G e n o m i k. Genomik?! Tobias Schäfer Institut für f. r Biochemische Verfahren und Analysen (IBVA)

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1 Institut für f r Biochemische Verfahren und Analysen (IBVA)

2 Genomik?! Tobias Schäfer Institut für f r Biochemische Verfahren und Analysen (IBVA)

3 Inhalt Methoden der Gensequenzierung Nutzen genetischer Daten für die Medizin

4 Was ist Genomik? Erforschung des Genoms Genom = Genetische etische Informationen in den Chrom omosomenosomen Ablesen von Nukleotidsequenzen (z.b. AACATGTAGAGCGT ) 4

5 Genexpression 5

6 Methoden Klassische Sequenzierung nach Sanger oder Maxam/Gilbert Hochdurchsatz-Sequenzierung Pyrosequenzierung am Beispiel von Roche/454 Sequencing by Oligonucleotide Ligation and Detection (SOLID) Next Generation Sequencing Single Molecule Real Time (SMRT) DNA sequencing technology 6

7 Sequenzierungsablauf 1. DNA-Isolierung 2. Klonierung oder PCR-Amplifikation 3. DNA-Aufreinigung 4. Fragmentsequenzierung 5. Rekonstitution der Gesamtsequenz 6. Fehlerkorrektur und Datenanalyse 7

8 Sanger-Methode entwickelt von Frederick Sanger Sequenzierung des ersten Virusgenoms Nobelpreis

9 Sanger-Methode Kettenabbruchverfahren Prinzip: basenspezifisch terminierte DNA- Fragmente werden nach Molekülgröße getrennt 4 parallele Reaktionen: einzelsträngiger Template-DNA (Plasmid) Primer (meist universeller Primer für das Plasmid) DNA-Polymerase Nukleotid-Mix (datp, dctp, dgtp, dttp) je einem fluoreszenzmarkiertem Terminator Auswertung: Elektrophoretische Trennung 9

10 Sanger-Methode Auswertung Bandenmuster der elektrophoretischen Auftrennung ergibt Basensequenz der untersuchten DNA 10

11 Sanger-Methode Vorteile lange Sequenzen (circa 1000 bp) relativ hohe Genauigkeit Nachteile teuer und arbeitsintensiv bedingt für Hochdurchsatz geeignet (1 Mb/d) 11

12 Pyrosequenzierung Prinzip Hybridisierung von ssdna mit Primer DNA-Synthese erzeugt Diphosphate (engl.: Pyrophosphate, PP i ) Enzymatische Signalkette Sulfurylase erzeugt ATP aus PPi und APS (Substrat) Luciferase bildet Oxyluciferin unter Chemiluminsezenz (Licht) Optische Detektion 12

13 Pyrosequenzierung 13

14 Pyrosequenzierung 14

15 Pyrosequenzierung 15

16 Pyrosequenzierung 16

17 Pyrosequenzierung 17

18 Pyrosequenzierung 18

19 Pyrosequenzierung 19

20 Pyrosequenzierung 20

21 Pyrosequenzierung Probleme Hoher Verbrauch an Materialien (Nukleotide, Chemikalien) Euro pro Lauf Längere Sequenzen sind schwer aufzulösen und führen oft zu Lesefehlern Leselänge (100bp bis 400bp) relativ kurz Hoher bioinformatischer Aufwand bei der Aufbereitung der Daten 21

22 Methodenvergleich 22

23 Nutzen der Genomanalyse Humanes Genom seit 2003 vollständig entschlüsselt Methoden zur Untersuchung von Krankheiten Chromosomen-Kartierung und DNA-Sequenzierung Methoden zur Bestimmung der Identität Genetischer Fingerabdruck (Fragmentlängenanalyse) RFLP-Analyse (Restriktionsfragmentlängenpolymorphismus) AFLP-Analyse (amplifizierter Fragmentlängenpolymorphismus) STRs (short tandem repeats) SNPs (single nucleotide polymorphisms) derzeit Gentest pro Jahr für monogenetische Erkrankungen in BRD 23

24 Nutzen der Genomanalyse Zusammenhang zwischen Genom und Gesundheit Studien: Mutationen korrelieren mit Krankheiten Mutationsanalyse als diagnostisches Werkzeug Genetische Prädispositionen -> Früherkennung Personalisierte Medizin durch Mutationsscreening von krankheitsassoziierten Genen 24

25 Mutationsscreening Kommerzielle Angebote für Privatpersonen (23andme, decodeme, navigenics) ab 429 US-Dollar für 137 Marker Ergebnisse nach 2-4 Wochen: statistische Wahrscheinlichkeit im Vergleich zum Durchschnittsrisiko umfassende Informationen zur Interpretation 25

