Zytomegalie IgM ELISA
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- Andreas Gehrig
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1 Arbeitsanleitung Zytomegalie IgM ELISA Enzymimmunoassay auf Mikrotiterbasis zum Nachweis und zur quantitativen Bestimmung von humanen IgM-Antikörpern gegen Zytomegalievirus in Serum und Plasma Z Kat.-Nr.: ILE-CMV03 Lagerung: 2-8 C Nur für in-vitro Diagnostik April 2008 IMMUNOLAB GmbH, Otto-Hahn-Str. 16, D Kassel Tel: , Fax: , info@immunolab.de
2 Inhaltsverzeichnis Seite 1. Verwendungszweck 3 2. Klinische Bedeutung 3 3. Testprinzip 3 4. Hinweise und Vorsichtsmaßnahmen 4 5. Inhalt des Testbestecks 4 6. Erforderliche Geräte und Hilfsmittel 5 7. Gewinnung, Vorbereitung und Aufbewahrung der Proben 5 8. Testdurchführung 6 9. Auswertung Testcharakteristika Literatur 8 Symbole und Übersetzungen Symbol English French German Italian Spanish Greek CAL Calibrator Etalon Standard Calibratore Calibrador Πρότυπο Διάλυμα Conjugate Conjugué Konjugat Coniugato Conjugado Διάλυμα CONJ Συμπλόκου CONC SAMP DIL STOP SUBS MT PLATE WASH BUF Stop Solution Concentré (<n> fois) Diluant échantillon Solution d arrêt Konzentrat (<n>-fach) Proben verdünner Stopp-Lösung Concentrate (<n>-fold) Sample Diluent Concentrato Diluente del campione Soluzione d arresto Concentrado (<n>-veces) Diluyente de muestra Solución de parada Συμπύκνωση (<n> φορές) Διάλυμα Αραίωσης Δειγμάτων Διάλυμα Αναστολής Substrate Substrat Substrat Substrato Sustrato Διάλυμα Υποστρώ ματος Microtiter plate Wash buffer Microplaque Mikrotiterplatte Piastre Placa microtiter Tampon de lavage Waschpuffer Soluzione di lavaggio Tampón de lavado Μικρόπλακα Πλυστικό Διάλυμα :01 2
3 1. Verwendungszweck Der Zytomegalie IgM ELISA dient dem Nachweis und der quantitativen Bestimmung von humanen IgM-Antikörpern gegen Zytomegalievirus im Serum oder Plasma ohne vorhergehende Extraktion. Dieser Test ist nur für in-vitro-diagnostische Anwendungen ausgelegt. Die Anwendung zum Monitoring von Transplantationsempfängern bzw. in anderen Körperflüssigkeiten wurde nicht evaluiert und erfolgt ggf. in alleiniger Verantwortung des Anwenders. Laborergebnisse können nie allein die Grundlage eines medizinischen Befundes bilden. Es müssen immer das klinische Bild sowie weitere Untersuchungen mit berücksichtigt werden. 2. Klinische Bedeutung Zytomegalie entsteht durch eine virale Infektion, die oft inapparent verläuft, bei immungeschwächten Menschen und Neugeborenen aber zu ernsthaften Krankheitsbildern führt. Das Zytomegalievirus (CMV) mit einer Partikelgröße von 100 nm (inklusive Hülle misst das Virion bis 200 nm) gehört wie HSV1 und HSV2 zu der Familie der Herpesviridae. Die Übertragung findet über Sputum sowie bei längerfristigen Intimkontakten statt. Die Inkubationszeit beträgt 2-10 Wochen für Primärinfektionen. Zytomegalie tritt häufig während der Gravidität auf, und es erkranken jährlich bis zu 5% der Schwangeren. In der Frühphase bleibt die Erkrankung oft unentdeckt und bei den betroffenen Frauen selbst treten keine Symptome auf. Werden dagegen die Neugeborenen angesteckt (1% der Geburten), zeigen diese in 10% der Fälle Infektionssymptome mit Spätschäden wie Retinitis, Schleimhautgeschwüre, virale Pneumonie, Hirnhautentzündungen, Mikroenzephalie, Hydrozephalus und Hautulzerationen. Die Inzidenz bei gebärfähigen Frauen liegt bei etwa 65%, so dass eine Überprüfung des Immunstatus vor der Schwangerschaft wichtig ist. Bei negativem Ergebnis wird eine Kontrolluntersuchung in der 20. Schwangerschaftswoche empfohlen. Neben der symptomatischen Behandlung ist eine spezifische Therapie mit Phosphonoformat und Ganciclovir