Ein Verfahren für BAC DNA-Aufreinigung im Hochdurchsatz zur Genomkartierung von Dicentrarchus labrax

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1 Ein Verfahren für BAC DNA-Aufreinigung im Hochdurchsatz zur Genomkartierung von Dicentrarchus labrax vorgelegt von Diplom-Ingenieur Heiner Kuhl Von der Fakultät III Prozesswissenschaften der Technischen Universität Berlin zur Erlangung des akademischen Grades Doktor der Ingenieurswissenschaften -Dr. Ing.- genehmigte Dissertation Promotionsausschuss: Vorsitzender: Prof. Dr. Helmut Görisch Berichter: Prof. Dr. Roland Lauster Berichter: PD Dr. Lorenz Adrian Tag der wissenschaftlichen Aussprache: Berlin 2008 D83

2 Diese Arbeit wurde durchgeführt am Max-Planck-Institut für Molekulare Genetik Berlin In der Arbeitsgruppe von Dr. Richard Reinhardt

3 Hiermit erkläre ich an Eides Statt, dass ich die vorliegende Arbeit selbst angefertigt habe. Die aus fremden Quellen direkt oder indirekt übernommenen Gedanken sind als solche kenntlich gemacht. Heiner Kuhl Berlin, den

4 DANKSAGUNG Diese Arbeit entstand in der Zeit vom 1. Mai 2004 bis zum 30. November 2007 in der Arbeitsgruppe von Dr. Richard Reinhardt am Max-Planck-Institut für Molekulare Genetik, Berlin. Ihm danke ich für die vielfältigen technischen Möglichkeiten, welche mir in seiner Arbeitsgruppe geboten wurden und für die verantwortungsvollen Aufgaben, die er mir anvertraute. Für technische Unterstützung bedanke ich mich aufs Herzlichste bei allen Mitarbeitern der Arbeitsgruppe von Dr. Reinhardt. Besonderer Dank gilt dabei Gregor Wozniak für die Programmierung der verschiedenen Roboter. Dr. Bernd Timmermann, Anna Kosiura und Isabelle Kuehndahl möchte ich für die Unterstützung bei der DNA-Sequenzierung auf dem Roche GS20-System danken. Dr. Alfred Beck, Dr. Michael Kube und Sven Klages danke ich für bioinformatische Tipps und Tricks. Ebenso tausend Dank an Beatrice Baumann, Birol Köysüren, Steffen Wiechert und Janina Thiel, die mit ihrer Arbeit zum reibungslosen Ablauf der Sequenzierung von Dicentrarchus labrax beitrugen! Herrn PD Dr. Lorenz Adrian und Herrn Professor Dr. Roland Lauster sei für die Betreuung dieser Arbeit seitens der Technischen Universität Berlin herzlich gedankt. Meiner Freundin Margot Kasper danke ich für die Jahre in Berlin und für Ihre immer wieder erfolgreichen Aufmunterungsversuche in schwierigen Phasen der Doktorarbeit.

5 I INHALTSVERZEICHNIS 1. EINLEITUNG Bedeutung des Probendurchsatzes für die Genomsequenzierung Sequenzierungstechnologien der zweiten Generation DNA-Templates als limitierender Faktor der Sanger-Sequenzierung PCR Rolling Circle Amplifikation Plasmid-Isolation Aufreinigung von Plasmid-DNA im Hochdurchsatz Magnetische Partikel Adsorption an Silica-Membranen Präzipitation mit Alkoholen und direkte Sequenzierung aus Zelllysat Größenselektive DNA-Präzipitation in PEG / Salz Gemischen Plasmid-Aufreinigung durch größenselektive Präzipitation PCR-Produktaufreinigung durch größenselektive Präzipitation Automatisierung der PEG-Methode und ihre Grenzen Kartierung eukaryotischer Genome mit Hilfe von BAC-Klonen BAC-Filterhybridisierung BAC-Klon Fingerprinting Komparative Kartierung mit BAC-Endsequenzen Der Wolfsbarsch - Dicentrarchus labrax Fortgeschrittene Fischgenomprojekte für komparative Studien mit D. labrax Ziel der Arbeit... 18

6 II 2. MATERIAL UND METHODEN Verwendete Materialien und Geräte Chemikalien Enzyme und Reaktionspuffer Besondere Verbrauchsmaterialien Primer für die Sequenzierung Längenmarker für die Agarose-Gelelektrophorese Geräte Puffer und Lösungen BAC-Bibliothek von D. labrax Genomsequenzen von T. nigroviridis, O. latipes und G. aculeatus Untersuchungen von PEG-Präzipitationsmethoden Größenselektive DNA-Präzipitation in PEG / NaCl-Gemischen Größenselektive DNA-Präzipitation in PEG / MgCl 2 -Gemischen Größenselektive DNA-Präzipitation in PEG / Kaliumacetat-Gemischen und Substitution von PEG durch 2-Propanol Aufreinigung von Plasmid-DNA durch größenselektive Fällung in PEG / KAcetat / 2-Propanol-Gemischen Aufreinigung von PCR-Produkten in PEG / KAcetat / 2-Propanol Größenselektive Präzipitation von DNA für die Shotgun-Klonierung Steigerung der Fosmid-DNA Ausbeute d. induzierbare high-copy Replikation DNA-Sequenzierung Sequenzierung von Plasmid-DNA Sequenzierung von Fosmid-DNA und BAC-DNA Ethanol / NaAcetat-Fällung von Sequenzierungsprodukten Parameter für Sequenzanalyse auf dem ABI3730xl-System Sequenzierung eines Pools von 109 BACs auf dem Roche GS20-System CsCl-Gradientenzentrifugation von BAC-DNA Bioinformatische Datenanalyse Anordnung von D. labrax BAC-Endsequenzen auf den Genomen von Tetraodon nigroviridis, Oryzias latipes und Gasterosteus aculeatus Komparative Genomkartierung von D. labrax auf G. aculeatus Abgleich von genetischer Kopplungskarte und komparativer Karte Abgleich der Radiation Hybrid-Kartierung von S. aurata und G. aculeatus Prozessierung der Sanger-Sequenzdaten... 38