26 Mutationsscreening 26

27 Mutationsscreening 27

28 Beispiel 1: Krebs Ionisierende Strahlung verursacht DNA-Schäden DNA-Schäden können Tumorbildung auslösen DNA-Reparatursystem und programmierter Zelltod (Apoptose) bei irreversiblen DNA-Schäden als Schutz Träger von Mutationen in Tumorsuppressorgenen haben ein schwächeres Reparatursytem Wahrscheinlichkeit der Tumorbildung im Vergleich zur durchschnittlichen Erkrankungsrate erhöht 28

29 Brustkrebs Mutationen in den BRCA-Genen sind Risikofaktoren für das erblich-bedingte Mammakarzinom BRCA1: 5-10 % der Fälle (patentiert) ATM-BRCA3: % d. F. Gentests erkennen Mutationen in den Risikogenen Kosten: 1500 Euro BRCA1/2, bei Risikofamilien von Krankenkassen übernommen 29

30 Brustkrebs Empfehlungskriterium für einen Gentest ist die familiäre Belastung mind. zwei Frauen mit Brustkrebs, davon eine vor dem 51. Lebensjahr drei Frauen mir Brustkrebs unabhängig vom Alter eine Erkrankung vor dem 31. Lebensjahr ein Fall von beidseitigem Brustkrebs vor dem 41. Lebensjahr ein Fall von Eierstockkrebs vor dem 41. Lebensjahr ein Fall von Eierstock- und Brustkrebs ein männlicher Verwandter mit Brustkrebs mind. zwei Fälle von Eierstockkrebs

31 Brustkrebs Patienten mit genetischer Prädisposition werden präventive Maßnahmen empfohlen Medikamentöse Prophylaxe Estrogenrezeptormodulator soll Risiko für Östrogen- Rezeptor-positive Formen um 50% reduzieren Operative Prophylaxe beidseitige Entfernung der Eierstöcke beidseitige Entfernung der Brüste (Restrisiko < 10 %) Früherkennungsuntersuchungen (Mammographie, Sonographie, Kernspintomographie) 31

32 Beispiel 2: Epilepsie Die meisten Epilepsieformen sind i.d.r. keine Erbkrankheiten Multifaktorielle Erkrankung Umwelteinflüsse ungünstige genetische Faktoren (keine Mutationen im klassischen Sinne) Sonderfall: familiäre nächtliche Frontallappenepilepsie sehr selten, autosomal dominant vererbt Mutation in neuronalen nikotinischen Acetylcholinrezeptor Ansatz für neue Therapieformen? 32

33 Offene Fragen Genomik Gentests Kommerz Identifizierung weiterer Risikogene Funktionelle Charakterisierung der Risikogene Verständnis der genauen Zusammenhänge zwischen Risikogenen und Auftreten von Erkrankungen kontroverse Diskussion über Relevanz der statistischen Wahrscheinlichkeiten und über Möglichkeiten der sinnvollen Anwendung negative Ergebnisse aus Gentests sind keine Entwarnung Datenschutz der Ergebnisse Patentierung von Genen zur Erhebung von Lizenzgebühren für Gentest 33

34 Diskussion Es müsse aber deutlich gemacht werden, dass die Genomforschung erst ganz am Anfang stehe, die Ergebnisse müssten mit Vorsicht betrachtet werden. Wer ein Risiko entdeckt, sollte demnach einen Experten aufsuchen. Anne Wojcicki, 23andMe. Es sollte im Ermessen des Einzelnen liegen, wie viel er über seine Gene wissen möchte. Anne Wojcicki, 23andMe. Wir weisen aber darauf hin, dass wir nur einzelne Erbgutveränderungen überprüfen und keine vollständige Genomanalyse machen. Ob es wirklich zu einer Erkrankung kommt, hängt von sehr vielen weiteren Faktoren ab. Anne Wojcicki, 23andMe. Wenn sich Patienten beim Hausarzt testen lassen, wollen Versicherer diese Resultate ab 2011 ebenso erfahren wie die Ergebnisse herkömmlicher Untersuchungen wie Blutdruckmessung oder Ultraschall. Der Patient solle kein "Insiderwissen" aus den Gentestergebnissen haben und sich damit Vorteile auf Kosten der Gemeinschaft der Versicherten verschaffen. Achim Regenauer, Münchener Rückversicherung. 34

35 Institut für f Biochemische Verfahren und Analysen (IBVA)

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