möglich. Eine Impfung existiert nicht, so dass im Infektionsfall lediglich passiv CMV- Immunglobuline verabreicht werden. Die Diagnose erfolgt klinisch neben der Differentialdiagnostik der o.g. Symptome in Gewebsproben über sogenannte Eulenaugenzellen. Es stehen folgende Labormethoden zur Verfügung: KBR und ELISA, Virusnukleinsäurenachweis (PCR) sowie Virusisolierung (Zellkultur). Serologisch können die IgG und die IgM Antikörper mit der ELISA Technik nachgewiesen und quantifiziert werden. Auch eine Bestimmung der Avidität der IgG-Moleküle ist sinnvoll. 3. Testprinzip Der IMMUNOLAB Zytomegalie IgM Antikörper-Test basiert auf dem Prinzip des Enzymimmunoassays (EIA). Auf der Oberfläche der Mikrotiterstreifen ist Zytomegalievirus-Antigen gebunden. Verdünntes Patientenserum bzw. gebrauchsfertige Kalibratoren werden in die Vertiefungen der Mikrotiterplatte gegeben. Es findet eine Bindung zwischen den IgM-Antikörpern aus dem Serum und dem immobilisierten Zytomegalie-Antigen statt. Nach einer einstündigen Inkubation bei Raumtemperatur wird die Platte mit verdünnter Waschlösung gewaschen, um nichtgebundenes Material zu entfernen. Danach wird gebrauchsfertiges Anti-human-IgM-Peroxidase Konjugat zugegeben und 30 Minuten inkubiert. Nach einem weiteren Waschschritt wird eine Substratlösung (TMB) pipettiert und 20 Minuten inkubiert, wodurch in den Vertiefungen ein blauer Farbstoff entsteht. Die Farbentwicklung wird durch Zugabe einer Stopp-Lösung beendet, wobei ein Farbumschlag von blau nach gelb stattfindet. Die resultierende Farbe wird spektrophotometrisch bei 450 nm gemessen. Die Konzentration der IgM-Antikörper ist der Intensität der Färbung direkt proportional :01 3
4 4. Hinweise und Vorsichtsmaßnahmen Nur für in-vitro Anwendung! Nicht schlucken oder einnehmen! Die laborüblichen Sicherheitsvorschriften sowie die Verbote von Essen, Trinken und Rauchen im Labor sind zu beachten. Alle Seren oder Plasmen oder darauf basierenden Puffer wurden nach anerkannten Methoden auf HBsAg, HIV und HCV getestet und dabei als negativ befunden. Trotzdem sollten Vorsichtsmaßnahmen wie die Benutzung von Latexhandschuhen ergriffen werden. Serum- und Reagenzienreste sollten mit einer desinfizierenden Lösung (z.b. Natriumhypochlorit, 5 %) aufgewischt und vorschriftsgemäß entsorgt werden. Alle Reagenzien müssen vor der Testdurchführung auf Raumtemperatur (18-25 C) gebracht werden. Vor dem Pipettieren sollten alle Reagenzien durch leichtes Kippen oder Schwenken gemischt werden. Heftiges Schütteln mit Schaumbildung sollte vermieden werden. Wichtig ist die Einhaltung des Zeittaktes beim Pipettieren, so dass alle Ansätze in den Vertiefungen der Mikrotiterplatte den gleichen Bedingungen unterliegen. Bei der Entnahme der Reagenzien aus den Flaschen ist darauf zu achten, dass die Stopfen nicht kontaminiert werden. Außerdem ist auf eine mögliche Verwechslung zu achten. Der Inhalt der Fläschchen ist in der Regel oxidationsempfindlich, so dass sie nur für kurze Zeit geöffnet werden sollten. Zur Vermeidung einer Verschleppung oder Kreuzkontamination müssen separate Einmal- Pipettenspitzen verwendet werden. Es dürfen keine Reagenzien von verschiedenen Kitchargen verwendet und diese nicht miteinander vermischt werden. Alle Reagenzien sind innerhalb der Verfallszeit zu benutzen. In Übereinstimmung mit einer guten Laborpraxis (GLP) bzw. nach ISO9001 sollten regelmäßig alle verwendeten Laborgeräte auf Richtigkeit und Präzision überprüft werden. Dies betrifft u.a. Mikropipetten sowie Wasch- und Messgeräte (ELISA-Reader). Der Kontakt vor allem der Stopp-Lösung und des Substrats mit Haut, Auge und Schleimhäuten ist zu vermeiden, da mögliche Reizungen, Verätzungen oder Vergiftungsgefahr bestehen. 