Arbeitsblatt 1 Teil 1

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2 Arbeitsblatt 1 Teil 1 Klonierung Schneiden und Religieren der DNA Bevor Sie anfangen, prüfen Sie ob alle Materialen vorhanden, bzw. eingeschaltet oder beschriftet sind: - Isolierende Styroporkiste mit Eis gefüllt - Plasmid DNA pkw1 (wie geliefert) - Restriktionsenzym EcoRI (immer auf Eis) - 10fach konzentrierter Spaltungspuffer (EcoRI- Puffer) - Ligase T4 (immer auf Eis) - Ligase-Puffer* (enthält ATP; im Freezer aufbewahren; vor Versuchsbeginn vollständig auftauen, dann auf Eis) - ddh O - feiner Folienschreiber (Edding) - Eppendorfhütchen - 0 µl-pipette - gelbe Spitzen (nicht mit den Fingern berühren!!!!) - Wärmebad 37 C (optimal Heizblock) Temperatur erreicht? - Denaturierungsbad 65 C (optimal Heizblock) Temperatur erreicht? - Zentrifuge (optional) Achtung: Sie müssen ab jetzt steril arbeiten. Informieren Sie sich gründlich, was das bedeutet! Kennzeichnen Sie auf einem Eppendorfhütchen den bevorstehenden Spaltungsansatz mit Hilfe eines feinen Folienschreibers. Fügen Sie mittels einer 0µl-Pipette und jeweils neuen Spitzen die unten aufgelisteten Substanzen in der angegebenen Reihenfolge in das Eppendorfhütchen zusammen. - (17-x) µl ddh O (Achtung: Die Konzentration der Plasmid DNA variiert; sie wird bei Lieferung stets neu angegeben.) - µl EcoRI-Puffer - 1 µl EcoRI - x µl Plasmid DNA (Achtung: Die Konzentration der Plasmid DNA variiert; sie wird bei Lieferung stets neu angegeben.) Mischen Sie die Lösungen durch mehrfaches, vollständiges Aufziehen in die 0 µl-pipettenspitze (Pipette auf 0 µl einstellen). Fortsetzung Arbeitsblatt 1 - Teil

3 Klonierung Arbeitsblatt 1 Teil Schneiden und Religieren der DNA (Fortsetzung) Stellen Sie das Reaktionsgefäß für mindestens 1 Stunde in das 37 C- Wärmebad. Geben Sie nun das Eppendorfhütchen für 10 min in das 65 C- Denaturierungsbad. Sie können an dieser Stelle unterbrechen und den Ansatz bei 0 C einfrieren. Sie können auch ein Aliquot abnehmen, um es in der Gelelektrophorese zu analysieren. Sie können aber auch gleich weiterarbeiten: Kennzeichnen Sie nun ein weiteres Eppendorfgefäß für den Ligationsansatz. Überführen Sie in das Eppendorfgefäß die folgenden Substanzen in der angegebenen Reihenfolge: - 7 µl ddh O - µl Ligase-Puffer (vollständig aufgetaut?) - 1 µl T4-Ligase - 10 µl des denaturierten EcoRI-Spaltungsansatzes (Achtung: Der Ansatz muss vollständig aufgetaut sein, wenn Sie ihn aus dem 0 C Kühlschrank genommen haben.) Mischen Sie die Lösungen durch mehrfaches, vollständiges Aufziehen in die 0 µl-pipettenspitze (Pipette auf 0 µl einstellen). Lassen Sie die Lösung für mindestens eine Stunde bei Raumtemperatur stehen. Alternativ können Sie den Ansatz auch über Nacht im Kühlschrank bei 4 C inkubieren. Sie können jetzt entsprechend Arbeitsblatt weiterarbeiten oder Ihren Ligationsansatz durch Einfrieren konservieren. * Der Ligase-Puffer wird von verschiedenen Herstellern unterschiedlich geliefert. Er kann fünf- oder zehnfach konzentriert sein. Es empfiehlt sich in jedem Fall, kleinere Aliquots herzustellen und diese separat einzufrieren. Die Aliquots tauen schneller auf und die Frische ist erheblich länger gewährleistet, weil die Disproportionierung des ATP durch Auftauen verstärkt wird.