7 III Assemblierung von BAC-Shotgun-Sequenzierungen Hybridassemblierung von GS20 und Sanger-Sequenzdaten ERGEBNISSE Analyse der PEG-Präzipitation Größenselektive DNA-Präzipitation in PEG / NaCl-Gemischen Größenselektive DNA-Präzipitation in PEG / MgCl 2 -Gemischen Größenselektive DNA-Präzipitation in PEG / Kaliumacetat-Gemischen und partielle Substitution von PEG durch 2-Propanol Plasmid-DNA Aufreinigung in PEG / Kaliumacetat / 2-Propanol-Gemischen Aufreinigung von PCR-Produkten in PEG / KAcetat / 2-Propanol Weitere Anwendungen der größenselektiven Präzipitation Automatisierung der Plasmid-, Fosmid- und BAC-Aufreinigung Das 96-Well Format Das 384-Well Format Endsequenzierung von Fosmiden und BACs Steigerung der Fosmid Ausbeute durch induzierbare high-copy Replikation Vergleich von Fosmid-Endsequenzierung mit und ohne Induktion BAC-Endsequenzierung Komparative Kartierung von Dicentrarchus labrax mit BAC-Endsequenzen Anordnung der D. labrax BAC-Endsequenzen auf Referenzgenomen Komparative Kartierung von D. labrax BAC-Klonen auf G. aculeatus Verifikation von angeordneten BAC Klonen Abgleich von genetischer und komparativer Karte von D. labrax Vergleich der Radiation Hybrid Kartierung von S. aurata mit G. aculeatus Sequenzierung von 109 BACs durch das GS20-System Hybridassemblierung von Sanger- und GS20-Sequenzdaten eines D. labrax Chromosoms Beispiele anhand der Methode erfolgreich durchgeführter Kooperationen EST-Sequenzierung Fosmid-Endsequenzierung für die Genomanalyse von G. forsetii Genomsequenzierung eines Archaebakteriums des rice-cluster-i durch Metagenomanalyse mit Hilfe von Fosmid-Endsequenzen... 67

8 IV 4. DISKUSSION Phasendiagramme der PEG-Präzipitation Das PEG / NaCl-System Das PEG / MgCl 2 -System Das PEG / KAcetat-System Fällungsparameter für die Plasmid-Präparation Fällungsparameter für die PCR-Produkt Aufreinigung Weitere Anwendungsmöglichkeiten der größenselektiven Präzipitation Automatisierung durch Robotik Das 96er MTP-Format Das 384er MTP-Format Sequenzierung unter Verwendung von unterschiedlichen Vektortypen Plasmid-Sequenzierung Fosmid-Endsequenzierung BAC-Endsequenzierung Komparative Genomkartierung von Dicentrarchus labrax Referenzgenome Alignment der Endsequenzen auf T. nigroviridis und G. aculeatus Die komparative Genomkarte von D. labrax Abgleich von genetischer Kopplungskartierung und komparativer Kartierung Verifikation von angeordneten BAC Klonen Rückschlüsse auf die Genomgröße von D. labrax Nutzung von ultra-hochdurchsatz Sequenzierungstechniken Ausblick ZUSAMMENFASSUNG QUELLEN... 96

9 V ABBILDUNGSVERZEICHNIS Abb. 1: Prinzip der DNA-Aufreinigung mit magnetischen Partikeln Abb. 2: Eines der automatisierten Systeme für die SPRI-Aufreinigung am JGI... 7 Abb. 3: Glasfilterplatte für die Plasmid-DNA-Aufreinigung... 7 Abb. 4: Sequentielle und parallele Fällung sonifizierter DNA nach Lis et al Abb. 5.: Zusammenhang zwischen DNA-Konzentration und Ausbeute bei der größenselektiven Präzipitation von DNA in PEG / NaCl Abb. 6: Der Wolfsbarsch Dicentrarchus labrax Abb. 7: Stammbaum der Knochenfische Abb. 8: Parameter der Plasmid, Fosmid und BAC Sequenzanalyse auf ABI3730xl- Geräten Abb. 9: Größenselektive Präzipitation von DNA in 1 M und 0,3 M NaCl bei unterschiedlichen PEG-Konzentrationen Abb. 10: Fällungsgrenzen der größenselektiven DNA-Präzipitation in PEG / NaCl Abb. 11: Fällungsgrenzen der größenselektiven DNA-Präzipitation in PEG / MgCl Abb. 12: Fällungsgrenzen der größenselektiven DNA-Präzipitation in PEG / KAcetat Abb. 13: Größenselektive Fällung von DNA in Lösungen mit konstanter PEG- und KAcetat- Konzentration, durch Zusatz von variierenden Mengen 2-Propanol Abb. 14: Messung der Absorption bei 260 nm von unterschiedlich gefällten Plasmid- Präparationen Abb. 15: Vergleich von Plasmid-Präparation mit und ohne RNAse Abb. 16: Korrigierte Messwerte von Präparationen plasmid-haltiger Zellen Abb. 17: Leseweiten der Sequenzierung von PEG / 2-Propanol aufgereinigter Plasmide. 47 Abb. 18: Größenselektive Fällung von PCR-Produkten Abb. 19: Selektion von sonifizierten DNA-Fragmenten im Bereich von 1-4 kb durch größenselektive Fällung Abb. 20: Anhand der Sequenzdaten ermittelte Insertgrößenverteilung von 4 BAC-Shotgun- Banken Abb. 21: Roboteranlage für Plasmid-, Fosmid- und BAC-DNA Aufreinigung im 96er MTP- Format Abb. 22: Schematische Darstellung der automatisierten Plasmid-Aufreinigung im 96er Format Abb. 23: Aufbau der BigRobby -Anlage zur automatisierten Plasmid-Aufreinigung im 384er-Format Abb. 24: Schematische Darstellung der automatisierten Plasmid-Aufreinigung im 384er MTP-Format... 52

