Molekulare Klonierung Praktikum

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1 Molekulare Klonierung Praktikum 2013

2 Praktikumsaufgabe Ligation 1. Zusammensetzung des Ligationsreaktions-ansatzes : 1 l Vektor DNA 1 l Insert DNA 2 l 10X Ligase Puffer 15 l destillertes Wasser 1 l Ligase 2. Mischen und Zentrifugieren (1-2 sec). 3. Inkubation bei 10 C für 1,5 Stunden (Kühlschrank). Materialen EcoRI verdaute puc19 Plasmid Tubulin Genfragment mit EcoRI-klebrigen Enden 10x Ligase Puffer: 660mM Tris-HCI ph 7.5, 5mM MgCl 2, 10mM DTT, 1mM ATP, destilliertes Wasser T4 DNA-Ligase (0.2 Unit/µl)

3 Vorbereitung von kompetenten Zellen: 1. Setzen Sie 1 ml einer Bakterienübernachtkultur in einem Eppendorfröhrchen. Inkubieren Sie die Zellen für 2 min bei 0-4 C (auf Eis). 2. Sedimentieren Sie die Bakterienzellen durch Zentrifugation für 10 min bei 4000 rpm. 3. Verwerfen Sie den Überstand in den Flüssigabfall und resuspendieren Sie die Zellen in 1 ml eiskalter 0,1M MgCl 2 Lösung. Inkubieren Sie die Zellen für 20 min auf Eis. 4. Sedimentieren Sie die Bakterienzellen erneut durch Zentrifugation für 10 min bei 4000 rpm. 5. Verwerfen Sie den Überstand und resuspendieren Sie die Zellen in 100 µl eiskalter 0,1M CaCl 2 Lösung. Inkubieren Sie die Zellen für 30 min auf Eis.

4 - die einzelnen Okazaki-Fragmente des verzögerten Stranges werden durch Phosphodiesterbindungen miteinander verbunden - diese Reaktion ist durch das Enzym Ligase katalysiert LIGASE

5 DNA KLONIERUNG: LIGATION - DNA-Ligase: ein Enzym, das DNA- Moleküle zwischen einem 5 -Phosphat- Ende und einem 3 -OH-Ende miteinander verbinden kann - DNAs mit komplementären einzelsträngigen Enden können Basenpaarung eingehen - die Enden werden als kohäsiv oder klebrig bezeichnet, über sie können DNAs durch die DNA-Ligase fest verbunden werden - die DNA-Ligase katalysiert die Bildung neuer Phosphodiesterbrücken - die Ligierung wird bei 5 bis 15ºC durchgeführt. Bei dieser relativ tiefen Temperatur ist gewährleistet, dass die beiden komplementären Enden Basenpaare ausbilden und das Enzym (Ligase) noch arbeitet.

6 Kompetente Zellen - die meisten Bakterien (auch E. coli) nehmen DNA unter normalen Bedingungen nur in begrenztem Umfang auf - um diese Bakterien wirksam zu transformieren, muss man die Zellen chemisch und/oder physikalisch behandeln - so wird ihre Fähigkeit verstärkt, DNA aufzunehmen - Zellen, die eine solche Behandlung durchlaufen haben, bezeichnet man als kompetente Zellen

7 Praktikumsaufgabe Materialen: Escherichia coli Zellen in logaritmischer Wachstumphase LB Platten die 100 µg/ml Ampicillin enthalten 0,1M MgCl 2, 0,1M CaCl 2, 2,5% IPTG (Isopropyl-β-D-thiogalactopyranoside) 2,5% X-gal (5-Bromo-4-chloro-3-indolyl-β-D-galactopyranoside) 42 C Wasserbadthermostat Transformation: 6. Geben Sie 10 µl von dem Ligationsansatz zu den kompetenten Zellen. Lassen Sie das Röhrchen auf Eis für weitere 30 min. Während dieser Zeit verteilen Sie 40 µl IPTG und 40 µl X-gal an der Oberfläche von festem ampicillinhaltigen Medium in einer Petrischale. 7. Inkubieren Sie die Zellen für 1,5 min bei 42 C (in Wasserbad). 8. Inkubieren Sie die Zellen für 2 min auf Eis. 9. Geben Sie 300 µl SOB Medium zu den Zellen und plattieren sie die Zellsuspension mithilfe einer Trigalsky-Spatel aus auf die Oberfläche von festem Medium (mit 40 l IPTG und 40 l X-gal) in der Petrischale. 10. Inkubieren sie die Platten über Nacht bei 37ºC.

8 Vektorkarte des puc18/19 Plasmids

9 LacZ Gen - X-Gal chromogenes Substrat DNA P rep laci C E O lacz lacy laca T DNA Repressor CAP-Stelle pol-bindestelle Operator Strukturgene Terminator IPTG indoxyl Galactose X-Gal

10 LacZ Gen - X-Gal chromogenes Substrat DNA P rep laci C E O lacz lacy laca T DNA Repressor CAP site pol binding site Operator Strukturgene Terminator pol -gal permease transacetylase

11 lacz Gen beim Klonen 10 DNA lacz DNA Repressor CAP-Stelle pol-bindestelle Operator Strukturgene Terminator lacz -Fragment fremde DNA lacz lacz

12 DNA KLONIERUNG: TRANSFORMATION Gen von Interesse Rekombinant Plasmid lacz Verdauung Ligation Transformation Ampicillinresistenzgen Verteilung der Bakterien an der Oberfläche von festem Medium, das Ampicillin, IPTG und X-Gal enthält Isolierung der weißen Kolonien Nachtsüber Wachsen lassen Isolierung der Plasmid DNA Weiße Kolonien: keine X-gal Abbau, rekombinantes Plasmid Plasmid mit dem lacz Gen

13 RESTRIKTIONSKARTIERUNG Unabhängige und Parallelverdauung mit zwei oder mehreren Restriktionsendonukleasen wird gemacht um die Position der Schnittstellen zu bestimmen, eine Restriktionskarte zusammenzustellen RE1 RE2 RE1+RE2

14 Restriktionskartierung 2. Die Abbildung zeigt die Restriktionskarte von einem DNA-Abschnitt, die Schnittstellen von 3 Restriktionsendonukleasen sind markiert: = EcoRI = HindIII = BamHI Zeichnen Sie die Bandenmuster der Gelelektrophorese (i) Im Fall einer separaten Verdauung mit den 3 Restriktionsenzymen (ii) Im Fall einer Parallelverdauung mit 2 aus den 3 Enzymen in allen möglichen Kombinationen (iii) Im Fall einer Parallelverdauung mit allen 3 Enzymen 1,2 3,8 5 1,6 1 9,4 2,2 24,2

15 Hausaufgabe: Beispiel Restriktionskartierung Das prit450 Plasmid hat eine Länge von 7,0 kb und hat je eine PstI, EcoRI, und BamHI Restriktionssstelle. Durch Verdauung mit PstI wird in das Plasmid ein 4,0 kb Fragment inseriert. Definieren sie die Karte des entstandenen rekombinanten Plasmids aus den folgenden Daten! PstI EcoRI BamHI PstI + EcoRI, PstI + BamHI EcoRI + BamHI

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