Vorlesung Allgemeine und Molekulare Genetik Transkription und Genregulation Erwin R. Schmidt

Transkript

1 Vorlesung Allgemeine und Molekulare Genetik Transkription und Genregulation Erwin R. Schmidt

2 Gen für Lac-Repressor Lac(tose)-Operon Lac-Repressor Ohne Lactose bindet der Repressor an den Operator und verhindert die Transkription

3 Ist Lactose (bzw. Allolactose) als Induktor vorhanden, bindet dieser an den Lac-Repressor und verändert dessen DNA-Binde-Eigenschaft so, dass sich der Repressor von der DNA löst und die Lac-Gene zur Transkription freigibt

4 Der eigentliche Induktor ist Allolactose

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6 Die Aktivität des Lac-Operons wird aber nicht nur durch Lactose, sondern auch durch Glucose gesteuert : Ist Glucose ausreichend im Medium vorhanden, werden die Lac-Gene nur schwach transkribiert. Dies macht Sinn, denn Glucose ist für das Bakterium eine sehr viel günstigere Kohlenstoffquelle als Lactose. Wie funktioniert das?

7 Die Steuerung der Transkriptionsrate erfolgt über den camp- Spiegel, der wiederum von der Glucosekonzentration abhängig ist. Es gilt: Hoher Glucosespiegel niedrige camp Konzentration Niedriger Glucosespiegel hohe camp Konzentration denin

8 camp bindet an ein Aktivator-Protein, das CAP (Catabolic activator protein), camp-cap aktiviert (positiv!) die Transkription

9 Zusammenfassung

10 Nur für Interessierte: Die Struktur der Lac-Repressionsschleife Die Unterdrückung der Transkription erfolgt durch Erzeugung einer raffinierten Sekundärstruktur, der Repressionschleife. Zwei Repressordimere binden symmetrisch vor und hinter der Promotorregion und zwingen damit die Promotor-DNA in ein geschlossene Schleife (blau), so dass die RNA-Polymerase keine Chance für eine Transkription hat.

11 Struktur des Tryptophan-Operons Aus Hartl und Jones, Genetics

12 Tryptophan -Operon Beispiel für negative Rückkopplung: Die Transkription der Strukturgene für die Tryptophansynthese wird durch die Tryptophankonzentration gesteuert. Das Regulatorprotein liegt als inaktiver Aporepressor vor. Erst durch Bindung von Tryptophan wird aus dem inaktiven Aporepressor der aktive Repressor, der an den Operator bindet und die Transkription stoppt

13 Unabhängig von der Steuerung durch Aporepressor/Repressor hat das Tryptophan-Operon einen weiteren Steuerungsmechanismus, Attenuation. Die Attenuation (Verringerung) ist eine Art Feinregulation, mithilfe derer die Synthese der Trp-RNAs verringert werden kann, ohne das Trp-Operon ganz abzuschalten. Der Mechanismus ist ein faszinierendes Beispiel dafür, welche raffinierten Möglichkeiten die Natur nutzt, um Organismen den optimalen Umgang mit ihren Ressourcen zu erlauben.

14 Bei hoher Trp-Konzentration finden sich besonders viele Leader-RNA-Moleküle

15 Feinstruktur der Leader-Region des Trp-Operons Aus Hartl und Jones, Genetics

16 Mechanismus der Attenuation im Trp- Operon Aus Hartl und Jones, Genetics

17 Termination durch hohe Tryptophankonzentration

18 Thema: Eukaryotische Genregulation und RNA-Prozessierung Spleißen, Capping, Polyadenylierung, RNA- Editieren

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20 Transkription der Gene im Zellkern(ZK) als Primärtranskripte (hnrna), Prozessierung der RNA im ZK, reife mrna und Translation im Cytoplasma Cytoplasma hnrna: heterogene nukleäre RNA mrna: messenger RNA DNA hnrna ZK mrna

21 Genstruktur der Eukaryoten je nach Genklasse ist die Struktur verschieden: 1. RNA Pol I Gene für 18S, 5,8S, 28S rrna 2. RNA Pol II Gene für alle mrnas 3. RNA Pol III Gene für trnas, 5S rrna, einige snrnas 4. RNA Pol IV mi/sirnas

