V e l i S a. zur Bestimmung von. Beta-2-Mikroglobulin. Gebrauchsinformation. Art.-No

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1 18028E30.FWD V e l i S a zur Bestimmung von Beta-2-Mikroglobulin Gebrauchsinformation Art.-No Vita Diagnostika GmbH Im Großacker 2b D Merzhausen/Frbg. (FRG) Tel (0)761/ Fax 0049 (0)761/

2 Inhalt 1. Einführung und Hintergrund 2. Sicherheitshinweise und Vorsichtsmaßnahmen 3. Testprinzip 4. Inhalt des Testkits 5. Benötigte, aber nicht mitgelieferte Materialien 6. Aufbewahrung des Testkits 7. Reagenzien- und Probenvorbereitung / Anforderungen an die Proben 8. Durchführung des Tests 9. Auswertung und Qualitätskontrolle 10. Interpretation der Ergebnisse / Grenzen der Methode 11. Testcharakteristika 12. Garantie und Haftung 13. Kurzanleitung Das hier (Dokument-Id. / Ver.-No. / Datum: 18028E30.FWD / 1201F / 12. Januar 2006) beschriebene Produkt wurde in Übereinstimmung mit IVD- Direktive 98/79/EG hergestellt von: Steffens Biotechnische Analysen GmbH Baumgartenstr. 5 D Ebringen (FRG) Die technische Dokumentation des Produktes liegt beim Hersteller vollständig vor und wird bei einem Zwischenfall mit dem Produkt oder bei einer offiziellen Anfrage ohne Verzug übermittelt

3 1. Einführung und Hintergrund Beta-2-Mikroglobulin (ß-2-M) ist die nicht-kovalent gebundene, leichte Kette der HLA-Klasse I-Antigene auf der Oberfläche aller kernhaltigen Zellen. Im ungebundenen Zustand passiert es wegen seines geringen Molekulargewichtes (11,8 kda) ungehindert die Glomerular-Membran der Niere und wird anschließend tubulär rückresorbiert. Daher wird ß-2-M verwendet, um die glomeruläre Filtrationsrate und die tubuläre Funktion der Niere zu kontrollieren. Allerdings wird die Serum-Konzentration des ß-2-M durch verschiedene Krankheiten erhöht; dadurch wird sein Nutzen als Indikator der Nierenfunktion beeinträchtigt. Zu diesen Krankheiten zählen u. a. lymphoide Neoplasien (Hodgkin- und Non-Hodgkin-Lymphom, multiples Myelom) und die HIV- Infektion. Für ihre Verlaufskontrolle und Therapiebewertung bildet ß-2-M einen wertvollen, empfindlichen Marker. Der vorliegende Enzyme-linked Immuno Sorbent Assay (ELISA) ist dazu bestimmt, ß-2-M im menschlichen Serum zu bestimmen. Die VeliSa Festphase besteht aus einer Pinplatte, die in 12 Streifen à 8 Pins geteilt werden kann. Die Pins sind beschichtet mit einem Antikörper-Präparat, das ß-2-M spezifisch erkennt. Die Teilbarkeit der Festphase gestattet es, mit einem Testkit mehrere Meßreihen durchzuführen. Ihr Design erleichtert und beschleunigt die Waschschritte erheblich. Zugleich werden Start und Stop der Inkubationsschritte genau synchronisiert; eine pipettier-bedingte Drift des Tests ist ausgeschlossen. Der Test ist schnell; die Inkubationszeit beträgt Minuten. Die Reagenzien sind z.t. farbcodiert und gebrauchsfertig. 6 Standards erlauben eine quantitative Bestimmung des Analyten zwischen 0 und 12 µg ß-2-M/mL. 2. Sicherheitshinweise und Vorsichtsmaßnahmen Der Test ist ausschließlich für die in vitro-diagnostik bestimmt. Der Probenpuffer und die Standards enthalten Na-Azid als Stabilisator. Der Waschpuffer enthält Bromonitrodioxan als Stabilisator und das Konjugat Methylisothiazolon/Bromonitrodioxan. Das Substrat enthält 3,3',5,5' Tetramethylbenzidin (TMB) und Wasserstoffperoxid (H2O2). Die Stoplösung, 0,5 M Schwefelsäure (H2SO4), ist sauer und ätzend. Diese Reagenzien sind giftig. Daher müssen die üblichen Vorsichtsmaßnahmen bei der Handhabung gefährlicher Chemikalien getroffen werden. Jeden - 2 -

