PLATELIA Parvovirus B19 IgG. Enzymimmunoassay zum qualitativen Nachweis von Parvovirus B19 IgG-Antikörpern in Humanserum oder plasma

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1 PLATELIA Parvovirus B19 IgG Enzymimmunoassay zum qualitativen Nachweis von Parvovirus B19 IgG-Antikörpern in Humanserum oder plasma

2 Inhaltsverzeichnis 1- VERWENDUNGSZWECK ZUSAMMENFASSUNG UND ERLÄUTERUNG DES TESTS TESTPRINZIP REAGENZIEN WARNHINWEISE UND VORSICHTSMASSNAHMEN PROBEN ERFORDERLICHES MATERIAL GEBRAUCHSANWEISUNG QUALITÄTSKONTROLLE ERGEBNISINTERPRETATION GRENZEN DES VERFAHRENS LEISTUNGSMERKMALE LITERATUR... 50

3 1- VERWENDUNGSZWECK Der Platelia Parvovirus B19 IgG-Assay ist ein ELISA-Immunoassay zum qualitativen Nachweis von IgG-Antikörpern gegen Parvovirus B19 (PVB19) in Humanserum oder -plasma. Der Test ist zur Absicherung der Diagnose einer Infektion mit Parvovirus B19 und in Verbindung mit der klinischen Patientenanamnese zu verwenden. 2- ZUSAMMENFASSUNG UND ERLÄUTERUNG DES TESTS Parvovirus B19 (PVB19) ist das einzige Virus aus der Familie der Parvoviridae, das für den Menschen infektiös ist. Es handelt sich um ein kleines, ikosaedrisches einzelsträngiges DNA- Virus, das ohne Hülle in einer Kapsel verpackt ist. Das B19-Genom kodiert insbesondere zwei Proteine der Kapsidstruktur, VP1 (83 kda) und VP2 (53 kda), sowie ein Nicht-Strukturprotein, NS-1, das für die Virusreplikation und Vermehrung in der Zelle benötigt wird. Parvovirus B19 ist ubiquitär und weltweit endemisch. Die Seroprävalenz liegt bei Kindern unter 5 Jahren bei 2-10 % und bei Erwachsenen bei %. Die Ausbreitung erfolgt hauptsächlich durch Tröpfcheninfektion, gelegentlich aber auch durch Transfusion und durch Übertragung des Virus von infizierten Schwangeren während der Schwangerschaft auf das Kind. Beim Menschen infiziert das Virus vorzugsweise erythropoietische Vorstufen im Knochenmark und Blut und verursacht eine Zelllyse. Je nach dem Status der immunologischen Kompetenz kann sich daraus eine mehr oder weniger schwere Anämie ergeben. Infektionen mit Parvovirus B19 sind häufig und in der Regel mit leichten Symptomen verbunden. Das Virus gilt als Erreger der Ringelröteln (der fünften Krankheit) bei Kindern bzw. komplizierterer Symptome wie etwa einer akuten Arthropathie oder verschiedener Formen von Arthritis bei Erwachsenen. In speziellen Bevölkerungsgruppen kann eine Infektion mit Parvovirus B19 auch eine schwere Anämie hervorrufen, beispielsweise eine transitorische aplastische Krise (TAC) bei Patienten mit vorhandenen hämolytischen Störungen, chronisches Knochenmarkversagen und Anämie bei immungeschwächten Patienten und/oder Hydrops fetalis bei Übertragung auf den Fötus durch die Plazentaschranke. Eine Infektion während der Schwangerschaft kann zu einem Spontanabort führen. Der Nachweis von IgG und IgM gegen Parvovirus B19 ist besonders geeignet, um den Immunstatus von Risikopatienten mit untypischem klinischem Bild und vermuteter akuter oder kürzlich erfolgter Infektion und insbesondere von Schwangeren zu bestimmen, damit schwer wiegende Komplikationen des Fötus bei vermuteter Infektion mit Parvovirus B19 vermieden werden können. 51