4 Klonierung Arbeitsblatt - Teil 1 Herstellen kompetenter Zellen Bevor Sie anfangen, prüfen Sie ob alle Materialen vorhanden, bzw. eingeschaltet oder beschriftet sind: - Bakterienstamm E.coli XL1-blue (ohne Antibiotikaresistenz!!) als Plattenausstrich [Einzelkolonien] - 6 Reagenzgläser - 5 ml Glaspipette mit Saug-/Auslaufvorrichtung - 6 sterile Rührschweinchen - LB-Medium (sterilisiert, mindestens 50 ml) - 37 C Wärmebad auf Magnetrührer Temperatur erreicht? - 00µl-Pipette mit Spitzen - 4 Eppendorfhütchen (1,5 ml) - feiner Folienschreiber (Edding) - Isolierende Styroporkiste mit Eis gefüllt - Abfallglas - eiskalte 70mM CaCl -Lösung (mindestens 1 ml) Achtung: Sie müssen ab jetzt steril arbeiten. Informieren Sie sich gründlich, was das bedeutet! Kennzeichnen Sie vier Reagenzgläser mit "Übernachtkultur XL1"; eines mit Kontrolle Geben Sie je ein steriles Rührschwein in die fünf Reagenzgläser. Füllen Sie nun 5 ml LB-Medium in jedes der fünf Reagenzgläser. Picken Sie viermal mit einer aufgesteckten Mikropipettenspitze je eine der Einzelkolonien (Bakterienstamm XL1-blue) des Plattenausstrichs und geben Sie die abgestrichenen Zellen samt Spitze in das Reagenzglas. Werfen Sie eine gelbe Spitze ohne das Abstreichen von Zellen in das fünfte Reagenzglas ( Kontrolle ) Befestigen Sie die Reagenzgläser im 37 C-warmen Wärmebad über dem Magnetrührer. Aktivieren Sie die Rührautomatik und kontrollieren Sie die Wärmeregelung (37 C?). Lassen Sie die Bakterienanzucht über Nacht laufen. Fortsetzung Arbeitsblatt - Teil

5 Klonierung Arbeitsblatt Teil Herstellen kompetenter Zellen (Fortsetzung) Die Bakterien benötigen mindestens 16 Stunden um zu ausreichenden Mengen aufzuwachsen. Wenn von den vier Übernachtkulturen ein Glas klar geblieben ist, hatten Sie Ihre Kolonie verfehlt. Für diesen Fall haben Sie die Reserven. Achtung: Wenn das Kontrollglas gleichfalls eine trübe Lösung enthält, müssen Sie den Versuch abbrechen! WARUM??? Beschriften Sie ein neues Reagenzglas mit "Frischkultur XL1" und geben Sie ein steriles Rührschwein in das Inkubationsgefäß. Füllen Sie 18 ml LB-Medium in das für die Frischkultur vorgesehene Glas. Wählen Sie eine Übernachtkultur aus, schütteln Sie diese auf und pipettieren Sie ml dieser Suspension in das vorbereitete Glas Frischkultur. Lassen Sie die Frischkultur für 3 bis 4 Stunden bei angeschaltetem Magnetrührer im 37 C-warmen Wärmebad wachsen. Beschriften Sie nun 4 Eppendorfhütchen wie folgt: Einmal mit "θ", einmal mit " blau", einmal mit " weiß" und zuletzt mit "Ligation". Füllen Sie die 4 Eppendorfhütchen jeweils vollständig mit der Frischkultur* Stellen Sie jetzt die Eppendorfhütchen für 5 min auf Eis. Zentrifugieren Sie anschließend die Gefäßchen für 4 min bei rpm. Kippen Sie den Überstand vorsichtig in das Abfallglas und saugen Sie die Restflüssigkeit behutsam mit der Spitze der Mikropipette ab. Überführen Sie 100 µl eiskalte CaCl -Lösung in jedes Eppendorfhütchen und resuspendieren Sie vorsichtig durch Ansaugen und Ausdrücken des Pellet- Lösungs-Gemisches bis zur gleichmäßigen Verteilung der Zellen. Stellen Sie die Eppendorfhütchen für 15 min auf Eis. Zentrifugieren Sie die Reaktionsgefäße für 4 min bei rpm. Kippen Sie den Überstand vorsichtig ab und entnehmen Sie die Restflüssigkeit behutsam mit der Spitze der Mikropipette ab. Geben Sie 100 µl eiskalte CaCl -Lösung in jedes Eppendorfgefäß und resuspendieren Sie durch vorsichtiges Ansaugen und Ausdrücken der Zellen. Stellen Sie die Eppendorfhütchen für weitere 0 min auf Eis. Sie sind nun für die Transformation kompetent. Die Zellen bleiben ohne weiteres bis zum nächsten Tag kompetent, wenn Sie auf Eis aufbewahrt werden. * Sie können an dieser Stelle auch mit 8, bzw. 1 Eppendorfhütchen arbeiten, sodass Sie bei Bedarf am Ende die doppelte, bzw. die dreifache Menge kompetenter Zellen zur Verfügung haben. Arbeitsblatt 3 Teil 1