4 Körperkontakt vermeiden, Handschuhe und Schutzbrille tragen. Sollte dennoch Haut (oder Schleimhaut) von einem Reagenz benetzt werden, die betroffene Stelle mit viel Wasser abspülen. Nicht mit dem Mund pipettieren. Na-Azid kann mit Kupfer- und Bleirohren reagieren und explosive Metallazide bilden. Beim Entsorgen mit Wasser nachspülen, um ein Akkumulieren von Azid zu verhindern. Die Standards enthalten Komponenten menschlichen Ursprungs. Sie wurden daraufhin geprüft, ob Human Immunodeficiency Virus (HIV)-Ag, Hepatitis B- Oberflächen (HBs)-Ag und Antikörper gegen HIV 1/2 und Hepatitis C-Virus (HCV) vorliegen und zeigten negative Resultate; entweder in einem FDAzugelassenen Test oder einem Test mit CE-Zeichen, entsprechend der Europäischen Richtlinie 98/79/EC. Allerdings kann kein Test garantieren, daß Material humanen Ursprungs tatsächlich nicht infektiös ist. Die Präparate sollten daher als potenziell infektiös behandelt und entsprechend entsorgt werden. 3. Testprinzip Die Pins der VeliSa Festphase sind mit einem spezifischen ß-2-M-Antikörper beschichtet. An dieser Oberfläche laufen die folgenden immunologischen Reaktionen ab: 1. Inkubationsschritt: Die VeliSa Pins werden in Kavitäten getaucht, in denen die Standards und die verdünnten Proben vorgelegt wurden. ß-2-M aus der Probe bindet an den immobilisierten Antikörper; es bildet sich der Antigen- Antikörper-Komplex. Nicht-gebundene Probenbestandteile werden anschließend von der Festphase gewaschen. 2. Inkubationsschritt: Dann werden die VeliSa Pins in Kavitäten getaucht, in die ein zweites, Enzym-markiertes Antikörper-Präparat gegen ß-2-M (Konjugat) vorgelegt wurde. Es bindet seinerseits an den immobilisierten Antigen- Antikörper-Komplex. Überschüssiges Konjugat wird anschließend von der Festphase gewaschen. 3. Inkubationsschritt: Schließlich werden die VeliSa Pins in Kavitäten getaucht, in die Substrat für das Enzym vorgelegt wurde. Durch den gebundenen, Enzym-markierten Antigen-Antikörper-Komplex wird das farblose Substrat in ein farbiges Produkt umgesetzt. Das Ausmaß der Farbentwicklung spiegelt die Menge an ß-2-M in der Probe wider