4 3- TESTPRINZIP Der Platelia Parvovirus B19 IgG-Assay ist ein indirekter ELISA-Test zum Nachweis von IgG-Antikörpern gegen Parvovirus B19 (PVB19) in Humanserum oder -plasma. Der Test verwendet Bakulovirus-produziertes rekombinantes Virusantigen zur Beschichtung der Mikrotiterplatte. Nach Zugabe der Probe binden ggf. vorhandene spezifische IgG-Antikörper gegen PVB19 an das Parvovirus- Antigen, mit dem die Testkavitäten beschichtet sind. Im Anschluss an einen Waschschritt wird Peroxidase-markierter -Anti-Human-IgG Antikörper (Ziege) zugegeben, der an die vorhandenen humanen IgG-Antikörper gegen Parvovirus B19 bindet. Überschüssiges markiertes Anti-Human-IgG wird nach einem zweiten Waschschritt eliminiert. Der Nachweis des Komplexes erfolgt durch Zugabe von Tetramethylbenzidin-Substrat (TMB), das in Gegenwart von Peroxidase eine blaue Farbe annimmt. Die Zugabe von Stopp-Reagenz ergibt ein stabiles gelbes Endprodukt. 52

5 4- REAGENZIEN Die mitgelieferten Reagenzien reichen aus für 96 Tests in maximal 6 Testreihen. Alle Reagenzien sind ausschließlich für die in-vitro-diagnostik bestimmt. 1. Beschreibung Beschriftung auf dem Etikett Beschreibung R1 Microplate Mikrotiterplatte 12 x 8 Kavitäten, beschichtet mit gereinigtem humanem rekombinantem Parvovirus-B19- Antigen R2 Concentrated Konzentrierte Waschlösung (10fach) Washing Phosphatpuffer mit Tween 20 Solution (10x) Darreichungsform /Herstellung 1 Gebrauchsfertig 1 x 100 ml Zum Verdünnen R3 Negative Control Negativkontrolle Negatives Humanplasma (kein IgG gegen Parvovirus B19), Rinderserumalbumin. Konservierungsmittel: Natriumazid (0,08 Gew./Vol.-%) 1 x 2 ml Gebrauchsfertig R4 Calibrator Kalibrator Positives Humanplasma (IgG gegen Parvovirus B19), Rinderserumalbumin. Konservierungsmittel: Natriumazid (0,08 Gew./Vol.-%) R5 Positive control Positivkontrolle Positives Humanplasma (IgG gegen Parvovirus B19), Rinderserumalbumin. Konservierungsmittel: Natriumazid (0,08 Gew./Vol.-%) R6 Conjugate Konjugat Polyklonale Anti-Human-IgG- Antikörper (Ziege), Peroxidase-markiert, Rinderserumalbumin. R7 Diluent Verdünnungsmittel für Proben Phosphatpuffer, Rinderserumalbumin 1 x 2 ml Gebrauchsfertig 1 x 2 ml Gebrauchsfertig 1 x 16 ml Gebrauchsfertig 4 x 60 ml Gebrauchsfertig R9 Chromogen TMB Chromogen TMB Tetramethylbenzidin (<0.02%), H 2O 2 (<1%) 1 x 16 ml Gebrauchsfertig R10 Stopping Solution Stopp-Lösung 0,6 N Schwefelsäurelösung 1 x 16 ml Gebrauchsfertig 53