6 Klonierung Plattengießen Bevor Sie anfangen, prüfen Sie ob alle Materialen vorhanden, bzw. eingeschaltet oder beschriftet sind: - 10 Petrischalen - Agar - NaCl - Peptone - Hefeextrakt - ca. 400 ml dh O - eine 500 ml-glasflasche mit Schraubverschluss, wahlweise auch alter 500 ml-erlenmeyerkolben mit Alu-Folienverschluss - feiner Folienschreiber (Edding) - elektrische Waage - Autoklaviereinrichtung (Schnellkochtopf) - Bunsenbrenner und Feuerzeug - 00 µl-pipette mit Spitzen - Ampicillin (100 mg/ml in ddh O) - 5-Brom-4-chlor-3-indolyl-ß-D-galaktosid [kurz: "X-Gal"] (0 mg/ml in N- N-Dimethylformamide) - IPTG ( 0 mg/ml in ddh O) Beschriften Sie die 500 ml-liter-glasflasche mit "LB". Wiegen Sie 6 g Agar, 4 g NaCl, 4 g Peptone und g Hefeextrakt ab und geben Sie die Substanzen in Ihrer 500 ml-glasflasche zusammen. Fügen Sie nun 400 ml dh O zu. Verschließen Sie die Flasche und schütteln Sie diese. Autoklavieren Sie nun Ihre leicht geöffnete Flasche mit LB-Medium im Schnellkochtopf für 0 min. Achtung: Sie müssen ab jetzt steril arbeiten. Informieren Sie sich gründlich, was das bedeutet! Lassen Sie anschließend Ihr LB-Medium auf ca. 50 C abkühlen. Beschriften Sie nun die Unterseiten von Platten mit "nur LB". Entzünden Sie den Bunsenbrenner. Stellen Sie die gelbe Flamme ein. Positionieren Sie ihn so, dass am gesamten Arbeitsplatz heiße Luft aufsteigt. Fortsetzung Arbeitsblatt 3 Teil

7 Klonierung Arbeitsblatt 3 - Teil Plattengießen (Fortsetzung) Gießen Sie nun zügig soviel LB-Medium in die Platte bis eine Füllhöhe von ca. 5 mm erreicht ist und die Flüssigkeit den Schalenboden komplett bedeckt. Flammen Sie jetzt kurz (nicht die Schalen schmelzen!) mit blauer Flamme die Oberfläche des LB-Mediums ab, um etwaige Keime zu töten und um Blasen zu entfernen. Decken Sie unmittelbar danach die Petrischalen nur LB ab. Regeln Sie den Brenner zur gelben Flamme und stellen Sie ihn wieder direkt neben das Experimentiergeschehen. Setzen Sie anschließend zu dem restlichen ca. 350 ml LB-Medium 350 µl Ampicillin (Endkonz. 100 µg/ml Amp), 875 µl X-Gal (Endkonz. 50 µg/ml X-Gal) und 175 µl IPTG bei (Endkonz. 10 µg/ml IPTG). Vervollständigen Sie nun die Flaschenbeschriftung "LB" zu "LB + Amp" und kennzeichnen Sie die restlichen 8 Petrischalen mit "+ Amp". Gießen Sie jetzt zügig diese 8 Platten bis zu einer Füllhöhe von ca. 5mm, wonach die Plattenböden komplett bedeckt sein sollten. Flammen Sie nun kurz (nicht die Schalen schmelzen!) mit blauer Flamme die Oberfläche des LB-Mediums ab, um etwaige Keime zu töten und um Blasen zu entfernen. Deckeln Sie wieder diese Petrischalen sofort nach Abflammen zu. Der Bunsenbrenner kann jetzt abgestellt werden. Lassen Sie nun alle gegossenen Petrischalen bis zur leichten Verfestigung des Agars abkühlen. Überschüssiges Kondenswasser kann vor Gebrauch durch einfachen Abschlag entfernt werden. Die Platten sind jetzt gebrauchsfertig. Sie sind zur Lagerung geeignet, wenn sie in Folie umgekehrt im Kühlschrank gestapelt werden.

