Ressourceneffiziente Produktionsverfahren für PHB- Biokunststoffe

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1 Projektverbund Ressourcenschonende Biotechnologie in Bayern Projektpräsentation Ressourceneffiziente Produktionsverfahren für PHB- Biokunststoffe Prof. Dr. Thomas Brück Dr. Norbert Mehlmer Technische Universität München Fakultät für Chemie/ Fachgebiet Industrielle Biokatalyse (IBK)

2 Einleitung PHB: Poly-(R)-3-Polyhydroxybutyrat Biologisch recycelbar 2

3 Ziele Produktion eines neuen, auf Polyhydroxybutyrat (PHB) basierenden Kunststoffs Aus erneuerbaren Ressourcen (Kleie-Hydrolysat) Nicht auf Erdöl-Basis Verbesserte Produkteigenschaften Kostengünstige Produktion Wachstumsmedium Kleie-Hydrolysat E. coli Kleie Genetisch optimierter E. coli stamm zur Produktion von Designer PHB 3

4 Nachhaltige Fermentationsgrundlage Enzymatische Hydrolyse: Cellulasen Pectinasen Kleie (Weizen) Hemi-Cellulasen Zusammensetzung: Glucose (Hexose) Xylose (Pentose) Zuckerzusammensetzung des Hydrolysats Problem: Gleichzeitige Fermentation 4

5 Parallele Fermentation von Hexosen und Pentosen Wachstum (OD=optische Dichte, schwarz) von E. coli in einem Wachstumsmedium das drei Zucker beinhaltet: Xylose (blau), Arabinose (lila), und Glukose (grün). Links: wild-typ E. coli. Rechts: ptsg Knockout. ptsg Knockout Gleichzeitige Verwertung von Glukose und Xylose Xia et. al,

6 Verstärkter Xylose Metabolismus zur gesteigerten 3HB Produktion Pentose-Phosphate Weg Üblicher Weg Xylose Dahm Weg Abkürzung Xylose D-Xylose Isomerase D-Xylulokinase Transketolase Transaldolase Xylulose Xylulose-5-Phosphate Eingang zur Glycolyse D-Xylose Dehydrogenase Xylonate Dehydratase Aldolase Xylonate 2-keto-3-deoxy- Xylonate Gylcolaldeyd Glyceraldehyde-3-Phosphat +Fructose-6-Phosphat Pyruvat Pyruvate Dehydratase Komplex Glycolyse Acetyl-CoA Pyruvat Pyruvat Dehydratase Komplex Acetyl-CoA 6

7 Metabolic Stoffwechselweg zu PHB Endogene Synthese von PHB (taktisch) phba: β-ketoacy-coa Thiolase phbb: acetoacetyl-coa Dehydrogenase phbc: PHB Polymerase Synthese des Designer PHB 3HB + CoASH thioesterase II Neue Synthesestrategie Ataktisches PHB 7

8 Neue synthetische Strategie Übersicht: Lactonisierung Ring-Öffnungspolymerisation Ziel: Ataktisches PHB 8

9 Biokatalytische Lactonisierung von 3-HB Natives Substrate PL CD6 PL HS6 Substrat (Funktionelle Gruppe) Zielsubstrate 9

10 Strukturbasierte Mutagenese von PlaO1 C-Terminale Region Substratspezifische Bindung Hauptansatzpunkt zur gezielten Mutagenese Doppelsträngige ß-Helix Konserviertes Eisen-Bindemotiv 10

11 Lipase-basierende Ringöffnungs Polymerization Lipase Lipase AP6 ß- Lactone Designer PHB 11

12 Optimierung der Produktausbeute Wie lässt sich die Ausbeute von 3HB steigern?

13 Abundance Vorgehensweise Metabolische Flussanalyse und Optimierung der Produktivität 13C 12C Markierte Substrate Feed Zellkultur Metabolische Markierung Messung 50 0 M1 M2 M3 M4 M5 Analyse 13

14 Zusammenfassung PHB ist ein natürliches Biopolymer, das sich fermentativ einfach herstellen lässt Etablierung einer nachhaltigen Fermentationsgrundlage basierend auf Kleiehydrolysat Produktion von ataktischem PHB durch eine neue Synthesestrategie durch Biokatalytische Lactonisierung von 3HB Lipase-katalysierte Ringöffnungspolymerisation des Lactons Metabolische Optimierung der Produktausbeute 14

15 Projektfortschritt Plasmid zur Expression der phba und phbb Gene (WP2) Plasmid zur Expression des PlaO1 Gens (WP4) ptsg Knockout E. coli Stamm (WP2). Etablierung der 3HB Nachweismethode (Kit) Etablierung der 3HB Produktion in E. coli 15

16 Danksagung Prof. Dr. Thomas Brück Technische Universität München Fakultät für Chemie Dr. Daniel Garbe Dr. Monika Fuchs Dr. Farah Qoura Dania Awad Felix Bracharz Gülnaz Celik Matthias Glemser Martina Haack Elias Kassab Jan Lorenzen Mahmoud Masri Wolfgang Mischko Veronika Redai Johannes Schmidt Wojciech Jurkowski Samer Younes Bayerisches Staatsministerium für Umwelt und Verbraucherschutz