6 2. Lagerung Das Kit bei +2-8 C lagern. Bei dieser Lagertemperatur können alle Kitkomponenten bis zu dem auf der Packung angegebenen Verfallsdatum verwendet werden (es sei denn, es liegen anders lautende spezifische Anweisungen vor). Kennung R1 R2 R3, R4, R5 R7 R6 R9, R10 Aufbewahrung In einem verschlossenen Beutel 4 Wochen bei +2-8 C (auf Vorhandensein von Trocknungsmittel überprüfen). Vor dem Verdünnen: Ohne Verunreinigungen bis zu dem auf der Packung angegebenen Verfallsdatum bei +2-8 C. Nach dem Verdünnen: 24 Std. bei +2-8 C. Nach dem Öffnen: Ohne Verunreinigungen bis zu dem auf der Packung angegebenen Verfallsdatum bei 2-8 C. Nach dem Öffnen: Ohne Verunreinigungen bis zu dem auf der Packung angegebenen Verfallsdatum bei 2-8 C. Nach dem Öffnen: Ohne Verunreinigungen bis zu dem auf der Packung angegebenen Verfallsdatum bei 2-8 C. Nach dem Öffnen: Ohne Verunreinigungen bis zu dem auf der Packung angegebenen Verfallsdatum bei 2-8 C. 5- WARNHINWEISE UND VORSICHTSMASSNAHMEN In-vitro-Diagnostikum Darf nur von qualifiziertem Fachpersonal durchgeführt werden. 1. Hygiene- und Sicherheitsvorschriften Beim Umgang mit Reagenzien und Patientenproben Einweghandschuhe, Laborkittel und Schutzbrille tragen. Nicht mit dem Mund pipettieren. Während der Handhabung der Proben und der Testdurchführung nicht essen, trinken oder rauchen. Die Negativkontrolle (R3), und die Positivkontrolle (R5) und der Kalibrator (R4) sind aus Humanplasma hergestellt, das auf HBsAg und Antikörper gegen HIV-1, HIV-2 und HCV getestet wurde und sich als nicht-reaktiv erwiesen hat. Dennoch sollten alle Reagenzien als infektiös behandelt werden. Alle Tests sind nach dem Infektionsschutzgesetz der USamerikanischen Occupational Safety and Health Administration (OSHA Standard on Bloodborne Pathogens), Biosicherheitsstufe 2, oder einer anderen geeigneten Vorgehensweise zur Gewährleistung der Biosicherheit durchzuführen. 54

7 Alle Materialien einschließlich der Waschlösung, die mit Proben und Reagenzien, die Humanmaterial enthalten, in Berührung kommen, sollten als potentiell infektiös betrachtet werden. Nach Möglichkeit Proben oder probehaltige Lösungen nicht verschütten. Spritzer müssen mit 10%iger Bleichelösung abgespült werden. Bei verschütteter Säure muss diese zuerst mit Natriumbicarbonat neutralisiert und anschließend mit 10%iger Bleichelösung, 70%igem Ethanol oder 0,5%igem Wescodyne Plus abgespült und die Stelle mit Saugpapier getrocknet werden. Das für die Reinigung verwendete Material muss in einem Behälter für kontaminierte Rückstände entsorgt werden. Die Patientenproben und Reagenzien humanen Ursprungs sowie kontaminierte Materialien und Produkte dürfen nur nach einer Dekontaminierung entsorgt werden: - entweder durch Eintauchen in Bleiche mit einer Natriumhypochlorit- Endkonzentration von 5% für die Dauer von 30 Minuten - oder durch Autoklavieren bei 121 C über mindestens 20 Minuten. Natriumhypochlorit-haltige Lösungen nicht in den Autoklaven stellen. Vorsicht: Die Kontrollen und der Kalibrator enthalten Natriumazid, das mit Blei und Kupfer in Abflussleitungen unter Bildung hoch explosiver Ablagerungen von Metallaziden reagieren kann; zur Entsorgung mit großen Mengen Wasser verdünnen. Das Sicherheitsdatenblatt ist auf 2. Vorsichtsmaßnahmen für Benutzer Vorbereitung Die Zuverlässigkeit der Ergebnisse hängt von der Einhaltung folgender GLP- Richtlinien ab: Die Reagenzien nicht über das Verfallsdatum hinaus verwenden. Keine Reagenzien aus unterschiedlichen Chargen in einem Testansatz vermischen oder miteinander verwenden. Verarbeitung Die Reagenzien unter den empfohlenen Bedingungen aufbewahren. Die Reagenzien nicht einfrieren. Alle Reagenzien vor Gebrauch mindestens 30 Min. auf Raumtemperatur ( C) bringen. Reagenzien vorsichtig auflösen oder verdünnen und jegliche Kontamination vermeiden. Kontrollen und Kalibratoren bei jedem Lauf mitführen. 55