8 Arbeitsblatt 4 Teil 1 Klonierung Transformation (Einbringen der DNA) Bevor Sie anfangen, prüfen Sie ob alle Materialen vorhanden, bzw. eingeschaltet oder beschriftet sind: - 4 Eppendorfhütchen (Beschriftung: θ, pkw1, pkw, Ligation) - 1 LB-Platte ohne Amp (Beschriftung Boden: "nur LB") - 7 LB-Platten mit Amp, IPTG, X-Gal (Beschriftung Boden: "+ Amp") - 00 µl-pipette mit Spitzen - pkw1 Plasmid DNA (5 ng/µl) - pkw Plasmid DNA (5 ng/µl) - Glasspatel und Bunsenbrenner - 0 ml-becherglas mit 70%igem Ethanol - Brutschrank mit 37 C Temperatur erreicht? - feiner Folienschreiber (Edding) - LB-Medium Achtung: Sie müssen ab jetzt steril arbeiten. Informieren Sie sich gründlich, was das bedeutet! Stellen Sie die Eppendorfhütchen auf Eis Fügen Sie zu den einzelnen Eppendorfhütchen folgende Lösungen hinzu : θ pkw1 pkw Ligation Unverändert belassen 4 µl gelieferte DNA von pkw1 4 µl gelieferte DNA von pkw 10 µl DNA Ihres Ligationsansatzes (Achtung: Sorgfältig arbeiten; jeweils eine neue Spitze benutzen, vor dem Entleeren in die Lösung eintauchen, entleeren und verwerfen) Mischen Sie vorsichtig durch Anschnipsen von Hand. Stellen Sie anschließend die Eppendorfhütchen für 15 min auf Eis. Stellen Sie nun die Hütchen für 5 min in das 37 C-Wärmebad. Stellen Sie die Eppendorfgefäße für 5 min auf Eis. Fügen Sie je 500µl LB-Medium in die Eppendorfgefäße, mischen und stellen Sie diese für 45 min in ein 37 C-Wärmebad. Fortsetzung Arbeitsblatt 4 Teil

9 Klonierung Arbeitsblatt 4 Teil Transformation (Ausstreichen von Bakterien) Pipettieren Sie in die Mitte der Petrischale "nur LB" 60µl der Suspension aus dem Eppendorfgefäß "Ligation" und streichen Sie die Bakteriensuspension sehr vorsichtig mit Hilfe des Spatels bis zur vollständigen Deckung aus. Typische, handwerkliche Fehler lassen sich sofort an den großen Ackerfurchen auf dem Agar erkennen. Sie sind durchaus vermeidbar! Nun müssen Sie die Beschriftungen ("+ Amp") der anderen Petrischalen vervollständigen. Kennzeichnen Sie diese zusätzlich wie folgt: 1. θ / 5 % - 30 µl / Datum. pkw1 / 5 % - 30 µl / Datum 3. pkw1 / 10 % - 60 µl / Datum 4. pkw/ 5 % - 30 µl / Datum 5. pkw/ 10 % - 60 µl / Datum 6. Ligation / 5 % - 30 µl / Datum 7. Ligation / 10 % - 60 µl / Datum Pipettieren Sie in die Mitte dieser Petrischalen die entsprechenden Suspensionen der jeweiligen Eppendorfgefäße zu. Achten Sie auf die richtigen, zugehörigen Mengen (30, bzw. 60 µl) und streichen Sie die Bakteriensuspensionen auf dem LB-Medium sehr vorsichtig bis zur vollständigen Deckung aus. Achtung: Tauchen Sie den Spatel vor einer neuen Plattierung in Ethanol, flammen Sie den Spatel ab und warten Sie bis der Spatel abgekühlt ist.) Lassen Sie die ausplattierten Bakterienkulturen über Nacht im 37 Cwarmen Brutschrank mit dem Deckel nach unten stehen. Zählen Sie am folgenden Tag die gewachsenen Kulturen aus und notieren Sie sich Ihre Beobachtungen in der vorgegebenen Tabelle.