10 VI Abb. 25: Schema des durch die PEG / 2-Propanol-Aufreinigungsmethode vereinfachten Ablaufs Abb. 26: Zelldichte von L-Arabinose induzierten copy control Fosmid-Klonen in Abhängigkeit von Inkubationszeit und Medienzusammensetzung Abb. 27: Vergleich von Fosmid-Endsequenzierungen im 96er MTP- und im 384er MTP- Format Abb. 28: Leseweitenverteilung von Endsequenzen einer BAC-Bank des D. labrax Genoms Abb. 29: Elektropherogramm einer BAC-Endsequenzierung Abb. 30: Menge der auf verschiedenen Fischgenomen angeordneten BAC-Endsequenzen in Prozent Abb. 31: Genomweite Darstellung der komparativen Karte von D. labrax auf den Chromosomen von G. aculeatus Abb. 32: Vergleich von durch komparative Kartierung auf G. aculeatus vorhergesagten Koordinaten von BAC-Endsequenzen und realen Koordinaten auf D. labrax Abb. 33: Abgleich der genetischen Kopplungskarte von D. labrax und dem Genom von G. aculeatus Abb. 34: Unterschiede des Sequencing Coverage der 1000 größten Contigs eines Pools von 109 auf dem GS20-System sequenzierten BAC-Inserts Abb. 35: PEG / NaCl-Phasendiagramm für die Löslichkeit von DNA unterschiedlicher Fragmentgrößen Abb. 36: PEG / MgCl 2 -Phasendiagramm für die Löslichkeit von DNA unterschiedlicher Fragmentgrößen Abb. 37: PEG / Kaliumacetat-Phasendiagramm für die Löslichkeit von DNA unterschiedlicher Fragmentgrößen Abb. 38: Durchmischung von hochkonzentrierter PEG / NaCl-Lösung mit Plasmid-DNA durch Einwirkung der Schwerkraft Abb. 39: Anzahl einseitig und beidseitig sequenzierter BAC-Klone Abb. 40: Vergleich der Anordnung von BAC-Endsequenzen auf dem Genom von T. nigroviridis und G. aculeatus Abb. 41: Grafische Darstellung des Bereichs aus Tab Abb. 42: Vergleich homologer Chromosomen von T. nigroviridis, S. aurata und G. aculeatus, sowie komparativer BAC-Karte von D. labrax Abb. 43: Genstruktur der cyp19-aromatase Isoformen, welche auf bassbac-27g15 und bassbac-22g15 identifiziert wurden Abb. 44: Alignment eines 1,3 Mb Scaffold von D. labrax auf G. aculeatus und T. nigroviridis durch VISTA

11 VII Abb. 45: Darstellung der Verteilung virtueller Insertgrößen beidseitig angeordneter BACs auf Genomen von T. nigroviridis, G. aculeatus und O. latipes Abb. 46: Vergleich von Sequenzierungsergebnissen des GS20-Systems Abb. 47: Vista Alignment der Sequenzdaten von 109 BACs, welche mit dem GS20 System gepoolt sequenziert wurden Abb. 48: Entwicklung des Sequenzierungsdurchsatzes am MPI f. Molekulare Genetik

12 VIII TABELLENVERZEICHNIS Tab. 1: Vor- und Nachteile von alternativen Methoden zur Produktion von Template-DNA für die Sanger-Sequenzierung... 5 Tab. 2: Einflussparameter auf die größenabhängige DNA-Fällung in PEG / NaCl Gemischen nach Lis et al Tab. 3: Versuchsreihen zur Bestimmung von Eigenschaften der PEG / NaCl-Fällung Tab. 4: Schrittweise Erhöhung der PEG-Konzentration in den einzelnen NaCl- Versuchsreihen Tab. 5: Versuchsreihen zur Bestimmung von Eigenschaften der PEG / MgCl 2 -Fällung.. 26 Tab. 6: Schrittweise Erhöhung der PEG-Konzentration in den einzelnen MgCl 2 - Versuchsreihen Tab. 7: Versuchsreihen zur Bestimmung von Eigenschaften der PEG/KAcetat-Fällung. 27 Tab. 8: Schrittweise Erhöhung der PEG-Konzentration in den einzelnen KAcetat- Versuchsreihen Tab. 9: Versuchsreihen zur Bestimmung von Eigenschaften der PEG / Kaliumacetat- Fällung in Gegenwart von 2-Propanol Tab. 10: Schrittweise Erhöhung der 2-Propanol-Konzentration in den einzelnen Versuchsreihen mit Kaliumacetat / PEG Tab. 11: Versuchsreihen zur Bestimmung von Fällungsparametern zur Plasmid-DNA Aufreinigung in PEG / Kaliumacetat / 2-Propanol Tab. 12: Plasmidsafe-Reaktionsansätze zum Verdau von linearer genomischer DNA Tab. 13: Reaktionsbedingungen für die Reparatur der Enden von gescherter DNA Tab. 14: Ligationsansatz für die Erstellung von Shotgun-DNA-Banken Tab. 15: Zusätze für die verzögerte Induktion der high-copy Replikation von pcc1fos- Vektoren Tab. 16: Sequenzierungsreaktion für Plasmid-DNA Tab. 17: Temperaturprogramm für die Sequenzierung von Plasmid-DNA Tab. 18: Modifizierter Sequenzierungsansatz für BACs und Fosmide Tab. 19: Ergebnisse des D. labrax BAC-Endsequenzierungsprojekts Tab. 20: Oxford-Plot von 460 Markern der S. aurata Radiation Hybrid-Kartierung auf den Chromosomen von G. aculeatus Tab. 21: Typische Ausbeuten und Leseweiten bei unterschiedlichen Vektorkonstrukten. 78 Tab. 22: Tabellarische Darstellung von angeordneten BAC-Endsequenzen auf dem Genom von G. aculeatus

13 IX ABKÜRZUNGSVERZEICHNIS 2-prop 2-Propanol Ab Absorption AFLP amplified fragment-length polymorphism AG Arbeitsgruppe Abb. Abbildung b Basen BAC bacterial artificial chromosome Baylor HGSC Baylor Human Genome Sequencing Center; USA bp Basenpaare cdna komplementäre DNA CGE capillary gelelectrophoresis, Kapillargelelektrophorese Chr Chromosom Contig lückenlose Sequenzdaten, welche aus überlappenden kürzeren Sequenzen zusammengesetzt sind d day, Tag ddntp Didesoxynukleotid DNA Desoxyribonukleinsäure dntp Desoxynukleotid EDTA Ethylendiamintetraessigsäure ES Endsequenz EST expressed sequence tag et al. et alteri FLI Fritz-Lipmann-Institut, Jena G Erdbeschleunigung (9,81 m/sek 2 ) GBF Gesellschaft für Biotechnologische Forschung, Braunschweig h hours, Stunden HZI Helmholtz Zentrum für Infektionsforschung, Braunschweig IMB Institut für Molekulare Biotechnologie, Jena JGI Joint Genome Institute, USA kb Kilobasen Mb Megabasen Mbp Megabasenpaare MPI Max-Planck-Institut MTP Mikrotiterplatte OD Optische Dichte

