Elektronenmikroskopie. Institut für Veterinär-Anatomie Freie Universität Berlin Prof Dr. Johanna Plendl und Sophie Hansen

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Käte Schuster
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1 Elektronenmikroskopie Institut für Veterinär-Anatomie Freie Universität Berlin Prof Dr. Johanna Plendl und Sophie Hansen

2 Transmissionselektronenmikroskopie Leuchtschirm Strahlenquelle Kondensor Objektiv Präparatebene Projektiv Mittels einer stromdurchflossenen Kathode wird ein Elektronenstrahl erzeugt, der durch eine an der Anode angelegte Hochspannung angesaugt wird und dabei das zu untersuchende Objekt durchdringt. Die angelegte Beschleunigungsspannung bestimmt dabei das Auflösungsvermögen des Mikroskops, bei biologischen Objekten ist eine Auflösung bis zu 1 nm erreichbar. Je höher die Spannung (zwischen kv) ist, desto größer ist auch die Auflösung. Der Elektronenstrahl wird wie in der Lichtmikroskopie gebündelt, anstelle optischer Linsen kommen hierfür stromdurchflossenen Spulen zum Einsatz, welche ein elektromagnetisches Feld erzeugen. Beim Durchtritt durch das Präparat werden die Elektronen abhängig von der Elektronendichte der Atome im Präparat abgelenkt. Da biologische Objekte meist aus Atomen niedriger Ordnungszahl bestehen (C, O, N, H) ist die Ablenkung und somit der Kontrast gering. Aus diesem Grund müssen die Präparate zunächst mit Kontrastmitteln behandelt werden, um etwas erkennen zu können (s. Präparationstechniken). Hierfür werden Schwermetalle (mit hohen Ordnungszahlen) eingesetzt. Die Schichtdicke der Präparate sollte 100 nm nicht überschreiten. Nach Durchtritt durch das Präparat werden die gestreuten Elektronen durch ein Linsensystem (Projektiv) vergrößert und auf einen fluoreszierenden Schirm oder einen Photofilm gelenkt. Die elektronenmikroskopischen Bilder sind stets schwarzweiß, der Schwärzungsgrad zeigt den Grad der Elektronenabsorption an.

3 Geschichte der Elektronenmikroskopie Kapillare Tumor im Rechts: Semidünnschnitt Links: Elektronenmikros kopisches Bild, Lymphozyt und Erythrozyt im Lumen Den Prototyp bauten M. KNOLL und E. RUSKA (Technische Universität Berlin, 1932). Eines der ersten elektronen-mikroskopischen Bilder eines biologischen Objekts war die Darstellung des Tabakmosaikvirus (TMV); das erste elektronenmikroskopische Bild einer Zelle wurde 1945 von K. R. PORTER, A. CLAUDE und E. F. FULLAM (Rockefeller Institute, New York) veröffentlicht.

4 Präparationstechniken Erster Schritt bei der Präparation von Proben für die Elektronenmikroskopie ist die Fixierung. Hierfür werden Glutaraldehyd zur Fixierung der Proteinstrukturen und Osmiumtetroxid zur Festigung der Lipidmembranen eingesetzt. Nach einer ausreichenden Fixierung müssen die Präparate entwässert werden. Zu diesem Zweck werden sie in einer aufsteigenden Alkoholreihe (30%, 50%, 70%, 90%, 100% Ethanol, 100 % Propylenoxid) dehydriert. In unserer Arbeitsgruppe werden nicht nur Gewebe und Organe sondern als Spezialmethode - auch in vitro kultivierte Zellen elektronenmikroskopisch untersucht. Die Zellen einer Zellkultur werden nach der Fixierung vorsichtig vom Kulturschalenboden abgeschabt, eine Zellsuspension in einem Puffer wird hergestellt.

5 Präparationstechniken Schließlich werden die Proben in Kunstharz (meist Epon) eingebettet, damit im Vakuum des Elektronenmikroskops die zellulären Strukturen nicht kollabieren. Die Proben werden hierfür in flüssigen Kunststoff eingebettet und dieser für 48h bei 60 C polymerisiert, bis er ausreichend fest ist. Die dadurch erhaltenen Blöckchen müssen nun eingeschnitten werden. Hierfür werden spezielle Schneidegeräte, Ultramikrotome, benötigt, mit denen sich eine Schichtdicke von nur nm erzielen lässt. Hierbei werden Glas- oder Diamantmesser zum Schneiden eingesetzt, da deren Bruchkanten viel schärfer als Metallklingen sind, sich jedoch deutlich schneller abnutzen. Alternativ finden auch Diamantmesser Einsatz, die deutlich länger halten aber auch sehr viel teurer sind.

6 Präparationstechniken Der Ultradünnschnitt wird auf einem kleinen Kupfer- oder Nickelnetz, dem so genannten Grid, aufgefangen. Diese Netze, die mit einem speziellen Kunststoff überzogen sind, ersetzen die Glasobjekt-träger aus der Lichtmikroskopie. Von geeigneten Probenblöckchen werden mit einem Diamantmesser Ultradünnschnitte angefertigt und auf kleinen Kupfergrids aufgefangen. Nun muss das Präparat noch kontrastiert werden Schwermetallionen wie Bleicitrat und Uranylacetat verwendet. Diese werden unterschiedlich stark von dem Objekt absorbiert, so dass sie als unterschiedlich intensiv markierte Strukturen erscheinen.

7 Elektronenmikroskopische Bilder Endothelzellen in vitro. Mittels Elektronenmikroskopie lässt sich beweisen, dass die Zellen in vitro dreidimensionale kapillarähnliche Strukturen mit internem Lumen bilden. Oben: Semidünnschnitt Unten: Elektronenmikroskopisches Bild

8 Elektronenmikroskopische Bilder Endothelzellen aus dem Ovar eines Rindes in vitro Mittels Elektronenmikroskopie lässt sich beweisen, dass die Zellen in vitro dreidimensionale kapillarähnliche Strukturen mit internem Lumen bilden. Unten: Elektronenmikroskopisches Bild Links: Semidünnschnitt

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