10 Klonierung Arbeitsblatt 4 Tabelle Transformation (Auswertung) Siehe Excel-Tabelle Blue Genes

11 Arbeitsblatt 5 Anzucht von Bakterien mit Plasmid-DNA Picken und Animpfen weißer Kolonien Bevor Sie anfangen, prüfen Sie ob alle Materialen vorhanden, bzw. eingeschaltet oder beschriftet sind: - Agarplatte mit den Einzelkolonien der Platten "Ligation / 5 % - 30 µl / Datum" oder "Ligation / 10 % - 60 µl / Datum" - feiner Folienschreiber (Edding) - 7 Reagenzgläser mit Alukappen eindeutig beschriftet - ca. 5 ml LB-Medium mit Ampicillin (Endkonzentration 100 µg/ml Amp) - 5 ml-pipette mit Saug-/Auslaufvorrichtung - Mikropipette - Spitzenkasten mit mindestens 7 sterilen gelben Spitzen - 7 sterile Rührschweinchen - Magnetrührer mit Wärmebad (37 C) Temperatur erreicht? Achtung: Sie müssen ab jetzt steril arbeiten. Informieren Sie sich gründlich, was das bedeutet! Werfen Sie je ein steriles Rührschwein in die 7 Reagenzgläser. Pipettieren Sie in jedes Reagenzglas 3 ml Nährlösung (LB-Medium mit Amp). Wählen Sie von der Agarplatte mit den Einzelkolonien willkürlich eine weiße Kolonie aus und streichen Sie diese vorsichtig mit einer gelben Spitze ab (vorher steril an die Mikropipette aufstecken und nun nicht mehr berühren!). Überführen Sie die Spitze mit Hilfe der Abwurfmechanik z.b. in die erste Nährlösung, also in das Reagenzglas mit Ihrer Gruppennummer und der Nr. 1. Bedecken Sie das Reagenzglas nun mit der Alukappe. Wiederholen Sie die Prozedur für fünf weitere Kolonien. Werfen Sie in Reagenzglas 7 eine sterile gelbe Spitze, ohne vorher eine Kolonie abzuimpfen (Beschriftung: Gruppennummer und negative Kontrolle ). Rühren Sie nun über Nacht bei 37. Kontrollieren Sie nach 14 bis 0 Stunden, ob Ihre 6 Kulturen hochgewachsen sind (deutliche Trübung) und ob Ihre negative Kontrolle klar geblieben ist. Sie können die Kolonien jetzt direkt weiterbearbeiten oder im Kühlschrank aufbewahren. Wenn die negative Kontrolle gleichfalls eine Trübung zeigt, müssen Sie den Versuch abbrechen. Beginnen Sie noch einmal, diesmal unter Berücksichtigung der Grundsätze des sterilen Arbeitens.

12 Arbeitsblatt 6 Teil 1 Gewinnung von Plasmid-DNA aus E.coli Bakterienzellen Isolieren von Plasmid-DNA Bevor Sie anfangen, prüfen Sie ob alle Materialen vorhanden, bzw. eingeschaltet oder beschriftet sind: - 1 Eppendorfhütchen (1,5 ml) - Schüttelnetz (Waschbrett, Ständer u.ä.) - Tischzentrifuge - Abfallflasche - feiner Folienschreiber (Edding) - ausgezogene Pasteurpipette - Aufnahme- und Lysierungspuffer P1 (50 mm Tris. HCl ph 8, 10 mm EDTA, 100 µg/ml RNaseA) - Denaturierungspuffer P (00mM NaOH, 1% SDS) - Neutralisierungspuffer P3 (3M Kaliumacetat ph 5,5) - Isopropanol (mindestens 5 ml) µl Pipette mit blauen Spitzen - Ethanol (mindestens 6ml) - 75%iges Ethanol - ddh O (mindestens 1 ml) Beschriften Sie sechs Eppendorfhütchen wie Ihre Reagenzgläser. Schütteln Sie Ihre Über-Nacht-Kulturen auf, sodass Sie eine gleichmäßige Trübung beobachten. Überführen Sie die zugehörige Kultur durch Dekantieren in die 6 beschrifteten Eppendorfhütchen (bis knapp unter den Rand füllen). Zentrifugieren Sie 5 min in der Tischzentrifuge bei Höchstgeschwindigkeit. Kippen Sie die Überstände in die Abfallflasche. Es sammeln sich bald Reste. Schlagen Sie diese Flüssigkeitsreste in die Abfallflasche ab. Resuspendieren Sie das Pellet in 50 µl P1 durch festes Streichen des geschlossenen Eppendorfhütchen über das Schüttelnetz oder durch Auf- und Abziehen mit der 1000 µl Pipette (blaue Spitze). Denaturieren Sie die DNA durch Zugabe von 50 µl P, vermischen Sie vorsichtig durch Überkopfdrehen. Belassen Sie das Gemisch 3 bis 5 min bei Raumtemperatur. Achtung: Wenn Sie die Proben nacheinander bearbeiten, können Sie quasi sofort mit Probe 1 den nächsten Schritt (die Neutralisierung) durchführen, nachdem Sie in Probe 6 P zugegeben haben. Fortsetzung Arbeitsblatt 6 Teil