8 Den Test nicht durchführen, wenn Staub oder reaktive Dämpfe (saure, alkalische, Aldehyd-Dämpfe) vorhanden sind, die zu Veränderungen der Enzymaktivität des Konjugats führen können. Glasware, die gründlich gewaschen und mit entionisiertem Wasser gespült wurde, oder vorzugsweise Einwegmaterial verwenden. Darauf achten, dass weder Proben noch Konjugat beim Pipettieren an den Wänden der Kavitäten hängenbleiben. Das Waschen der Mikrotiterplatte ist ein wesentlicher Arbeitsgang. Die vorgeschriebene Zahl der Waschzyklen ist unbedingt einzuhalten. Weiterhin ist darauf zu achten, dass alle Vertiefungen vollständig gefüllt und danach wieder vollständig geleert werden. Nicht korrekt durchgeführte Waschgänge können zu fehlerhaften Ergebnissen führen. Die Mikrotiterplatte zwischen dem Ende der Waschgänge und dem Pipettieren der Reagenzien nicht austrocknen lassen. Zum Pipettieren des Konjugats und des Chromogens TMB nie dasselbe Gefäß verwenden. Die enzymatische Reaktion weist gegenüber Metallen oder Metallionen eine hohe Sensitivität auf. Folglich dürfen die verschiedenen Konjugatund TMB-Chromogenlösungen nicht mit Metallen in Berührung kommen. Die Chromogenlösung TMB (R9) sollte farblos oder hellgelb sein. Ist eine Blaufärbung sichtbar, darf das Reagenz nicht verwendet und muss ersetzt werden. Nach dem Stoppen der Reaktion kann sich in Kavitäten mit starker Farbentwicklung im Lauf der Zeit ein schwarzer Niederschlag bilden. Für jede neue Probe die Pipettenspitze wechseln. Pipetten und Geräte auf Genauigkeit und korrekte Funktion prüfen. 6- PROBEN Als Probenmaterial wird Serum oder Plasma (Heparin, EDTA und Citrat) empfohlen. Folgende Empfehlungen für die Handhabung, Vorbereitung und Lagerung der Blutproben beachten: Alle Blutproben unter Beachtung der üblichen Vorsichtsmaßnahmen für Venenpunktion entnehmen. Nach dem Zentrifugieren Serum oder Plasma vom Blutkuchen bzw. den Erythrozyten trennen und in einem fest verschlossenen Röhrchen aufbewahren. Wenn der Test nicht innerhalb der nächsten 8 Stunden durchgeführt wird, kann das Serum oder Plasma bis zu 7 Tage lang bei 2-8 C aufbewahrt werden. 56

9 Wird der Test nicht innerhalb von 7 Tagen durchgeführt, sind die Proben nach Erhalt sofort bei mind. -20 C einzufrieren. Keine Proben verwenden, die mehr als dreimal eingefroren und wieder aufgetaut wurden. Zuvor tiefgefrorene Proben sollten nach dem Auftauen und vor der Analyse gründlich gemischt werden (Vortex). Verdünnte Proben dürfen nicht eingefroren werden. Zur Testwiederholung einen neuen Testansatz verwenden. Proben, die 30 mg/dl unkonjugiertes Bilirubin enthalten, und hämolysierte Proben mit bis zu 500 mg/dl Hämoglobin sollten keine Auswirkungen auf das Ergebnis haben. Proben nicht erhitzen. 7- ERFORDERLICHES MATERIAL 1. Geliefertes Material Siehe Abschnitt 4, REAGENZIEN 2. Zusätzlich benötigtes Material Rührgerät Typ Vortex. Mikrotiterplatten-Lesegerät, mit 450 nm- und 620 nm-filtern ausgestattet (*). Schüttler zum Mischen von Mikrotiterplatten. Automatisches, halbautomatisches oder manuelles Mikrotiterplatten- Waschsystem (*). Destilliertes oder entionisiertes Wasser. Einweghandschuhe. Schutzbrille. Saugfähige Papiertücher Automatische oder halbautomatische Pipetten oder Multipipetten, einstellbar oder voreingestellt, zum Abmessen und Verteilen von 10 µl bis 1000 µl und 5 und 10 ml. Messzylinder für 25 ml, 50 ml, 100 ml und 1000 ml. Natriumhypochlorit und Natriumbicarbonat. Behälter für infektiösen Abfall. Einwegröhrchen. Deckel oder Klebefolie zum Abdecken der Mikrotiterplatten. (*) Wenden Sie sich an unseren Kundendienst für detaillierte Informationen zu der empfohlenen Ausstattung. 57