14 X ORF Ori PCR PA PEG PVDF RCA RC-I RH RIKEN RNA rpm RT RZPD SDS s SNP SPRI Tab. TBE TE TIGR TRIS HCl UV VBA v/v w/v wga WGS YAC YT λ-dna open reading frame origin of replication, Replikationsursprung polymerase chain reaction, Polymerase-Kettenreaktion Polyacrylamid Polyethylenglycol Polyvinylidenfluorid rolling circle Amplifikation Rice Cluster I radiation hybrid Institute of Physical and Chemical Research, Japan Ribonukleinsäure rotations per minute, Umdrehungen pro Minute Raumtemperatur Deutsches Ressourcenzentrum für Genomforschung Sodium-dodecyl-sulfate, Natriumdodecylsulfat Sekunden single nucleotide polymorphism solid phase reversible immobilization Tabelle TRIS-Borat-EDTA TRIS-EDTA The Institute for Genome Research, USA Tris (hydroxymethyl) aminomethan Hydrochlorid Ultraviolettstrahlung Visual Basic for Applications Volumen pro Volumen Gewicht pro Volumen whole genome amplification whole genome shotgun Yeast artificial chromosome Yeast Tryptone Erbgut des Phagen Lambda

15 Einleitung: Bedeutung des Probendurchsatzes für die Genomsequenzierung 1 1. Einleitung 1.1. Bedeutung des Probendurchsatzes für die Genomsequenzierung Nach der Aufklärung der DNA-Struktur 1953 (1) und der Entschlüsselung des genetischen Codes (2) wurden schnelle Methoden benötigt, die die Basenabfolge in DNA- Molekülen bestimmen konnten. Die Arbeiten von Frederick Sanger (3) sowie Maxam und Gilbert (4) ermöglichten die Bestimmung der Sequenz von DNA-Fragmenten gegen Ende des Jahres Mit Entwicklung der Polymerase-Kettenreaktion (PCR) ab 1983 (5, 6) konnte die Sanger- Methode weiter verbessert werden, in dem man die Sequenzierungsreaktion als Cycle- Sequencing in Thermocyclern durchführte. Durch Nutzung von Fluoreszenzfarbstoffen für die Markierung der ddntps setzte sich die Sanger-Methode endgültig gegenüber der Maxam- Gilbert-Methode durch, da die Arbeitsschritte ohne Radioaktivität durchgeführt wurden und die Methode besser automatisiert werden konnte. Die Leseweite von DNA-Fragmenten ist mit der Sanger-Methode auf ca b limitiert, woraus resultierte, dass für die Sequenzierung größerer DNA-Moleküle Klonierungsstrategien entwickelt werden mussten. Die Shotgun-Klonierung (7) ist ihr bekanntester Vertreter. Die geringe Leseweite bei der Sequenzierung kann mit der Shotgun-Methode durch eine Vielzahl von Sequenzierungen zufällig überlappender Fragmente des ursprünglichen DNA-Strangs kompensiert werden. Im Durchschnitt musste jede Base großer DNA-Moleküle statistisch betrachtet mindestens 10fach sequenziert werden, um die Basenabfolge des Moleküls aus kurzen überlappenden Sequenzen lückenlos zu rekonstruieren. Methoden, die höhere Leseweiten erzielten als die Sequenzierung nach Sanger, waren und sind bisher nicht bekannt. Die weitere Entwicklung der Sequenzierungstechnologien musste also durch massive Parallelisierung vorangetrieben werden. Vor 1990 war nur die Sequenzierung kleiner viraler Genome und Plasmide möglich. Erst in den 90er Jahren konnten polyacrylamidgel-basierte Sequenzierroboter bis zu 96 Proben in ca h parallel bearbeiten und ermöglichten es, bakterielle Genome mit vertretbaren Zeitaufwand zu sequenzieren ( Sequenzierungen) (8). Ab 1999 nutzten Sequenzierroboter die Kapillargelelektrophorese (9), um den Probendurchsatz bei geringerem Personalbedarf weiter zu steigern. Durch internationale Kooperation wurde es möglich, das menschliche Genom innerhalb weniger Jahre zu entschlüsseln (>30 Mio. Sequenzierungen) (10, 11). In den letzten Jahren wurden neue Sequenzierungstechnologien entwickelt, welche auf hohe Durchsatzsteigerung bei kürzeren Leseweiten ausgelegt sind.

16 Einleitung: Sequenzierungstechnologien der zweiten Generation Sequenzierungstechnologien der zweiten Generation Mittlerweile sind verschiedene DNA-Sequenzierer der zweiten Generation erhältlich, welche DNA-Sequenzierung im ultra-hochdurchsatz ermöglichen ( Mb pro Gerätelauf). Im Vergleich zur Sanger-Sequenzierung liefern diese Geräte relativ kurze Sequenzdaten von b. Durch die parallele Analyse von unterschiedlichen DNA-Molekülen können die Nachteile der kurzen Sequenzen aber zum Teil ausgeglichen werden. Das Einsatzgebiet der neuen Technologien ist abhängig von der Art des Genomprojekts. So eignen sich Sequencing by Synthesis (Illumina / Solexa) und die SOLiD-Technologie (ABI) wegen ihrer kurzen Leseweiten (25 50 b) weniger für die de novo Sequenzierung unbekannter Genome (12, 13). Für die Resequenzierung von bereits bekannten Genomen, z. B. zur Analyse von SNPs, stellen die kurzen Leseweiten weniger ein Problem dar. Die Technologie eignet sich besonders für die Analyse von Expressionsprofilen, z.b. durch SAGE (Serial Analysis of Gene Expression) oder direkte cdna-quantifizierung (14). Die von Roche / 454 verwendete Pyrosequencing-Technologie erzielt immerhin Leseweiten von 100 b (250 b in der FLX Version) und ist damit für die de novo Sequenzierung wenig repetitiver Bakteriengenome prinzipiell geeignet (15). Goldberg et al. zeigten allerdings anhand der Sequenzierung von mehreren marinen Bakteriengenomen, dass für qualitativ hochwertige Genomassemblierung weiterhin eine niedrige Genomabdeckung mit Sanger-Sequenzdaten benötigt wird (85) DNA-Templates als limitierender Faktor der Sanger-Sequenzierung Wie in 1.1 dargestellt erfordert die Sanger-Sequenzierung von Genom-, Metagenom- oder EST-Projekten aufgrund der hohen Anzahl von Proben automatisierte Systeme, welche die zur Sequenzbestimmung notwendigen Schritte im Hochdurchsatz durchführen. Mit der Entwicklung des Cycle-Sequencing nach Sanger und der Kapillargelelektrophorese besteht die Möglichkeit, Sequenzierungsreaktion und Sequenzanalyse in 384er Mikrotiterplatten (MTP) durchzuführen, so dass ein hoher Probendurchsatz erzielt wird. Limitierender Faktor des Probendurchsatzes ist dagegen die zuverlässige Herstellung qualitativ hochwertiger DNA als Template für die Sequenzierung nach Sanger. Verschiedene Möglichkeiten zur Produktion sequenzierungstauglicher DNA mit hohem Probendurchsatz werden im Folgenden vorgestellt.