13 Arbeitsblatt 6 Teil Gewinnung von Plasmid-DNA aus E.coli Bakterienzellen Isolieren von Plasmid-DNA (Fortsetzung) Neutralisieren Sie durch Zugabe von 50 µl P3. Hier müssen Sie jetzt gut Schütteln (festes Streichen über Schüttelnetz). Zentrifugieren Sie danach Ihre 6 Proben bei Höchstgeschwindigkeit für 0 min. Übertragen Sie während des Zentrifugenlaufs die jeweiligen Beschriftungen auf 6 neue Eppendorfhütchen, die Sie anschließend mit jeweils mit 450µl Isopropanol füllen. Achtung: Isopropanol löst blitzschnell die Farbe des Folienschreibers. Sorgen Sie dafür, dass die Beschriftung erhalten bleibt. Überführen Sie Überstand der Zentrifugation in die zugehörigen, neuen jeweils mit 450 µl Isopropanol befüllten Eppendorfhütchen. Beachten Sie, dass es besser ist, weniger klare Flüssigkeit als irgendwelche trüben Anteile zu überführen. Schließen Sie das Gefäß gut und mischen Sie durch mehrmaliges Überkopfschütteln. Achtung: Isopropanol löst blitzschnell die Farbe des Folienschreibers. Zentrifugieren Sie für 15 min bei Höchstgeschwindigkeit. Kippen Sie nun den Überstand in die Abfallflasche ab. Ziehen Sie die Restflüssigkeit mit einer ausgezogenen Pasteur-Pipette ab. Waschen Sie das Pellet mit 1 ml 75%igem Ethanol, indem Sie die Flüssigkeit vorsichtig zugeben und dreimal Überkopfschütteln. Ziehen Sie in direktem Anschluss das Alkohol-Wasser-Gemisch wieder ab. Schleudern Sie das nasse Eppendorfhütchen ganz kurz in der Tischzentrifuge. Stellen Sie eine gelbe Spitze in die Restflüssigkeit. Diese wird durch Kapillarkräfte aufgesaugt. Entfernen Sie die gelbe Spitze. Sie können alternativ wieder mit der ausgezogenen Pasteur-Pipette die Restflüssigkeit abnehmen. Trocknen Sie das Pellet im offenen Hütchen entweder mehrere Stunden bis über Nacht bei RT oder 30 bis 60 min bei 37 C im Wärmeschrank. Geben Sie in jedes Eppendorfhütchen 100µl ddh O zu, schütteln Sie möglichst gut, und schleudern Sie die Lösung durch kurzes Zentrifugieren in die Hütchenspitze. Sie können nun Ihre DNA unbegrenzt einfrieren (-0 C). Im Kühlschrank sollte sie nur aufbewahrt werden, wenn Sie gleich weiterarbeiten wollen.