10 8- GEBRAUCHSANWEISUNG Vorbereitung der Reagenzien R1: Vor dem Öffnen den Beutel 30 Minuten lang bei Raumtemperatur ( C) aufbewahren. Den Trägereinsatz herausnehmen. Unbenutzte Streifen auf der Plattenhalterung sofort wieder in den Beutel geben und auf Vorhandensein von Trocknungsmittel achten. Den Beutel wieder sorgfältig verschließen und bei +2-8 C lagern. R2: Waschlösung (R2) im Verhältnis 1:10 mit destilliertem Wasser verdünnen. Um die gebrauchsfertige Waschlösung herzustellen, zum Beispiel 100 ml R2 mit 900 ml destilliertem Wasser verdünnen. Wenn manuell gewaschen wird, 160 ml verdünnte Waschlösung für eine Platte mit 12 Streifen vorbereiten. Alle Reagenzien sind gebrauchsfertig. 2. Probenvorbereitung Als Probenmaterial wird in Trockenröhrchen abgenommenes Serum oder Plasma (Heparin, EDTA und Citrat) empfohlen. Folgende Empfehlungen für die Handhabung, Vorbereitung und Lagerung der Blutproben beachten: Bei der Entnahme aller Serumproben die routinemäßigen Vorsichtsmaßnahmen beachten. Proben vor dem Zentrifugieren vollständig gerinnen lassen. Probenröhrchen stets verschlossen halten. Nach der Zentrifugation das Serum trennen und in einem fest verschlossenen Aufbewahrungsröhrchen lagern. 3. Vorgehensweise Die vorliegende Beschreibung und die GLP-Richtlinien sind strikt zu befolgen. Die Reagenzien vor der Verwendung auf Raumtemperatur ( C) bringen. Zur Validierung der Testergebnisse und zur Berechnung des Grenzwerts alle Kontrollen in jedem Testansatz mitführen. 1. Probenverteilung und Identifikationsplan für Kontrollen und Patientenproben sorgfältig festlegen. 2. Die verdünnte Waschlösung (R2) vorbereiten [siehe Abschnitt 8.1]. 3. Den Trägereinsatz und die Streifen (R1) aus der Schutzhülle nehmen [siehe Abschnitt 8.1]. 4. Alle Proben und Kontrollen sowie der Kalibrator müssen vor der Verwendung auf dem Vortex gemischt werden. Alle Testproben 1:201 verdünnen (z. B. durch Zugabe von 10 µl Probe zu 2 ml Verdünnungsmittel (R7)). Kontrollen und Kalibrator nicht verdünnen.

11 Die verdünnten Proben gründlich mischen. 5. Die nachstehend angegebene Reihenfolge streng einhalten und in jede Kavität 100 µl Negativkontrolle (R3), Kalibrator (R4) in Doppelbestimmung, Positivkontrolle (R5) und verdünnte Proben pipettieren. Eine Kavität für den Reagenzleerwert frei halten Leerwert A S4 B R3 S5 C R4 S6 D R4 S7 E R5 S8 F S1 S9 G S2 S10 H S3 S11 6. Den Inhalt in den Kavitäten mischen, indem die Platte mehrere Sekunden lang auf einem Schüttler für Mikrotiterplatten plaziert wird. Die Mikrotiterplatte mit einem Mikrotiterplattendeckel verschließen oder mit Verpackungsfolie abdecken. Die Mikrotiterplatte 1 Stunde ± 5 Min. bei Raumtemperatur (18-30 C) inkubieren. 7. Nach Beendigung der ersten Inkubationsphase den Deckel bzw. die Verpackungsfolie entfernen. Den Inhalt aller Vertiefungen in einen Behälter für infektiöse Abfälle (mit Natriumhypochlorit) absaugen. Die Mikrotiterplatte 3 Mal mit 200 µl verdünnte Waschlösung (R2) pro Kavität waschen. Die Mikrotiterplatte umdrehen und vorsichtig auf Saugpapier ausklopfen, um die verbleibende Flüssigkeit zu entfernen. 8. Sofort in alle Kavitäten, außer in die Leerwert-Kavität, 100 µl Konjugat (R6) pipettieren. 9. Den Inhalt in den Kavitäten mischen, indem die Platte mehrere Sekunden lang auf einem Schüttler für Mikrotiterplatten plaziert wird. Die Mikrotiterplatte mit einem Mikrotiterplattendeckel verschließen oder mit Verpackungsfolie abdecken. Die Mikrotiterplatte 1 Stunde ± 5 Min. bei Raumtemperatur (18-30 C) inkubieren. 10. Nach Beendigung der Inkubationsphase den Deckel bzw. die Verpackungsfolie entfernen. Den Inhalt aller Vertiefungen in einen Behälter für infektiöse Abfälle (mit Natriumhypochlorit) absaugen. Die Mikrotiterplatte 5 Mal mit 200 µl verdünnte Waschlösung (R2) pro Kavität waschen. Die Mikrotiterplatte umdrehen und vorsichtig auf Saugpapier ausklopfen, um die verbleibende Flüssigkeit zu entfernen. 59