5 4. Inhalt des Testkits a. 1 VeliSa Pinplatte im Mikrotiter-Format, beschichtet mit einem hochgereinigten Antikörper gegen ß-2-M. Die VeliSa Pinplatte kann an Sollbruchstellen in 12 Streifen à 8 Pins geteilt werden und trägt an ihrer Oberseite Doppelklebeband zur Befestigung eines Griffs. Zusammen mit einer teilbaren Rundboden-Mikrotiterplatte ist sie in einem Beutel aus laminierter Metallfolie hermetisch verpackt. Der Beutel enthält zusätzlich Trockenmittel. b. 2 teilbare Rundboden-Mikrotiterplatten c. 6 Standards mit 0-0,75-1,5-3,0-6,0 und 12 µg ß-2-M / ml; jeweils 1,0 ml; gebrauchsfertig; gelb. Milieu: endverdünnter Probenpuffer. d. 100 ml Waschpuffer-15x-Konzentrat; farblos. Enthält Tris-gepufferte Saline (Tris-buffered saline, TBS), Tween und Bromonitrodioxan. e. 20,0 ml Probenpuffer-10x-Konzentrat; gelb. Enthält TBS, Rinderserum- Albumin (bovine serum albumin, BSA), Tween und Na-Azid. f. 14 ml anti-ß-2-m Peroxidasekonjugat; gebrauchsfertig; grün. Gepufferte Lösung mit Stabilisator-Protein, Methylisothiazolon und Bromonitrodioxan. g. 14 ml Substratlösung; gebrauchsfertig; farblos; in einem Lichtundurchlässigen Gefäß. Gepufferte Lösung, enthält TMB und H2O2. h. 14 ml Stoplösung; farblos; gebrauchsfertig. 0,5 M H2SO4: Vorsicht ätzend! i. Gebrauchsinformation (auf CD-ROM) 5. Benötigte, aber nicht mitgelieferte Materialien a. Deionisiertes oder destilliertes Wasser b. Meßzylinder für 250 und 2000 ml c. Reagenzröhrchen für die Probenverdünnung (Transfer-Röhrchen im Mikrotiterplatten-Format empfohlen) d. Pipetten für µl (1- und 8-Kanal empfohlen) e. Festphasen-Griff (optional, wiederverwendbar) - 4 -

6 f. 3 Waschwannen (wiederverwendbar) g. Mikrotiterplatten-Photometer mit 450 nm-filter h. ELISA Auswertungs-Software (empfohlen) 6. Aufbewahrung des Testkits Der Testkit muß bei 2-8 C gelagert werden. Er ist bis zum Verfallsdatum einsetzbar, das auf dem Etikett der Verpackung angegeben ist; danach nicht mehr verwenden. 7. Reagenzien- und Probenvorbereitung / Anforderungen an die Proben Wegen möglicherweise unterschiedlichen Lagerungs- und Transport- Bedingungen dürfen korrespondierende Komponenten aus verschiedenen Kits nicht vermischt oder gegeneinander ausgetauscht werden. a. Das Waschpuffer-15x-Konzentrat (100 ml, farblos) wird mit 1400 ml deionisiertem Wasser verdünnt und durchmischt. Gekühlt bei 2-8 C ist diese Lösung für mehrere Wochen stabil. Für eine Testdurchführung, unabhängig von der Anzahl der VeliSa Pinstreifen, werden 300 ml Waschpuffer benötigt (20 ml Konzentrat auf 300 ml auffüllen). b. Das Probenpuffer-10x-Konzentrat (20,0 ml, gelb) wird mit 180 ml deionisiertem Wasser verdünnt und durchmischt. Gekühlt bei 2-8 C ist diese Lösung für mehrere Wochen stabil. c. Präparation der Proben: Serenproben als potenziell infektiös betrachten und entsprechend vorsichtig handhaben. Sie werden mit dem Probenpuffer 1:100 in Reagenzröhrchen verdünnt; bspw. 10 µl Serum µl Probenpuffer. Gut geeignet sind Transfer-Röhrchen im Mikrotiter-Plattenformat. Die Verdünnungen gut durchmischen. Proben, die nicht sofort analysiert werden können, müssen bei 2-8 C gelagert und innerhalb von 3 Tagen gemessen werden. Ist eine längere Lagerung vorgesehen, so müssen sie eingefroren werden. Wiederholtes Einfrieren und Auftauen ist zu vermeiden. Aufgetaute Proben vor dem Verdünnen durchmischen

