vorbeibewegenden (mobilen) Phase. diese Phasen sind nicht miteinander mischbar Trennmechanismen: - Adsorption - Verteilung - Siebwirkung - Ionenaustausch - Bioaffinität

3 Dünnschichtchromatographie (DC) Def.: Trennung von Vielstoffgemischen mit Hilfe einer festen stationären Dünnschichtphase, an der eine flüssige mobile Phase vorbeigeführt wird. inneres Chromatogramm Trennung beruht auf den phys.-chem. Vorgängen der: Adsorption (Feststoff als stationäre Phase) und Verteilung (Flüssigkeit als stationäre Phase) Bei der Trennung an Kieselgel mit unpolaren Fließmitteln überwiegt die Adsorption.

4 Adsorption Anreicherung eines gelösten Stoffes an der Oberfläche eines Feststoffes. Konkurrenz der Probenmoleküle mit der mobilen Phase um die Besetzung der aktiven Stellen der stationären Phase. Mögl. Wechselwirkungen zwischen den Phasen (Bsp.) - Wasserstoffbrückenbindungen - Dipol-Dipol-Wechselwirkungen - van der Waals`sche Kräfte reversibel, Desorption

5 Adsorption Adsorptionsisotherme (T = const.) Verteilungskoeffizient: K = C s C m gilt nur für die jeweilige Sorbens/Fließmittel Kombination!! C s = Konzentration von Stoff X in der stationären Phase C m = Konzentration von Stoff X in der mobilen Phase C oo = Sättigungskonzentration der stationären Phase

6 Adsorptionsisotherme Je größer die Unterschiede zwischen den Adsorptions-, bzw. Verteilungskoeffizienten der Substanzen sind, desto besser lassen sie sich trennen!

7 Sorbentien Sorbentien werden auf einen Träger (z.b. Alufolie, Glasplatte) aufgetragen Schichtdicke zwischen 0,2 mm (analytische DC) und 1-2 mm (präparative DC) Aluminiumoxid Cellulose Polyamid Kieselgel O O O Si Si OH OH R N H R chemisch modifiziertes (silanisiertes) Kieselgel (Reversed Phase DC) 2 R R R Si Cl CH 3 OH + Si Cl CH 3 -HCl Si Si O O Si CH 3 CH 3

8 Aktivität eines Sorbens Wichtiges Kriterium für die Trennleistung Menge der angelagerten Substanzen und Festigkeit der Bindung sind abhängig von der Stärke und der Zahl der aktiven Zentren Höhere Aktivität Stärkeres Rückhaltevermögen Geringere Laufstrecken Verringerung der Zahl der aktiven Zentren durch Desaktivatoren, z.b. durch H 2 O (Luftfeuchtigkeit) Kennzeichnung von Kieselgel-Fertigplatten G: 13% Gipszusatz H: ohne Bindemittel F 254 : Zusatz eines Fluoreszenzindikators Zahl vor G oder H: Porendurchmesser in Angström (meist 60)

9 Fließmittel Verschiedene Fließmittel führen bei derselben Substanz zu unterschiedlichen Laufstrecken. Bsp: Die Laufstrecke polarer Substanzen auf polaren Sorbentien nimmt mit steigender Polarität des Fließmittels zu. Die Eluotrope Reihe: Empirische Ermittlung der Elutionskraft verschiedener Fließmittel für ein bestimmtes Sorbens. Die Elutionskraft kann auch als Zahlenwert (E 0 ) angegeben werden. Pentan ist dabei Bezugspunkt (E o = 0) Bsp: Chloroform E o = 0,4 Methanol E o = 0,95

10 Fließmittelgemische Höhere Trennschärfe durch Einstellen der Elutionskraft, bzw. des Verteilungskoeffizienten Es kann beim Aufsteigen zur Adsorption einzelner Bestandteile des Fließmittels an das Sorbens kommen: Veränderung der Zusammensetzung der mobilen Phase während des chromatographischen Prozesses Bei vollständiger Adsorption einer Komponente Ausbildung einer ß-Front Substanzen reichern sich oft als charakteristische bandförmige Flecke im Bereich der ß-Front an. Die Wahl des richtigen Fließmittels ist Erfahrungssache oder muss durch ausprobieren ermittelt werden!

11 Kammersättigung Kammersättigung: Sättigung des Kammerraumes oberhalb der Flüssigkeit mit Lösungsmitteldämpfen Folge: Gleichgewicht zwischen den Lösungsmitteldämpfen und der mobilen Phase auf der Platte während der Entwicklung. Erhöhung der Fließgeschwindigkeit durch Vorbeladen der Schicht mit Fließmittel bessere Reproduzierbarkeit der Trennergebnisse

12 Bei Verzicht auf Kammersättigung verdampft während der Trennung v.a. im Bereich der Laufmittelfront ständig Fließmittel von der Platte Es wird mehr Laufmittel für eine bestimmte Strecke benötigt. Die Laufstrecken für die einzelnen Substanzen werden länger. Fließmittelgemische leichter flüchtige Komponenten verdampfen schneller veränderte Zusammensetzung der mobilen Phase

13 Detektion a) Detektion farbiger Substanzen bei Tageslicht b) UV- Licht 365 nm -> Eigenfluoreszenz Flavonoide: je nach Struktur gelbe, grüne oder blaue Fluoreszenz c) UV- Licht 254 nm -> Fluoreszenzlöschung auf F 254 Platten Flavonoide d) Sprühreagenzien universell spezifisch, z.b. Vanilin-Schwefelsäure, Dragendorffs Reagens

14 Auswertung über R f -Wert R f = Abstand Substanzfleck-Startlinie Abstand Fließmittelfront-Startlinie R f -Werte abhängig von äußeren Bedingungen, z.b.: - Aktivität des Sorbens - Rel. Luftfeuchtigkeit -Temperatur - Kammersättigung Verwendung von Vergleichssubstanzen

15 Vorbereitung der DC Platte 20 cm 20 cm

16 Vorbereitung der DC Platte 20 cm 10 cm 20 cm 10 cm Platte sinnvoll einteilen!

17 Vorbereitung der DC Platte 1,5 cm Abstand halten!

18 Vorbereitung der DC Platte

19 Vorbereitung der DC Platte Proben bandenförmig auftragen stationäre Phase nicht beschädigen Trocknen lassen

20 Entwicklung KEIN Filterpapier! Auftragebereich nicht in Fließmittel eintauchen! Kammer nicht öffnen! Fließmittel nicht aufheben!

21 Detektion Platte nicht tropfnass sprühen oder zu heiß fönen!

22 Viel Erfolg im Praktikum!

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