14 Arbeitsblatt 7 Molekularbiologische Charakterisierung EcoRV-Spaltung von Plasmid-DNA Bevor Sie anfangen, prüfen Sie ob alle Materialen vorhanden, bzw. eingeschaltet oder beschriftet sind: - Isolierende Styroporkiste mit Eis gefüllt - Restriktionsenzym EcoRV - 10fach konz. Puffer III-Lösung - 10fach konz. BSA-Lösung - ddh O - 6 * isolierte DNA aus transformierten Bakterien - 7 Eppendorfhütchen - feiner Folienschreiber (Edding) - optional: Tischzentrifuge - Wärmebad 37 C Da Ihre DNA-Wasser-Gemische mit identischen Spaltungsansätzen behandelt werden, können Sie zunächst einen Gesamt-Vormix erstellen und diesen dann entsprechend auf Ihre Ansätze aufteilen. Das Verfahren dient der Ersparnis an teurem Enzym. Üblicherweise machen sie einen 7-fachen Ansatz; warum? Beschriften Sie dazu ein Eppendorfgefäß mit "Vormix". Geben Sie folgende Substanzen in angegebener Reihenfolge in Ihrem Vormix- Gefäß zusammen: - [3,5 * (Anzahl Ihrer Ansätze + 1)] µl ddh O - [ * (Anzahl Ihrer Ansätze + 1)] µl 10fach konz. Puffer III-Lösung - [ * (Anzahl Ihrer Ansätze + 1)] µl 10fach konz. BSA-Lösung - [0,5 * (Anzahl Ihrer Ansätze + 1)] µl EcoRV Mischen Sie nun Ihren Vormix gut (schütteln). Schlagen Sie anschließend die Flüssigkeit in die Hütchenspitze oder nutzen Sie dazu wahlweise eine Tischzentrifuge. Nummerieren Sie 6 weitere Eppendorfgefäße von 1 bis 6 durch und kennzeichnen Sie diese zusätzlich mit Ihrer kurzen Gruppenbezeichnung. Teilen Sie nun Ihren Vormix in 8 µl-portionen auf Ihre Eppendorfhütchen auf. Sie können dazu eine einzige Pipettenspitze benutzen. Fügen Sie anschließend jedem 8 µl-vormix-gemisch 1 µl des entsprechenden DNA-Wasser-Gemisches bei (immer neue Spitzen!!!) Mischen Sie erneut gut durch Schütteln. Schlagen Sie anschließend die Flüssigkeit in die Hütchenspitze oder nutzen Sie dazu wahlweise eine Tischzentrifuge. Lassen Sie die Reaktionsgefäße für 1 Stunde im 37 C-warmen Wärmebad stehen.

15 Arbeitsblatt 8 Teil 1 Molekularbiologische Charakterisierung Gel-Elektrophorese Bevor Sie anfangen, prüfen Sie ob alle Materialen vorhanden, bzw. eingeschaltet oder beschriftet sind: - Agarose - Elektrophoresepuffer TBE (enthält als Einfachpuffer 55 mm Borsäure, 89 mm Tris. HCl ph 8, und mm EDTA) - 6 Eppendorfhütchen mit EcoRV-geschnittenen DNA-Lösungen - Glycerin-Farbmarker-Beschwerungs-Gemisch (Blaumarker: 50 % Glycerin, ~ 1 % Bromphenolblau) - Azurblau-Lösung - dh O - gefärbter 1 kb-größenmarker ml-glasflasche ( klar durchsichtig!!!)/erlenmeyerkolben - feiner Folienschreiber (Edding) - elektrische Waage ml-messzylinder - Mikrowelle - Backhandschuhe - Elektrophorese-Apparatur (Netzteil, Bad mit Deckel, Kabel, Kämme, Schlitten) - Mikropipette mit Spitzen - optional: Frischhaltefolie - glattwandige Plastikschale - Latexhandschuhe - Digitale Fotografie-Einrichtung Beschriften Sie die 500 ml-glasflasche mit "1 % Agarose TBE". Stellen Sie die Flasche offen auf eine elektrische Waage und geben Sie so lange Agarose zu, bis das Gewicht um 1,0 g angestiegen ist. Fügen Sie zur Agarose mit Hilfe eines Messzylinders 100 ml TBE-Pufferlösung zu. Wiegen und notieren Sie nun das Gesamtgewicht von Flasche und Inhalt. Schließen Sie die Flasche und schütteln Sie diese kräftig. Stellen Sie die Flasche in die Mikrowelle und schrauben Sie den Deckel ein wenig locker, sodass Luft entweichen kann. Kochen Sie nun das Gemisch mindestens 3 min auf, sodass die Agarose vollständig gelöst ist. Fortsetzung Arbeitsblatt 8 Teil