5. Inhalt des Testbestecks Komponenten Volumen / Menge MT PLATE Zytomegalie-Antigen beschichtete Mikrotiterstreifen 12 CAL Kalibratoren (Standards) : 1, 10, 40, 120 U/mL CONJ Anti-human-IgM-Enzymkonjugat SUBS Substratlösung STOP Stopp-Lösung SAMP DIL Probenverdünner 4 x 2 ml 15 ml 15 ml 15 ml 60 ml WASH BUF CONC Waschpuffer (10 ) 60 ml Plastikfolien 2 Plastikbeutel 1 Lagerung und Aufbrauchsfristen (Angabe der Verfallsdaten auf den Etiketten) Lagern Sie die Komponenten des Kits bei 2-8 C. Nach dem Gebrauch sollten die Platten verpackt, die Flaschen mit den zugehörigen Deckeln verschlossen und der Kit wieder bei 2-8 C gelagert werden. Der angebrochene Kit sollte innerhalb von drei Monaten verbraucht werden, der endverdünnte Waschpuffer hält 4 Wochen bei 2-8 C :01 4
5 5.1. MT PLATE Mikrotiterstreifen 12 Streifen mit je 8 abbrechbaren Vertiefungen, beschichtet mit Zytomegalie-Antigen (Stamm AD-169, kultiviert in MRC-5 Zellen aus menschlichen Lungen). Gebrauchsfertig CAL Kalibratoren A-D (Standards) 4 x 2 ml, menschliches mit PBS verdünntes Serum, mit 1, 10, 40, 120 U/mL an IgM-Antikörpern gegen Zytomegalievirus. Zusatz von 0,01 % Methylisothiazolon und 0,01 % Bromonitrodioxan. Gebrauchsfertig CONJ Anti-human-IgM-Enzymkonjugat 15 ml, Anti-human-IgM-POD (Kaninchen), in proteinhaltiger Pufferlösung. Zusatz von 0,01 % Methylisothiazolon, 0,01 % Bromonitrodioxan und 5 mg/l Proclin TM. Gebrauchsfertig SUBS Substratlösung 15 ml, TMB (Tetramethylbenzidin). Gebrauchsfertig STOP Stopp-Lösung 15 ml, 0,5 M Schwefelsäure. Gebrauchsfertig SAMP DIL Probenverdünner 60 ml, PBS/BSA Puffer. Zusatz von 0,095 % Natriumazid. Gebrauchsfertig WASH BUF CONC Waschpuffer 60 ml, PBS + Tween 20, als 10x Konzentrat. Gebrauchslösung: 1+9 mit dest. Wasser verdünnen. Falls bei der gekühlten Lagerung Kristalle ausfallen sollten, das Konzentrat 15 Minuten im Wasserbad (37 C) erwärmen Plastikfolien 2 Stück zur Abdeckung der Mikrotiterplatten während der Inkubation Plastikbeutel Verschließbar, für die trockene Lagerung der nichtbenutzten Streifen. 6. Erforderliche Geräte und Hilfsmittel 5 µl-, 100 µl- und 500 µl-mikro- bzw. Mehrkanalpipetten Mikrotiterplatten-Photometer (450 nm) Mikrotiterplatten-Waschgerät Reagenzgläser für die Serumverdünnung Bidestilliertes Wasser 7. Gewinnung, Vorbereitung und Aufbewahrung der Proben Grundsätzlich kann für die Bestimmung Serum oder Plasma (EDTA, Citrat) verwendet werden. Aus dem aseptisch durch Venenpunktion gewonnenen Blut wird nach der Gerinnung das Serum durch Zentrifugation abgetrennt. Die Serum- bzw. Plasma-Proben sind bis zu 2 Tagen gekühlt (2-8 C) haltbar; bei längerer Aufbewahrung sollten sie bei -20 C gelagert werden. Die Proben sollten nicht mehrmals eingefroren und aufgetaut werden. Lipämische, hämolytische, oder bakteriell kontaminierte Proben können zu falsch-positiven oder falsch-negativen Ergebnissen führen. Für die Durchführung des Tests werden die Proben (nicht die Standards) mit gebrauchsfertigem Probenverdünner 1:101 verdünnt (z.b. 5 µl Serum µl Probenverdünner). Wichtiger Hinweis: Zum Ausschluss falsch-positiver Reaktionen sollten positiv bestimmte Proben grundsätzlich mit einem geeigneten RF-Absorbens (z.b. Best.-Nr. ILE-MJS01) bestätigt werden :01 5