17 Einleitung: DNA-Templates als limitierender Faktor der Sanger-Sequenzierung PCR Die enzymatische Amplifikation mittels PCR kann direkt aus der Übernachtkultur einzelner Klone einer Klonbibliothek stattfinden (16). Prinzipiell werden die Inserts der Klone dabei so stark vervielfältigt, dass Verunreinigungen (Zellbestandteile, Reste d. Kulturmediums) gegenüber der DNA-Konzentration vernachlässigbar werden. Die PCR-Reaktionen können in kleinen Reaktionsvolumina (10 20 µl) durchgeführt und DNA-Bibliotheken somit im 384er MTP-Format bearbeitet werden, welches im Allgemeinen Volumina bis 40 µl pro Kavität zulässt. PCR-Produkte sind grundsätzlich gut geeignet für die Sequenzierung, wenn die Substrate der Reaktion (Primer, dntps) während der Produktbildung verbraucht wurden. Ist dies nicht der Fall, müssen insbesondere überschüssige Primer durch Aufreinigungsmethoden entfernt werden, da sie sonst in der Sequenzierungsreaktion Fehlsignale verursachen, die die Sequenzierungsqualität herabsetzen. Am MPI f. Molekulare Genetik wurden von Holger Rauth und Richard Reinhardt seit 1996 verschiedene PCR-basierte Verfahren für die automatisierte Template-Präparation entwickelt (17). Im Hochdurchsatz ist die Anwendung der PCR auf DNA-Bibliotheken mit geringen Insertgrößen von 0,1-4 kb beschränkt, wobei mit zunehmender Insertgröße die Anzahl an Reaktionen steigt, welche keine ausreichende Amplifikation liefern. Eine nachträgliche Qualitätskontrolle und eine Neuanordnung der Produkte (Rearraying) auf neuen MTPs ist somit notwendig und verzögert den Sequenzierungsprozess maßgeblich. Ein weiteres Problem der PCR-Methode ist der so genannte Amplification-Bias. Bestimmte DNA-Sequenzen können nur schlecht oder gar nicht mittels PCR amplifiziert werden und sind somit in den Ergebnissen der Sequenzierung unterrepräsentiert Rolling Circle Amplifikation Ebenso wie bei der PCR wird DNA bei der Rolling Circle Amplifikation (RCA) durch eine enzymatische Reaktion vervielfältigt. Die verwendete DNA-Polymerase aus dem Bacteriophagen Φ29 besitzt eine Strand-Displacement Aktivität und kann ausgehend von Brüchen (nicks) den DNA-Doppelstrang auftrennen und neu synthetisieren. An dem verbleibenden Einzelstrang binden Hexamer-Primer zufälliger Sequenz und werden von der Φ29-DNA-Polymerase zum Doppelstrang ergänzt (18). Zwar ist die RC-Amplifikation unspezifisch und amplifiziert auch genomische DNA aus der Übernachtkultur, die hohe Prozessivität der Polymerase (mittlere Produktgröße > 20 kb) bewirkt jedoch, dass ringförmige Plasmide mit hoher Kopienzahl gegenüber linearen

18 Einleitung: DNA-Templates als limitierender Faktor der Sanger-Sequenzierung 4 Fragmenten bevorzugt amplifiziert werden. Im Gegensatz zur PCR können also auch Vektoren, welche Inserts größer 4 kb tragen mit RCA noch zuverlässig amplifiziert werden. Bei Fosmid- oder BAC-Klonen mit Insertgrößen jenseits von 40 kb und niedriger Kopienzahl pro Zelle ist jedoch ein vorausgehender Aufreinigungsschritt unerlässlich (19). Die Reaktion läuft isothermal bei 30ºC ab, dies ist ein Vorteil gegenüber der PCR, welche in Thermocyclern durchgeführt werden muss. Kommerziell erhältliche Reagenzien für RCA liefern hohe Produktausbeuten von ng/µl. Die Reaktion kann in sehr kleinen Volumina (> 5 µl) durchgeführt werden, was die Nutzung von MTP bis hin zum 1536 Format ermöglicht. Die Qualitätskontrolle der RCA-Produkte gestaltet sich schwierig, da sie im Gegensatz zu PCR-Produkten keine definierten Produkte liefert, sondern ein Gemisch verzweigter DNA verschiedener Größe, welches auch in Negativ-Kontrollen ohne DNA aus den vorhanden Hexamer-Primern gebildet wird. Probleme durch Amplification-Bias sollen wesentlich geringer sein als bei der PCR, weshalb die RCA bevorzugt auch für die Amplifikation ganzer Genome eingesetzt wird (20) Plasmid-Isolation Im Gegensatz zu den in und dargestellten enzymatischen Methoden, kann Template-DNA für die Sequenzierung auch direkt aus den Zellen einer Klon-Bibliothek gewonnen werden (Amplifikation in vivo). Die Amplifikation der Plasmid-DNA erfolgt dabei durch Kultivierung der Zellen in größeren Volumen (meist 1,5 ml). Die Größe der Konstrukte ist dabei nur durch den verwendeten Vektortyp und die Effizienz bakterieller Replikation beschränkt. Ebenso werden Amplification-Bias Effekte vermieden. Da isolierte Plasmide keine unverbrauchten Oligonukleotide oder unspezifische Produkte enthalten, ist die Qualität der Sequenzdaten meist höher als bei unaufgereinigten PCR-Produkten. Die Vorteile der Plasmid-Isolation gegenüber den enzymatischen Methoden werden durch höheren methodischen Aufwand teuer erkauft. Laufende Kosten entstehen vor allem durch verwendete Einwegmaterialien wie Filter und magnetische Partikel. Zusätzlich leidet der Probendurchsatz unter den großen verwendeten Kulturvolumina, welche die Prozesse meist an das 96er MTP-Format binden. In Tab. 1 sind die Vor- und Nachteile der dargestellten Methoden zusammengefasst.