22 RNA-Polymerase I-Gene sind tandem-repetitiv organisiert

23 Elektronenmikropische Darstellung der rdna-transkription durch RNA-Pol I

24 RNA-Polymerase I Gene: 5,8 5,8 S

25 RNA-Polymerase I Gene Promotor 5 stromaufwärts Primärtranskript enthält 18S, 5,8S und 28S rrna sowie interne spacer RNA Gene immer repetitiv vorhanden Gene in Gruppen ( cluster ) tandemartig angeordnet (i. d. Regel head to tail ) nur bei manchen Organismen: Gen-Amplifikation ( = zusätzliche, extrachromosomale Genkopien in speziellen Geweben)

26 TATAAA RNA Polymerase II Gene ATG GT A AG TAA TGA TAG AATAAA DNA Promotor Exon UTR Intron1 Exon2 3 - UTR Primärtranskript mrna UAA G m7 AUG UGA AAUAAA UAG Poly A UTR = untranslatierte Region Termination? ERS

27 RNA Polymerase II Gene 5- stromaufwärts Promotor (oft TATA-Box bei -25) Intron Exon Struktur (i. d. Regel) Primärtranskript ( hnrna ) enthält 5 UTR, alle Exons und Introns, 3 - UTR Transkriptionsstart = +1, = Cap-Site An Intron/Exongrenzen consensus splice sites (Exon/ GT..Intron..AG/Exon) Polyadenylierungssignal Termination oft ungenau definiert Regulation durch Enhancer

28 RNA Pol II Promotorelemente Sequenz: Position: Funktion Name Sequenz Position Funktion TATA-Box Hogness- Box TATAAA -25 bis -30 Definiert Transkriptstartpunkt CAT-Box GGCCAATC -60 bis -80 Polymerase- Bindung via CBP GC-Box GGGCG Variabel und mehrfach -1 bis -167 Definiert RNA- Pol Bindungstelle

29 Regulierte und unregulierte Gene Luxusgene und Haushaltsgene

30 Promotor Elemente RNA-Pol II UCE: upstream control element DPE: downstream promotor element

31 Beispiele für eukaryotische Promotoren

32 Enhancer sind cis-regulatorische Kontrollelemente, die unabhängig von ihrer Orientierung, Lage oder Distanz zum Gen die Aktivität eines Gens steigern können Silencer Wirkungsweise wie negativer Enhancer, setzt Genaktivität herab

33 Vergleich Prokaryoten - Eukaryoten

34 Schema der eukaryotischen Genregulation ( loop -Modell)

35 Typische Aktivatorproteine sind DNA-Bindeproteine mit mehreren Domänen DNA-Bindung Protein-Bindung Liganden-Bind. Aktivierung DNA-binde-Domäne Dimerisierungsdomäne Aktivatordomäne Liganden-binde-Domäne

36 An der Aktivierung von Pol II-Genen beteiligte Komplexe Funktion= Chromatin-remodelling The multiprotein Mediator complex is a coactivator required for transcriptional activation of RNA polymerase II transcribed genes by DNA binding transcription factors. SAGA:Spt-Ada-Gcn5-Acetyltransferase SRB: Suppressor of RNA-PolymeraseII SWI/SNF = Switch/SucroseNonFermenting

37 Untereinheiten der Präinitiationskoplexproteine

38 Hormon induzierte Genaktivität Beispiel für Genaktivierung durch externe Signale Hsp90/Hsp70 FKBP52 GRE GRE: Glucocorticoid-Response-Element

39 HAT = Histon-Acetyl-Transferase HADC = Histondeacetylase HMT = Histon-Methyl-Transferase

40 Nach der Transkription: posttranskriptionelle Modifikationen typisch für eukaryotische mrna: Capping, Splicing, Polyadenylierung,

41 Capping der mrna + CH

42 Funktion der Cap-Struktur erhöht Stabilität der mrna induziert Splicing fördert Export aus dem Nukleus vermittelt Bindung der Ribosomen an mrna und macht Translation möglich

43 Poly-Adenylierung am 3 Ende der mrna 1. Trimmen des Primärtranskripts an definierter Stelle (23-24 Basen stromabwärts des Poly A-Signals AAUAAA) 2. Anfügen von ca Adenin-Nukleotiden