6 8. Testdurchführung 8.1. Vorbereitung der Reagenzien Waschlösung: vor der Benutzung 1:10 (1+9) mit bidest. Wasser verdünnen. Falls bei der gekühlten Lagerung Kristalle ausfallen sollten, das Konzentrat 15 Minuten im Wasserbad (37 C) erwärmen. Es wird empfohlen, Doppelbestimmungen durchzuführen. Die Reihenfolge der Pipettierschritte muss strikt eingehalten werden. Vor dem Pipettieren müssen die Reagenzien auf Raumtemperatur gebracht werden. Mit jedem Test muss eine Standardkurve erstellt werden. Nicht benötigte Antigen-beschichtete Mikrotiterstreifen sofort nach Entnahme der erforderlichen Menge wieder im verschließbaren Beutel mit Trockenmittel in den Kühlschrank stellen Einzelne Assay-Schritte 1. Für die Kalibratoren und die Proben im Doppelansatz sowie für einen Substratleerwert eine ausreichende Anzahl an Mikrotitervertiefungen vorbereiten. 2. Je 100 µl der verdünnten (1:101) Proben bzw. der gebrauchsfertigen Kalibratoren in die Vertiefungen pipettieren. Eine Vertiefung für den Substrat-Leerwert freilassen. 3. Platte mit der beiliegenden Folie abdecken und bei Raumtemperatur 60 Minuten inkubieren. 4. Vertiefungen der Platte entleeren (auskippen oder absaugen) und 300 µl endverdünnte Waschlösung dazugeben. Dieser Vorgang wird insgesamt dreimal durchgeführt. Waschpufferreste werden anschließend durch leichtes Ausschlagen der Mikrotiterplatte auf einem Zellstofftuch entfernt. 5. Je 100 µl des gebrauchsfertigen Konjugats in die Vertiefungen geben. Eine Vertiefung für den Substrat-Leerwert freilassen. 6. Platte mit der beiliegenden Folie abdecken und bei Raumtemperatur 30 Minuten inkubieren. 7. Vertiefungen der Platte entleeren (auskippen oder absaugen) und 300 µl endverdünnte Waschlösung dazugeben. Dieser Vorgang wird insgesamt dreimal durchgeführt. Waschpufferreste werden anschließend durch leichtes Ausschlagen der Mikrotiterplatte auf einem Zellstofftuch entfernt. 8. Je 100 µl des gebrauchsfertigen Substrats in die Vertiefungen geben. Diesmal auch den Substrat-Leerwert pipettieren. 9. Platte mit der beiliegenden Folie abdecken und bei Raumtemperatur im Dunkeln (z.b. Schublade) 20 Minuten inkubieren. 10. Zur Beendigung der Substratreaktion je 100 µl der gebrauchsfertigen Stopp-Lösung in die Vertiefungen geben. Auch den Substrat-Leerwert pipettieren. 11. Nach sorgfältigem Mischen und Abwischen des Plattenbodens erfolgt die Messung der Extinktion bei 450 nm (eventuell Referenzwellenlänge 620 nm). Die Farbe ist maximal 60 Minuten stabil. 9. Auswertung Es werden die Mittelwerte der gemessenen Extinktionen jeweils nach Abzug des Substrat- Leerwerts berechnet. Die Abweichung zwischen den Einzelwerten sollte unter 10 % liegen :01 6
7 Beispiel Substrat-Leerwert 0,020 Messwerte (OD) korr. Messwerte (OD) Mittelwert (OD) Kalibrator A (1 U/mL) 0,026 / 0,028 0,006 / 0,008 0,007 Kalibrator B (10 U/mL) 0,481 / 0,486 0,461 / 0,466 0,463 Kalibrator C (40 U/mL) 1,068 / 1,131 1,048 / 1,111 1,080 Kalibrator D (120 U/mL) 2,488 / 2,331 2,468 / 2,311 2,390 Es handelt sich um ein Beispiel, das unter zufälligen Temperatur- und Umgebungsbedingungen erstellt wurde. Die obige Tabelle enthält demnach keine Sollwerte, die in anderen Laboratorien in gleicher Art wiedergefunden werden müssen Qualitative Auswertung Die o.g. berechneten Extinktionen für die Patientenproben werden mit dem Wert für den Cut-Off Standard (10 U/mL) verglichen. Liegt das Ergebnis der Probe höher, handelt es sich um ein positives Resultat. Bei einem Wert unterhalb des Cut-Off Standards liegt ein negatives Resultat vor. Es hat sich als sinnvoll erwiesen, einen Bereich von +/- 20% um den Wert des Cut-Offs als Grauzone zu definieren. Liegt ein solcher Fall vor, ist eine Wiederholung des Tests mit dem gleichen Serum oder mit einer nach 2-4 Wochen neu abgenommenen Probe des Patienten zu empfehlen. Beide Proben sollten parallel in einem Testansatz gemessen werden Quantitative Auswertung Die gebrauchsfertigen Kalibratoren des Zytomegalie-IgM-Antikörper