7 Anforderungen an die Proben: Stark lipämische oder hämolysierte Proben sowie mikrobiell verunreinigte Seren können falsche Ergebnisse liefern und sollten daher vermieden werden. d. VeliSa-Festphase: Die benötigte Anzahl an Kavitätenstreifen in den beiden Halterahmen belassen; die überzähligen Streifen entfernen und bis zu ihrer künftigen Verwendung im Verpackungsbeutel lagern. Alle Streifen haben Rundboden-Kavitäten; es gibt daher keine Verwechslungsgefahr. Den Beutel mit der VeliSa Pinplatte akklimatisieren lassen, erst dann öffnen und die Platte entnehmen. Teilen der VeliSa Pinplatte (bei weniger als 96 Analysen): Die benötigte Anzahl an VeliSa Pinstreifen von der Platte abbrechen; dazu die Stege der gegenüberliegenden Randkerben mit einer Schere durchtrennen. Dann die VeliSa Pinstreifen durch leichten Druck auf die Sollbruchstelle abbrechen. Danach mit einem Messer das Doppelklebeband durchtrennen und den Halte-/Transportgriff (wiederverwendbar) zentriert aufkleben. - Den linken und rechten Rand der VeliSa Pinplatte ebenfalls wie beschrieben abbrechen. Die aktuell benötigten Pinstreifen bis zur Verwendung in die 3. Mikrotiterplatte mit der passenden Anzahl Kavitätenstreifen stellen. Die überzähligen VeliSa Pinstreifen wieder in die überzähligen Kavitätenstreifen stellen und zusammen mit dem Trockenmittel zurück in den Beutel geben. Diesen mit Klebeband hermetisch verschließen und bis zur künftigen Verwendung weiter bei 2-8 C lagern. 8. Durchführung des Tests Bevor der Test gestartet wird, müssen alle Kitkomponenten Raumtemperatur (23 ± 3 C) angenommen haben. a. 3 numerierte Waschwannen bis an den inneren Rand mit je ca. 100 ml Waschpuffer befüllen. b. 25 µl Standards (je 1,0 ml, gelb, gebrauchsfertig) und verdünnte Proben in die Kavitäten der ersten Platte pipettieren. 100 µl Probenpuffer zusetzen (1:5-Verdünnung in der Kavität). Doppelbestimmungen werden empfohlen, besonders für die Standards. c. Die VeliSa Pinstreifen kurz im ersten Waschbad benetzen. Haftflüssigkeit abschütteln und die Streifen in die erste Platte mit den Proben setzen. 10 Minuten bei Raumtemperatur (23 ± 3 C) inkubieren

8 d. Während dieser Inkubation das Konjugat (14 ml, gebrauchsfertig, grün) in die Kavitäten der zweiten Platte pipettieren; je 100 µl. e. Nach Abschluß der ersten Inkubation die VeliSa Pinstreifen für je ca. 5 Sekunden in den Waschbädern 1 und 2 waschen. Dabei die Festphase leicht agitieren. Anschließend Haftflüssigkeit abschütteln. f. Die VeliSa Pinstreifen in die zweite Platte mit dem Konjugat setzen. 10 Minuten bei Raumtemperatur inkubieren. g. Während dieser Inkubation das Substrat (14 ml, farblos, gebrauchsfertig) in die Kavitäten der dritten Platte pipettieren; je 100 µl. h. Nach Abschluß der zweiten Inkubation die VeliSa Pinstreifen wie in Schritt e. waschen, aber in den Waschbädern 2 und 3. Anschließend Haftflüssigkeit abschütteln. i. Die VeliSa Pinstreifen in die dritte Platte mit dem Substrat setzen. 10 Minuten bei Raumtemperatur und Licht-geschützt inkubieren (das Substrat ist Lichtempfindlich). j. Nach Abschluß der dritten Inkubation die VeliSa Pinstreifen entfernen und sofort 100 µl Stoplösung (14 ml, farblos, gebrauchsfertig. Vorsicht ätzend!) in die Kavitäten pipettieren (Farbumschlag von blau nach gelb). Zur Durchmischung von Substrat und Stoplösung die Platte für ca. 10 Sekunden vorsichtig agitieren, am besten auf einem Schüttler. k. Die Platte im Mikrotiterplatten-Photometer bei 450 nm messen. Überschüssige Reagenzien weiter bei 2-8 C lagern, wenn sie später noch einmal verwendet werden sollen. 9. Auswertung und Qualitätskontrolle Die Meßdaten werden anhand der Standardkurve quantitativ ausgewertet. Die unten dargestellte Kurve kann jedoch nicht die Messung der Standards bei der Testdurchführung ersetzen, zusammen mit den aktuellen Proben. Sie dient lediglich als Modell. Die Kurve wurde von einem üblichen ELISA Auswertungsprogramm mit einer 4-Parameter-Funktion errechnet; die Spline- Approximation ist ebenso geeignet