12 11. Sofort und vor Licht geschützt 100 µl Chromogen TMB (R9) in jede Kavität, einschließlich der Leerwertkavität, pipettieren. Die Platte lichtgeschützt bei Raumtemperatur ( C) 30 ± 5 Minuten stehen lassen. Die Mikrotiterplatte mit einem Mikrotiterplattendeckel verschließen oder mit Verpackungsfolie abdecken. Während dieser Inkubation keine Klebefolie verwenden. 12. Die enzymatische Reaktion durch Zugabe von 100 µl Stopplösung (R10) in jede Vertiefung, einschließlich der Leerwertkavität, stoppen. In der gleichen Reihenfolge und im gleichen Zeitrahmen wie die Chromogen TMB lösung verteilen. 13. Den Boden der Platte sorgfältig abwischen. Innerhalb von 30 Minuten nach Stoppen der Reaktion die Extinktion mit einem Plattenleser bei 450/620 nm ablesen. Die Nullabsorption des Geräts gegen den Leerwert abgleichen. Die Streifen müssen vor dem Ablesen stets lichtgeschützt aufbewahrt werden. 14. Vor dem Weiterleiten alle Ergebnisse die Übereinstimmung der Probenverteilung mit der Plattenbelegung überprüfen 9- QUALITÄTSKONTROLLE Alle von der Firma Bio-Rad hergestellten Reagenzien unterliegen einem Qualitätssicherungssystem vom Rohstoffeingang bis zur Vermarktung der Fertigprodukte. Jede Fertigproduktcharge wird einer Qualitätskontrolle unterzogen und nur dann verkauft, wenn sie den Freigabekriterien entspricht. Die Unterlagen bezüglich Herstellung und Kontrolle der einzelnen Chargen werden bei Bio-Rad aufbewahrt. 10- ERGEBNISINTERPRETATION In den folgenden Abschnitten steht OD für die Extinktion jeder Kontrolle, jedes Kalibrators und jeder Probe, von der die Leerwertabsorption subtrahiert wurde. 1. Berechnung des Grenzwerts (GW) Der GW wird berechnet als: Mittlere OD (R4) Der GW wird für die Interpretation und Berechnung des Index verwendet. Der Index ist die OD des Probenergebnisses (OD. P) gegenüber dem GW: Index = OD P/GW 2. Kriterien für die Testvalidierung Extinktionswerte und Verhältnis: 0,100 OD R4 0,600 OD R3 / GW < 0,600 OD R5 / GW >1,500 OD (R4 max) / OD (R4 min) < 2 60