44 Polyadenylierung : Trimmen der mrna und Anhängen von mehreren Adeninnukleotiden

45 Die Polyadenylierung ist ähnlich komplex wie die Initiation! Aus: Strange bedfellows: polyadenylation factors at the promoter Olga Calvo1 and James L. Manley, GENES & DEVELOPMENT 17:

46 Funktion der Poly-Adenylierung? - Stabilität der mrna - Translatierbarkeit

47 Splicing /Spleißen Intronabschnitte werden aus dem Primärtranskript entfernt Die Exons werden miteinander zur funktionsfähigen RNA verbunden funktionsfähig kann aber auch bedeuten, dass ein nicht funktionsfähiges Protein gebildet wird

48 TATAAA RNA Polymerase II Gene ATG GT A AG TAA TGA TAG AATAAA DNA Promotor Exon UTR Intron1 Exon2 3 - UTR Primärtranskript mrna UAA G m7 AUG UGA AAUAAA UAG Poly A Termination? ERS

49 Je nach Spleißmechanismus werden vier verschiedene Gruppen von Introns unterschieden: trna Introns Autokatalytische Introns Gruppe I Autokatalytische Introns Gruppe II hn-/mrna Introns

50 Autokatalytisches Splicing/ Ribozyme Beim autokatalytischen Spleißen sorgt die Intron- RNA selbst (autokatalytisch) dafür, dass die RNA an den Intron-Exon-Grenzen geschnitten und die beiden Exon- Enden (3 -Ende von Exon n mit dem 5 -Ende von Exon m) über eine Phosphodiester-bindung verknüpft werden. Weil die RNA bei diesem Prozess wie ein Enzym katalytisch aktiv ist, werden diese RNAs auch als Ribozyme bezeichnet

51 Ribozym- Struktur Entdecker der Ribozyme Th. R. Cech; Sydney Altman Nobelpreis 1989

52 Autokatalytisches Spleißen der Gruppe I Introns bei Prä-rRNA von Tetrahymena

53 Mechanismus der autokatalytisch spleißenden Gruppe I Introns

54 Autokatalytisches Splicing Gruppe II Introns

55 Für mrnas gilt eine Consensus Splice Site

56 mrna-spleißen an der Consensus Splice Site /GU...A..AG/

57 Beim Spleißen bildet sich ein Lariat (Lasso) im herausgelösten Intron über eine 2-5 -Phosphodiesterbindung

58 Am Spleißen von mrnas sind Spliceosomen mit SN(U)RPS beteiligt

59 snrnps (SNURPS) enthalten die snrnas (sn = small nuclear ) U1, U2, U4/6 und U5 (snrnps= small nuclear ribonucleoprotein)

60 Zusammenfassung

61 Warum überhaupt Introns? Erleichtern die Enstehung komplexer Gene! (mehrere Minigene = Exons werden zu Makrogene zusammengepackt) Exon shuffling (einzelne Exons kodieren für Proteindomämen ) Module, verschiedene Module ergeben zusammen immer wieder neue Proteine) Alternatives Spleißen (durch Kombination verschiedener Exons auf Ebene der RNA kann ein Gen für viele Proteine kodieren) Transspleißen

62 Prinzip des alternativen Spleißens

63 Alternatives oder differenzielles Spleißen erhöht die Zahl der Proteine: aus einem Aktivatorprotein kann sogar ein Repressor werden!! DNA-Bindung Ligandenbindung Aktivierung Dimerisierung Aktivatorprotein DNA-Bindung Ligandenbindung Aktivierung Dimerisierung DNA-Bindung Ligandenbindung Dimerisierung Repressorprotein

64 Beim DSCAM-Gen (115 Exons) gibt es bis zu verschiedene Spleißvarianten DSCAM = Down Syndrom Cell Adhesion Molecule Besteht immer aus 24 Exons, aber A, B, C, D sind variabel

65 Genregulation durch mirna

66 Entstehung der mirna Quelle:

67 RNA-Editierung Stop-Codon

68 RNA-Editierung Leber (APOBEC-Complexing Factor) Darm

69 RNA-Editierung bei ca. 5-6 % der menschlichen Gene der Fall "Nature Biotechnology" (Bd. 22, S. 1001, August 2004)

70 Vielen Dank für s Zuhören und vielleicht ein Wiedersehen in der Molekulargenetik (Modul 13) oder in der Gentechnologie (Master Modul 8)