19 Einleitung: Aufreinigung von Plasmid-DNA im Hochdurchsatz 5 Tab. 1: Vor- und Nachteile von alternativen Methoden zur Produktion von Template-DNA für die Sanger-Sequenzierung. Prinzip Methode Vorteile: in kleinen Volumen durchführbar (384er MTP- Format), wenige Arbeitsschritte Hochdurchsatzfähigkeit / Automatisierbarkeit Kosten Größenbereich amplifizierter DNA Qualität der Sequenzdaten Qualitätskontrolle Amplifikation in vivo alkalische Lyse + Aufreinigung mit magnetischen Partikeln oder Filterplatten Vorteile: geringe Kontaminationsproblematik, Stabilität verwendeter Reagenzien Nachteile: zeitaufwendig, große Volumina werden benötigt (bisher meist nur 96 Mikrotiterplattenformat) hoch, da kommerzielle Systeme viele Einwegmaterialien verbrauchen (Spitzen, Filter, Beads), 0,4 1 Euro pro Klon sämtliche Vektortypen können aufgereinigt werden, 3 kb (puc) bis 300 kb (BAC), unabhängig von der Insertgrößenverteilung in der DNA-Bank sehr gut, auch Bereiche die sich mit PCR nicht amplifizieren lassen Qualitätskontrolle der DNA über Agarosegele gut, photometrische Methoden sind je nach verwendetem System eingeschränkt möglich Amplifikation in vitro PCR Nachteile: Instabilität des Enzymansatzes, Kontaminationsproblematik, aufgrund von Ausfällen Rearraying der positiven Produkte notwendig niedrig, insofern Enzyme und PCR-Reaktionspuffer selbst hergestellt werden, < 0,1 Euro pro Klon, zusätzliche Kosten für Rearraying der Produkte Im Hochdurchsatz sinkt die Ausbeute ab ca. 4 kb drastisch, gut im Bereich 0,1 kb - 2 kb, enger Größenbereich der Inserts in DNA-Bank ist von Vorteil gut, es gibt jedoch Sekundärstrukturen, welche sich nicht amplifizieren lassen Qualitätskontrolle über Agarosegele sehr gut Rolling Circle Amplifikation Vorteile: in kleinsten Volumen durchführbar (1536er MTP), wenige Arbeitsschritte Nachteile: extreme Kontaminationsproblematik, hohe Instabilität des verwendeten Enzyms hoch, da bisher nur kommerzielle Kits von Amersham- Pharmacia erhältlich 0,25-1 Euro pro Klon im Bereich 3kb - 10kb gute Ausbeuten, größere low-copy Konstrukte können nur nach Aufreinigung der Proben DNA amplifiziert werden Qualität der Sequenzen liegt über der von PCR- Produkten, reicht jedoch nicht an die von Plasmid Präparationen heran, vor allem bei Vektoren > 10 kb Qualitätskontrolle nur sehr unzuverlässig, auch Negativkontrollen ohne DNA bilden Produkte -> Restriktionsverdau notwendig!!! 1.4. Aufreinigung von Plasmid-DNA im Hochdurchsatz Wie in 1.2 dargestellt, ist die Plasmid-Präparation die flexibelste, aber auch technisch aufwändigste Methode zur Herstellung von qualitativ hochwertigen DNA-Templates. In den großen Sequenzierungszentren sind deshalb automatisierte Anlagen konzipiert worden, um den nötigen Probendurchsatz von bis zu Plasmiden pro Tag zu gewährleisten und die

20 Einleitung: Aufreinigung von Plasmid-DNA im Hochdurchsatz 6 Kosten zu reduzieren. Die Verfahren unterscheiden sich maßgeblich in den verwendeten Strategien zur Plasmid-Aufreinigung Magnetische Partikel Elkin et al. veröffentlichten 2001 ein Verfahren, das am Joint Genome Institute (JGI) für die Plasmid-Aufreinigung im Zuge des Humangenomprojekts entwickelt und angewendet wurde (21). Die Plasmid-Isolation erfolgte im 96er MTP-Format durch Zelllyse in Lysozym / Detergenz-Puffer und anschließender Plasmid-DNA-Aufreinigung durch Solid Phase Reversible Immobilization (SPRI) mit Hilfe von carboxylierten magnetischen Partikeln (22). Das Prinzip des Aufreinigunsschrittes ist in Abb. 1 dargestellt. Abb. 1: Prinzip der DNA-Aufreinigung mit magnetischen Partikeln. Plasmid-DNA (rot) bindet in Gegenwart eines Bindungspuffers an magnetische Partikel (schwarz). Verunreinigungen (grün) werden entfernt. Plasmid-DNA wird in konzentrierter Form in Elutionspuffer gelöst und von den Partikeln getrennt. Durch vergleichende Sequenzierung von Plasmiden, welche mit Ethanol-Fällung oder SPRI aufgereinigt worden waren, konnte gezeigt werden, dass die Qualität der Aufreinigung durch SPRI wesentlich höhere Leseweiten (582 ± 51,6 b gegenüber 446 ± 81,2 b) und mehr erfolgreiche Sequenzierungen (91 ± 5,6% gegenüber 69,1 ± 15,4%) auf Megabace 1000 Kapillarsequenzierern erzielte (21). Der Aufreinigungsschritt wurde auf einem Robotersystem automatisiert und erzielte einen Probendurchsatz von ca Plasmiden pro Monat ( / d) (siehe Abb. 2). Da die Plasmid-DNA durch Magnetseparatoren von Verunreinigungen getrennt wurde, konnten Zentrifugationsschritte vermieden werden, so dass die Automatisierung vereinfacht wurde. Mittlerweile sind Reagenzien auf Basis der SPRI-Technik kommerziell erhältlich, welche die Aufreinigung auch im 384er MTP-Format ermöglichen (23). Die Kosten pro Probe reduzieren sich dabei auf ca. 15 Cents für die verwendeten Reagenzien.