13 Werden diese Validierungskriterien nicht erfüllt, so ist der Test zu wiederholen. 3. Auswertung der Ergebnisse Das Vorhandensein oder Nichtvorhandensein von IgG-Antikörpern gegen Parvovirus B19 in der Testprobe wird durch den Vergleich der Extinktion (Optische Dichte, OD) des Serums mit dem Grenzwert bestimmt. Index Resultat Index < 0,80 Negativ 0,80 Index < 1,00 Nicht eindeutig Index 1,00 Positiv Bei Ergebnissen aus dem Grauzonenbereich müssen andere Aspelte der Diagnose berücksichtigt werden. Bei einem nicht eindeutigen Ergebnis wird empfohlen, 1-2 Wochen später eine frisch gewonnene Probe erneut zu testen. Es sollten andere Methoden erwogen und die sonstigen klinischen Symptome einbezogen werden. Vorsicht : Proben mit einer OD<0 sind nicht zu interpretieren und sollten wiederholt werden. ANMERKUNG:: Es wird empfohlen, Tests zum Nachweis von IgG- und IgM-Antikörpern zur gleichen Zeit durchzuführen, um das Stadium der Infektion besser identifizieren zu können. Bei dem Patienten liegt vermutlich keine Infektion mit humanem Parvovirus B19 vor, wenn sowohl das IgG- als auch das IgM-Ergebnis negativ ist. Bei dem Patienten liegt vermutlich eine kürzlich erfolgte Infektion mit Parvovirus B19 vor, wenn das IgM-Ergebnis positiv ist, unabhängig von IgG-Ergebnis. Bei dem Patienten liegt vermutlich eine in der Vergangenheit erfolgte Infektion mit Parvovirus B19 vor, wenn das IgG-Ergebnis positiv und das IgM-Ergebnis negativ ist. 11- GRENZEN DES VERFAHRENS Die Diagnose einer Parvovirus B19-Infektion kann nur auf Basis einer Kombination von klinischen und biologischen Daten gestellt werden. 1. Die Verwendung des Platelia Parvovirus B19 IgG-Assays wurde mit nur mit Humanserum- und -plasmaproben validiert. 2. Eine Probe aus einem Frühstadium der Infektion wird unter Umständen negativ getestet. 3. Mit einer einzelnen Blutprobe kann nicht festgestellt werden, ob es sich um eine kürzlich erfolgte Infektion handelt oder nicht. Es ist vielmehr ein Probenpaar zu testen. 61

14 4. Die Diagnose einer Parvovirus B19-Infektion sollte auf Basis einer Kombination der Ergebnisse im Platelia Parvovirus B19 IgG-Assay, der klinischen Symptome und der Ergebnisse anderer serologischer Tests wie etwa des Platelia Parvovirus B19 IgM-Assays gestellt werden. 5. Eine Verfahrensabweichung kann zu falschen Ergebnissen führen. 12- LEISTUNGSMERKMALE 1. Précision Reproduzierbarkeit Intraassay-Variabilität Zur Bestimmung der Intraassay-Variabilität wurden eine negative Probe, eine schwach positive und eine positive Probe 32 Mal in einer Messreihe getestet. Für jede Probe wurde der Index bestimmt. Ergebnisse: In der nachfolgenden Tabelle sind für alle drei Proben jeweils der Mittelwert, die Standardabweichung (SA) sowie der prozentuale Variationskoeffizient (VK%) angegeben: N=32 Negative Probe Schwach positive Probe Positive Probe Mittelwert 0,187 1,841 3,890 SA 0,0100 0,0473 0,0762 VK% 5,3 2,6 2,0 Interassay- Variabilität Zur Bestimmung der Interassay-Reproduzierbarkeit wurden eine negative Probe, eine schwach positive und eine positive Probe in Doppelbestimmung in zwei Messreihen pro Tag über einen Zeitraum von 20 Tagen getestet. Für jede Probe wurde der Index bestimmt. In der nachfolgenden Tabelle sind für alle drei Proben jeweils der Mittelwert, die Standardabweichung (SA) sowie der prozentuale Variationskoeffizient (VK%) angegeben: N=80 Negative Probe Schwach positive Probe Positive Probe Mittelwert 0,17 1,96 4,07 SA 0,0140 0,0600 0,1075 VK% 8,1 3,1 2,6 2. Relative Sensitivität und Spezifität Die relative Leistung des Platelia Parvovirus B19 IgG-Assay wurde mit insgesamt 166 klinischen Proben untersucht, die zunächst mit einem handelsüblichen IgG-Assay charakterisiert worden waren. 62