9 mod 450 nm , µg ß-2-M / ml 18028E00.FED/1901D Steht keine Rechner-gestützte Auswertung zur Verfügung, so zeichnet man anhand der Standard-Meßwerte eine entsprechende Kurve, an der die Konzentration an ß-2-M in den Proben abgelesen werde kann (µg ß-2-M / ml Serum). Es empfiehlt sich, zur Qualitätskontrolle des Tests Seren mit bekannter ß-2-M- Konzentration mitzuführen. 10. Interpretation der Ergebnisse / Grenzen der Methode L. Thomas (Labor und Diagnose, 6. Auflage, 2005, Verlag TH-Books, S. 982 ff.) gibt als Referenzbereich für Serum/Plasma an: 0,8-2,4 µg / ml (< 60 Jahre) 3,0 µg / ml (> 60 Jahre) Entsprechende Werte wurden auch bei der Messung eines Blutspender- Serenkollektivs mit dem vorliegenden Test gefunden, s. u.: Testcharakteristika. Die Interpretation eines Testresultats hängt wesentlich vom klinischen Kontext der Messung ab. Vom Normalbereich abweichende Werte können durch Störungen der Nierenfunktion oder aber bspw. durch maligne Tumoren bedingt sein, wie eingangs ausgeführt. Zu berücksichtigen ist, daß diese Krankheiten nebeneinander auftreten können. Wenn dies durch ergänzende Untersuchungen nicht ausgeschlossen werden kann, ist die Interpretation einer abnormen ß-2-M-Konzentration im Serum problematisch

10 Proben mit grenzwertigen Resultaten (d. h. mit Meßwerten am Rand des Normalbereiches) sollten als zweifelhaft betrachtet und als solche berichtet werden. Es empfiehlt sich, nach etwa 2 Wochen eine weitere Probe zu messen, parallel mit der zuerst entnommenen, um eine mögliche Änderung der ß-2-M- Konzentration zu erfassen. Wie bei jedem serologischen Test, aber insbesondere beim vorliegenden Meßparameter, sollten dessen Resultate nicht isoliert interpretiert werden, sondern im Zusammenhang mit den Symptomen des Patienten und anderen diagnostischen Kriterien. 11. Testcharakteristika Standardisierung: Der Test wird mit einem kommerziell erhältlichen, hochgereinigten ß-2-M-Präparat standardisiert, das aus humanem Urin isoliert wird. Die Konzentration einer Probe an ß-2-M wird in absoluten Einheiten (µg ß- 2-M / ml Serum) angegeben. Analytische Spezifität: Der Test weist spezifisch humanes ß-2-M nach. Der verwendete Antikörper wurde von interferierenden Antikörpern durch Festphasenabsorption mit humanen Plasmaproteinen befreit. Nachweisgrenze (analytische Sensitivität): Die Nachweisgrenze ist definiert als diejenige Konzentration des Analyten, die dem OD-Mittelwert des Probenpuffers entspricht, zu dem die 3-fache Standardabweichung (s) addiert wurde. Sie wurde zu 0,2 µg ß-2-M / ml Serum bestimmt (n = 24). Empfohlener Meßbereich: 0,5-12 µg ß-2-M / ml Serum Häufigkeitsverteilung des ß-2-M: In einem Serenkollektiv von 160 Blutspendern, gleichmäßig nach Geschlecht und Alter ausgesucht, wurde die folgende Verteilung des Analyten ermittelt: Mittelwert: 1,4 µg / ml Mittelwert + 2s: 2,1 µg / ml Median: 1,4 µg / ml 95% Percentile: 1,9 µg / ml Präzision: Um die Präzision des Tests zu ermitteln, wurde die Variabilität der Ergebnisse unter folgenden Bedingungen ermittelt: a. innerhalb eines Assays und zwischen 3 Assays, b. zwischen 3 Anwendern und c. zwischen 2 Kit- Chargen