16 Arbeitsblatt 8 Teil Molekularbiologische Charakterisierung Gel-Elektrophorese (1. Fortsetzung) Nehmen Sie die Flasche mit den Backhandschuhen aus der Mikrowelle und schwenken diese so lange, bis die Agarose-Schlieren verschwinden. Achtung: Dabei kann Wasserdampf entweichen!!! Gegebenenfalls müssen Sie das Agarose-TBE-Gemisch weitere Male kochen und schwenken. Abschließend sollten Sie verloren gegangenes, verdampftes Wasser ausgleichen, indem Sie die nun leichtere Flasche auf die Waage stellen und bis zum notierten Ausgangsgewicht mit dh O auffüllen. Schwenken Sie noch einmal die Flasche und lassen Sie die Lösung auf ca. 50 C abkühlen. In der Zwischenzeit setzen Sie die Keile und die Kämme ein Kämme möglichst nahe am schwarzen (-) Pol. Kippen Sie nach Abkühlen die 50 C warme Agarose-TBE-Gellösung zügig in den Schlitten bis die Kammspitzen ungefähr 3 mm tief eintauchen. Das sind ~3 ml Agarose-Lösung. Reste können für weitere Gele aufbewahrt werden. Fahren Sie mit einer Pipettenspitze entlang beider Kammseiten, um Blasen zu entfernen. Entfernen Sie auch alle anderen Blasen der Gellösung. Ziehen Sie nach Erstarren des Agarose-Gels die Keile und belassen Sie den Schlitten in der vorgegebene Position der Gel-Elektrophoresekammer. Füllen Sie nun die Gel-Elektrophoresekammer mit TBE-Lösung soweit auf, dass die Füllhöhe über Ihrem Agarose-Gel ungefähr 3 mm beträgt. Ziehen Sie jetzt vorsichtig die Kämme aus dem Gel. Setzen Sie Ihren DNA-Proben jeweils 4 µl Blaumarkerlösung zu, und mischen Sie. Füllen Sie die mittlere Spur des Gels mit 15 µl des angefärbten 1 kb-marker durch Einführen der Pipettenspitze bis kurz über den Geltaschenboden und anschließendem Ausdrücken der Lösung. Achtung: Drücken Sie keine Luft aus der Spitze, da die Blasen die soeben eingebrachte Lösung wieder aus der Geltasche heraustreiben. Nehmen Sie unmittelbar vor dem Füllen einer Geltasche eine auf 1 µl eingestellte Mikropipette zur Hand, drücken diese nun an die im jeweiligen Hütchen befindliche Spitze und mischen Sie die durch Aufziehen und Ausdrücken. Benutzen Sie die eingestellte Pipette samt gleicher Spitze auch zum Füllen der entsprechenden Geltasche. Achtung: Nach Möglichkeit keine Randspuren belegen, um etwaigen Randeffekten vorzubeugen. Fortsetzung Arbeitsblatt 8 Teil 3

17 Arbeitsblatt 8 Teil 3 Molekularbiologische Charakterisierung Gel-Elektrophorese (. Fortsetzung) Füllen Sie in gruppenübergreifender Zusammenarbeit so viele Geltaschen wie möglich mit entsprechenden Spaltungsansätzen auf. Motto: Möglichst viele auf ein Gel! Schließen Sie nach Füllen der Geltaschen die Gel-Elektrophoresekammer an das Netzteil an und stellen Sie dieses auf ca. 80mV ein. Prüfen Sie die Laufrichtung durch Überlegen und während der Startphase durch Beobachtung. Wohin läuft die DNA? Bei falscher Polung sofort stoppen und umpolen. Starten Sie die Gel-Elektrophorese und notieren Sie sich die Startzeit. Stellen Sie die Gel-Elektrophorese ab wenn die blaugefärbten Spuren kurz vor einem Herauslaufen aus dem Gel stehen und notieren Sie sich die Endzeit. Achtung: Sollte die Zeit zur Vollendung der Gel-Elektrophorese nicht reichen, können Sie das Gel samt Schlitten in Frischhaltefolie einpacken und im Kühlschrank bis zur Fortsetzung des Versuches lagern. Geben Sie soviel Azurblau-Lösung in die Plastikwanne, dass das Gel darin vollständig eintauchen kann. Lassen Sie nun das Gel vorsichtig vom Schlitten in die Azurblau-Lösung gleiten, indem Sie den Schlitten knapp über den Flüssigkeitsspiegel halten und ggf. von einer Seite her das Gel vom Schlitten schieben. Baden Sie jetzt das Gel für ca. 15 min in der Azurblau-Lösung. Kippen Sie die Azurblau-Lösung zurück in die Flasche. Halten Sie dabei das Gel fest. Achtung: Nur mit geschützten Händen; Latex-Handschuhe tragen. Füllen Sie nun dh O in die Wanne; benutzen Sie etwa die gleiche Menge wie bei der Azurblau-Lösung. Beobachten Sie auf das allmähliche Verschwinden der totalen Blaufärbung des Gels und das Hervortreten von Banden (ca. 30 min). Eventuell müssen Sie mehrfach waschen. Längere Waschzeiten sind hier sogar von Nutzen, warum? Werten Sie nun die Banden aus und notieren Sie sich die jeweilige Anzahl der verschiedenen Bandenkombinationen. Vergleichen Sie mit dem beigefügten 1 kb Größenmarker Profil.