15 Die Ergebnisse jeder Untersuchung sind im Folgenden gezeigt: Platelia Parvovirus B19 IgG Assay Kommerziellen Parvovirus B19 IgG-EIA Positiv Nicht eindeutig Negativ Gesamt Positiv Nicht eindeutig Negativ Gesamt Nicht eindeutige Ergebnisse mit dem handelsüblichen IgG-Assay wurden aus der Berechnung ausgeschlossen. Die Gesamtkonkordanz des Platelia Parvovirus B19 IgG-Assay mit dem Referenz-IgG-EIA beträgt 93,2 %. Relative Spezifität Die relative Spezifität des Platelia Parvovirus B19 IgG-Assays wurde im Vergleich zu den mit dem als Referenz verwendeten kommerziellen Assay erhaltenen negativen Ergebnissen bestimmt. Sie wurde auf 86,2 % (75,3 % - 93,5 %) berechnet. Alle mit dem Platelia Parvovirus IgG-Assay erhaltenen positiven Ergebnisse mit negativ charakterisierten Proben wurden mit einem alternativen Parvovirus IgG-EIA wiederholt. Ein Ergebnis wurde als positiv bestätigt und eines erwies sich als nicht eindeutig. Relative Sensitivität Die relative Sensitivität des Platelia Parvovirus B19 IgG-Assays wurde im Vergleich zu den mit dem als Referenz verwendeten kommerziellen Assay erhaltenen positiven Ergebnissen bestimmt. Sie wurde auf 99,0 % (94,3 % - 100,0 %) berechnet. Die einzige positiv charakterisierte Probe, die im Platelia Parvovirus IgG- Assay negativ getestet wurde, wurde mit einem alternativen Parvovirus IgG- EIA erneut analysiert, wobei sich das negative Ergebnis bestätigte. 3. Kreuzreaktivität Die Bestimmung einer möglichen Kreuzreaktivität mit anderen Pathogenen als Parvovirus B19 würde voraussetzen, auf Seren zugreifen zu können, die negativ auf PVB19 IgG und positiv auf Pathogen X (oder möglicherweise mit Pathogen X versetzt) sind. Aufgrund der hohen Prävalenz von PVB19-IgG in der Weltbevölkerung (etwa %) ist die Wahrscheinlichkeit, eine solche Probe zu finden, niedrig. Mit dem Platelia Parvovirus B19 IgG-Assay wurde daher keine Untersuchung der Kreuzreaktivität durchgeführt. 63

16 4. Interferierende Substanzen Die Gerinnungshemmer Heparin, EDTA-2Na und Natriumcitrat haben in Konzentration von bis zu 20 IE/ml, 1 mg/ml bzw. 3 mg/ml keine Auswirkungen auf die Reaktion. Hämoglobin und Bilirubin hatten in Konzentrationen von bis zu 500 mg/ml bzw. 30 mg/ml keine Auswirkungen auf die Reaktion. Rheumafaktor hatte in einer Konzentration von bis zu 360 IE/ml keine Auswirkungen auf die Reaktion. 13- literatur 1. Cossart, Y. E., Field, A. M., Cant, B. & Widdows, D. : Parvovirus-like particles in human sera. Lancet I : 72-73, Pattison, J. R., Jones, S. E., Hodgson, J., Davis, L.R., White, J. M., Stroud, C. E. & Murtaza, L. : Parvovirus infection and hypoplastic crisis in stckle cell anaemia. Lancet, I : 664, Maria Soderlund, Caroline S. Brown, Willy J. M. Spaan, Lea Hedman, and Klaus Hedman : Epitope Type-Specific IgG Responses to Capsid Proteins VP1 and VP2 of Human Parvovirus B19 4. Allyson R. Butchko and Jeanne A. Jordan : Comparison of Three Commercially Available Serologic Assays Used To Detect Human Parvovirus B19-Specific Immunoglobulin M(IgM) and IgG Antibodies in Sera of Pregnant Women 5. Elisabetta Manaresi, Giorgio Gallinella, et al. : Humoral Immune Response to Parvovirus B19 and Serological Diagnosis of B19 Infection 6. Caroline S. Brown, Marcel M.M. Salimans, et al. : Antigenic parvovirus B19 coat proteins VP1 and VP2 produced in large quantities in a baculovirus expression system 7. Marcel M.M. Salimans, Mario J.A.W.M. van Bussel, et al. : Recombinant parvovirus B19 capsids as a new substrate for detection of B19-^specific IgG and IgM antibodies by an enzyme-linked immunosorbent assay 8. C.H. Woernle, L.J. Anderson, P. Tattersall, and J.M. Davison : Human Parvovirus B19 Infection During Pregnancy 9. Elisabetta Manaresi, Elisa Zuffi, Giorgio Gallinella, et al. : Differential IgM Response to Conformational and Linear Epitopes of Parvovirus B19 VP1 and VP2 Structural Proteins 64

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