Kits sind auf Units (U/mL) eingestellt worden. Dies ermöglicht eine exakte und reproduzierbare quantitative Auswertung. Auch Verlaufskontrollen für einen gegebenen Patienten sind hiermit möglich. Die Werte für die Kalibratoren sind auf den Etiketten der Fläschchen angegeben. Zur Auswertung werden die Extinktionen der Kalibratoren gegen ihre Konzentrationen graphisch aufgetragen. Aus der resultierenden Eichkurve kann dann für die Extinktion jeder Patientenprobe das entsprechende Konzentrations-Ergebnis abgelesen werden. Es können auch automatische Rechnerprogramme eingesetzt werden. 10. Testcharakteristika Zytomegalie ELISA IgM Intra-Assay-Präzision 9,9 13,8 % Inter-Assay-Präzision 2,7 26,6 % Inter-Lot-Präzision 1,2 22,7 % Analytische Sensitivität 1,03 U/mL Wiederfindung % Linearität % Kreuzreaktivität Keine Kreuzreaktivität gegen Rubella, Toxoplasma, Masern, Mumps, Varizella, Parainfluenza und EBV-VCA. Interferenzen von dsdna IgG positiven Proben und Proben von Spendern mit akuter EBV-Infektion können nicht vollständig ausgeschlossen werden :01 7
8 Interferenzen Keine Interferenzen mit Bilirubin bis zu 0,3 mg/ml, Hämoglobin bis zu 8,0 mg/ml und Triglyzeriden bis zu 5,0 mg/ml Klinische Spezifität 98 % Klinische Sensitivität 100 % 11. Literatur 1. Almeida, L. N. et al.: Cytomegalovirus seroepidemiology in an urban community of Sao Paulo, Brazil. Rev. Saude Publica 35(2): 124 (2001). 2. Boeckh, M. et al.: Quantitation of cytomegalovirus: methodologic aspects and clinical applications. Clin. Microbiol. Rev. 11: 533 (1998). 3. Bryant, P. et al.: Cytomegalovirus transmission from breast milk in premature babies: does it matter? Arch. Dis. Child. Fetal Neonatal Ed. 87: 75 (2001). 4. Genser, B. et al.: Evaluation of five commercial enzyme immunoassays for the detection of human cytomegalovirus-specific IgM antibodies in the absence of a commercially available gold standard. Clin. Chem. Lab. Med. 39(1): 62 (2001). 5. Joassin, L. et al.: Elimination of nonspecific cytomegalovirus immunoglobulin M activities in the enzyme-linked immunosorbent assay by using anti-human immunoglobulin. J. Clin. Microbiol. 23(3): 576 (1986). 6. Nielsen, S. L. et al.: Improvement of serological diagnosis of neonatal cytomegalovirus infection by simultaneously testing for specific immunoglobulins E and M by ab-capture enzyme-linked immunosorbent assay. J. Clin. Microbiol. 25(8): 1406 (1987). 7. Pappin, A. et al.: Stability of cytomegalovirus antibodies in plasma during prolonged storage of blood components. Clin. Diagn. Lab. Immunol. 2(1): 25 (1995). 8. Revello, M. G. et al.: Diagnosis and Management of Human Cytomegalovirus Infection in the Mother, Fetus, and Newborn Infant. Clin. Microbiol. Rev. 15: 680 (2002). 9. Ronholm, E. et al.: Detection of immunoglobulin G antibodies to cytomegalovirus antigens by antibody capture enzyme-linked immunosorbent assay. J. Clin. Microbiol. 24(6): 998 (1986). 10. de Souza, S. et al.: Evaluation of an in-house specific immunoglobulin G (IgG) avidity ELISA for distinguishing recent primary from long-term human cytomegalovirus (HCMV) infection. Rev. Inst. Med. Trop. Sao Paulo 45(6): 323 (2003). 11. Spector, S. A. et al.: Plasma cytomegalovirus (CMV) DNA load predicts CMV disease and survival in AIDS patients. J. Clin. Investig. 101: 497 (1998). 12. van Zanten, J. et al.: Humoral immune response against human cytomegalovirus (HCMV)- specific proteins after HCMV infection in lung transplantation as detected with recombinant and naturally occurring proteins. Clin. Diagn. Lab. Immunol. 2(2): 214 (1995) :01 8
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