11 a. Intra- und inter-assay Variabilität (n = 24 bzw. 72) Probe Mittelwert Variabilität (VK, %) µg / ml intra-assay inter-assay 1 2,2 4,9 5,8 2 3,7 3,7 5,0 3 5,2 5,1 6,6 b. Operator-zu-Operator Variabilität (n = 12) Probe Mittelwert Variabilität µg / ml (VK, %) 1 2,3 7,1 2 3,7 7,0 3 5,1 5,9 c. Variabilität zwischen 2 Kit-Chargen (n = 6) Probe Mittelwert Variabilität µg / ml (VK, %) 1 2,5 5,5 2 4,2 10,2 3 6,1 5,9 12. Garantie und Haftung Steffens biotechnische Analysen GmbH (SBA) garantiert, daß das ausgelieferte Produkt gründlich getestet wurde, um sicherzustellen, daß es seine Spezifikationen erfüllt und der hier gegebenen Beschreibung entspricht. Weitergehende Garantien werden nicht gegeben. Die hier genannten Testcharakteristika wurden mit der angegebenen Methode ermittelt. Jede Änderung der Methode kann die Ergebnisse beeinflussen. In einem solchen Fall verweigert SBA jede Haftung, ob ausgesprochen, impliziert oder gesetzlich. Darüber hinaus kann SBA keinerlei Haftung für Schäden übernehmen, die aufgrund einer unkorrekten Lagerung oder Anwendung des Produktes entstanden sind; direkt, indirekt oder als Konsequenz

12 13. Kurzanleitung a. Das 15x-Konzentrat des Waschpuffers (100 ml, farblos) mit Wasser verdünnen und durchmischen. 3 numerierte Waschwannen bis an den inneren Rand mit je ca. 100 ml Waschpuffer befüllen. b. Das Probenpuffer-10x-Konzentrat (20,0 ml, gelb) mit 180 ml Wasser verdünnen und durchmischen. Die Serenproben 1/100 in Probenpuffer verdünnen und durchmischen. c. 25 µl Standards (je 1,0 ml, gelb, gebrauchsfertig) und verdünnte Proben in die Kavitäten der ersten Platte pipettieren. 100 µl Probenpuffer zusetzen (1:5-Verdünnung in der Kavität). Doppelbestimmungen werden empfohlen, besonders für die Standards. d. Die VeliSa Pinstreifen kurz im ersten Waschbad benetzen. Haftflüssigkeit abschütteln und die Streifen in die erste Platte mit den Proben setzen. 10 Minuten bei Raumtemperatur (23 ± 3 C) inkubieren. e. Während dieser Inkubation das Konjugat (14 ml, gebrauchsfertig, grün) in die Kavitäten der zweiten Platte pipettieren; je 100 µl. f. Nach Abschluß der ersten Inkubation die VeliSa Pinstreifen für je ca. 5 Sekunden in den Waschbädern 1 und 2 waschen. Dabei die Festphase leicht agitieren. Anschließend Haftflüssigkeit abschütteln. g. Die VeliSa Pinstreifen in die zweite Platte mit dem Konjugat setzen. Inkubieren wie in Schritt d. h. Während dieser Inkubation das Substrat (14 ml, farblos, gebrauchsfertig) in die Kavitäten der dritten Platte pipettieren; je 100 µl. i. Nach Abschluß der zweiten Inkubation die VeliSa Pinstreifen wie in Schritt f. waschen, aber in den Waschbädern 2 und 3. Anschließend Haftflüssigkeit abschütteln. j. Die VeliSa Pinstreifen in die dritte Platte mit dem Substrat setzen. Inkubieren wie in Schritt d., jedoch im Dunkeln: das Substrat ist Licht-empfindlich. k. Nach Abschluß der dritten Inkubation die VeliSa Pinstreifen entfernen und sofort 100 µl Stoplösung (14 ml, farblos, gebrauchsfertig. Vorsicht ätzend!) in die Kavitäten pipettieren. Die Platte kurz vorsichtig agitieren. l. Die Platte im Mikrotiterplatten-Photometer bei 450 nm messen. m.auswertung: Die Standardkurve ermitteln und anhand dieser Kurve die optische Dichte der Proben in ihre jeweilige ß-2-M-Konzentration (µg / ml) umformen

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