21 Einleitung: Aufreinigung von Plasmid-DNA im Hochdurchsatz 7 Abb. 2: Eines der automatisierten Systeme für die SPRI-Aufreinigung am JGI. Das System bewältigt 11 x 96er MTPs pro Stunde (21) Adsorption an Silica-Membranen Itho et al. präsentierten 1999 ein System für die Plasmid-Aufreinigung im Hochdurchsatz am japanischen Forschungsinstitut RIKEN (24). Für die Aufreinigung wurden Glasfilterplatten im 96 MTP-Format konstruiert. Der Ablauf erlaubt es, die Zelllyse durch Lysozym / SDS-Puffer, selektive Bindung der Plasmid-DNA an die Silicamatrix in Anwesenheit von Guanidin / HCl, Waschschritte und Elution in einer einzigen Filterplatte durchzuführen. Der Durchfluss der Reagenzien durch die Filterplatten wird durch ein angelegtes Vakuum möglich, wodurch aufwändig zu automatisierende und durchsatzlimitierende Zentrifugationsschritte vermieden werden (siehe Abb. 3). Abb. 3: Glasfilterplatte für die Plasmid-DNA-Aufreinigung. Das Volumen der Wells beträgt 600 µl. Am Boden jeder Platte befindet sich ein Glasfilter und eine hydrophile PVDF Membran mit einer Porengröße von 0,45 µm. Die Glasfilter sind so ausgelegt, dass E. coli Zellen geerntet werden können und Plasmid- DNA in Gegenwart von Guanidin- HCl nach der Lyse adsorbiert wird. Die PVDF Membran hält die Lösungen an ihrem Platz (24).

22 Einleitung: Aufreinigung von Plasmid-DNA im Hochdurchsatz 8 Ein vollautomatisiertes System zur Plasmid-DNA-Aufreinigung wurde als Fließband konzipiert, auf dem etwa Proben in 8 h ( / d) aufbereitet werden können. Ein Test zeigte, dass 295 von 384 Proben gute Ausbeuten an Plasmid-DNA aufwiesen (76,8%), von denen wiederum 276 (93,5%) gute Sequenzdaten lieferten. Die relativ hohen Verluste bei der Präparation wurden auf Wachstumsprobleme der zugrunde liegenden Bakterienkulturen zurückgeführt. Die mittlere Leseweite auf einem ABI 377 Sequenzer betrug 450 b (Ergebnisse sind nicht vergleichbar mit denen von 1.4.1, da verschiedene Geräte für die Sequenzanalyse verwendet wurden). Eppendorf bietet kommerzielle Aufreinigungssysteme für Plasmid-DNA auf Basis von 384- Well Filterplatten mit DNA-Bindungskapazität an (25). Dederichs et al. beschreiben eine äußerst preisgünstige Alternative zur Aufreinigung von Plasmiden, welche am Baylor College of Medicine verwendet wird (26). Hierbei handelt es sich um die Adsorption von Plasmid-DNA an Glasperlen (Ø µm) in Gegenwart von 2-Propanol. Die Methode wurde nicht automatisiert, konnte aber trotzdem einen Durchsatz von etwa Proben pro Tag gewährleisten, wobei der Anteil erfolgreicher Sequenzierungen bei ca. 82% lag und Leseweiten von durchschnittlich 500 b auf ABI 3700 Sequenzierern erreicht wurden. Die Kosten der Methode schätzte man auf 10 US-Cents pro Plasmid. Sie lagen zum damaligen Zeitpunkt (2002) bei 10% des Marktpreises Präzipitation mit Alkoholen und direkte Sequenzierung aus Zelllysat Das Labor von Bruce Roe am Advanced Center for Genome Technology der Universität Oklahoma hat Protokolle zur Isolation von Plasmiden aus 384er MTPs im Internet öffentlich zugänglich gemacht (27). Das Protokoll nutzt die alkalischen Lyse und anschließende 2-Propanol Fällung (28). Es kann hier kaum von einer wirklichen Aufreinigung gesprochen werden, da 2-Propanol auch verdaute RNA und Proteine präzipitiert. Deshalb ist es fragwürdig, ob die Qualität und Ausbeute der DNA auch für schwieriger zu sequenzierende Templates, wie BACs oder Fosmide ausreicht. Über Ausfallrate und Leseweite gibt es keine Angaben. Ein ähnliches Verfahren zur Isolation von Plasmid-DNA bedient sich Filterplatten von Corning (29). Hierbei wird das Zelllysat der alkalischen Lyse in einem einzigen Zentrifugationsschritt durch einen 0,45 µm PVDF-Filter geklärt und in 2-Propanol gefällt. Die Kosten werden mit 7 US-Cents pro Plasmid angegeben. Die erzielte Leseweite liegt bei durchschnittlich 599 b auf ABI 3700 CGE-Sequenzern. Über Ausfallraten ist nichts bekannt. Eine weitere sehr preisgünstige Methode wurde von Marra et al. am Washington Genome Sequencing Center implementiert (30). Wie im Protokoll von Bruce Roe wird hier ebenfalls auf eine wirkliche Aufreinigung der DNA verzichtet, die Zellen werden durch eine Kombination von enzymatischer Lyse durch Lysozym und anschließender Hitzeeinwirkung

23 Einleitung: Größenselektive DNA-Präzipitation in PEG / Salz Gemischen 9 durch Mikrowellenbestrahlung in 96 MTPs aufgeschlossen. Das Zelllysat wird zentrifugiert und der Überstand direkt für die DNA-Sequenzierung verwendet. Auf polyacrylamidgelbasierten ABI377-Sequenzierern konnten durchschnittlich 425 b gelesen werden, wobei 70% aller Sequenzen Leseweiten über 400 b aufwiesen. Der Preis pro Plasmid-Präparation lag bei 3 US-Cents und ist derzeit der niedrigste veröffentlichte Wert. Eine der von Marra et al. ähnliche Methode wurde von Applied Biosystems auf neuerer Sequenzierungstechnologie und im 384er MTP-Format angewendet. Ein wissenschaftliches Poster hierzu findet sich im Internet (31). Die Verwendung des ABI3730 Sequenzierroboters und der BigDye3.1 Sequenzierungsreagenzien erzielten typische Leseweiten von b mit sehr geringen Ausfallraten. Alle der in dargestellten Methoden sind zwar für die Sequenzierung von high-copy Vektoren geeignet, erweisen sich jedoch problematisch, wenn es um große Vektor- Konstrukte mit geringer Kopienzahl (BACs, Fosmide) geht. Außerdem werden wegen des hohen Preisdrucks, der auf öffentlichen Instituten wie auch kommerziellen Sequenzierungsfirmen lastet, Reagenzien für den Sequenzierungsansatz meist verdünnt eingesetzt. Hochverdünnte Sequenzierungsreagenzien werden allerdings mit unzureichend aufgereinigten Plasmid-Templates zunehmend instabil. Zusätzlich besteht das Problem, dass die Kapillaren moderner CGE-Sequenzierer anfällig für Verunreinigungen sind und bei unzureichender Template Qualität häufiger gewechselt werden müssen. Die preisgünstigen Methoden ziehen also Folgekosten nach sich, welche den Vorteil der Methoden relativieren. Eine bisher wenig beachtete alternative Aufreinigungsmethode für Plasmide wird im Folgenden dargestellt. Die Präzipitation von DNA in Polyethylenglycol (PEG) erzielt eine gute Reinheit der DNA und kommt ohne teure Einwegprodukte wie Filterplatten oder magnetische Partikel aus Größenselektive DNA-Präzipitation in PEG / Salz Gemischen Lis et al. beschrieben 1975 erstmals, dass die Löslichkeit von DNA-Molekülen in PEG / Salz Gemischen von ihrer Größe abhängig ist (32). In dem sie sonifizierte λ-dna in NaCl-Lösung mit unterschiedlichen Mengen PEG-6000 versetzten, zeigten sie, dass eine Trennung von Fragmentgrößen bei relativ niedriger Zentrifugalbeschleunigung durch Präzipitation möglich ist.

24 Einleitung: Größenselektive DNA-Präzipitation in PEG / Salz Gemischen 10 Abb. 4: Sequentielle und parallele Fällung sonifizierter DNA nach Lis et al.. Die Fällung großer DNA-Fragmente beginnt bei niedrigen PEG-Konzentrationen. Mit steigender PEG- Konzentration werden auch kleinere Fragmentgrößen ausgefällt (32). Lis et al. überprüften unterschiedlichste Einflussparameter auf die fraktionierte Fällung, welche in Tab. 2 zusammenfassend dargestellt sind. Tab. 2: Einflussparameter auf die größenabhängige DNA-Fällung in PEG / NaCl Gemischen nach Lis et al. Parameter PEG-Konzentration NaCl-Konzentration DNA-Konzentration Zentrifugalbeschleunigung zweiwertige Kationen Equilibrierungszeit Effekt Mit zunehmender Konzentration verschiebt sich die Löslichkeitsgrenze zu kleineren DNA-Fragmentgrößen Unter 0,2 M keine fraktionierte Fällung / ab 0,35 M steigend verschiebt sich die Löslichkeitsgrenze zu kleineren DNA- Fragmentgrößen Unter 10 ng/µl DNA kommt es zu massiven Ausbeuteverlusten von 50% und mehr, mit steigender DNA-Konz. nähert sich die Ausbeute 100% im Bereich von x G bis x G kein Einfluss auf die Fällung Verschieben die Löslichkeitsgrenze zu kleineren DNA- Fragmentgrößen längere Zeiten erhöhen Ausbeute und verschieben die Löslichkeitsgrenze zu größeren DNA-Fragmenten ph-wert im Bereich 5 8,3 kein Einfluss auf die Löslichkeit

25 Einleitung: Größenselektive DNA-Präzipitation in PEG / Salz Gemischen Plasmid-Aufreinigung durch größenselektive Präzipitation Die größenselektive Fällung in PEG-Systemen kann auch zur Trennung von Proteingemischen angewendet werden. Eine Vorhersage der Löslichkeitsgrenze für bestimmte Proteine ist wegen der Heterogenität dieser Molekülklasse allerdings nicht möglich. Ein Vergleich der Fällungsparameter von Proteinen und DNA zeigt jedoch, dass Proteine erst bei wesentlich höheren PEG-Konzentrationen präzipitieren als DNA-Fragmente mit Größen von über bp (33). Die PEG-Fällung kann also eine Trennung großer DNA-Moleküle (z.b. Plasmide) von Proteinen sowie kleinen Nukleinsäuren, wie z.b. RNAse behandelte RNAs, in einem einzigen Schritt erzielen. Aus diesem Grund erfüllt diese Methode alle Anforderungen zur Aufreinigung und Konzentrierung von Plasmiden aus geklärten Zelllysaten, in denen Proteine und RNA den größten Anteil an Verunreinigungen darstellen. Mehrere Methoden zur Aufreinigung von Plasmiden durch PEG-Präzipitation mit geringem Probendurchsatz sind veröffentlicht worden. Pulleyblank et al. (34) nutzten eine PEG / LiCl- Methode zur Aufreinigung von Plasmiden nach Pronase / SDS-Lyse der Zellen. Die Methode ist relativ umständlich, da ein Ultrazentrifugationsschritt sowie eine Chloroformextraktion benötigt wurden. Nicoletti et al. (35) verwendeten dagegen eine Kombination aus PEG / MgCl 2 mit dem Vorteil, dass die Fällung schon bei wesentlich geringeren Ionenstärken durchgeführt werden konnte (ab 10 mm gegenüber >0,5 M bei NaCl). Erst Schmitz et al. veröffentlichten 2006 eine Methode, welche durch Nutzung des PEG / NaCl Systems die Aufreinigung von Plasmid-DNA direkt aus dem geklärten Zelllysat erlaubte und somit den methodischen Aufwand erheblich verringerte (36). Auf Grund der in Tab. 2 dargestellten Mindestkonzentration an DNA im Fällungsansatz, musste das Volumen der zur alkalischen Lyse eingesetzten Puffer minimiert und auch die Fällungsreagenzien PEG / NaCl mussten möglichst hochkonzentriert zugegeben werden. Erst wenn diese Bedingungen erfüllt waren, konnte eine direkte Fällung aus dem Überstand der alkalischen Lyse mit guter Ausbeute gelingen. Den Zusammenhang zwischen Ausbeute und DNA- Konzentration im Fällungsansatz zeigt Abb. 5: Abb. 5.: Zusammenhang zwischen DNA-Konzentration und Ausbeute bei der größenselektiven Präzipitation von DNA in PEG / NaCl (36).

26 Einleitung: Größenselektive DNA-Präzipitation in PEG / Salz Gemischen PCR-Produktaufreinigung durch größenselektive Präzipitation Anders als bei der Aufreinigung von Plasmiden sind PCR-Produkte mit unverbrauchten Primern und dntps verunreinigt, welche sich negativ auf die Sequenzierungsreaktion auswirken. Die Größe von PCR-Produkten liegt meist im Bereich 150 b bis b. Es müssen also wesentlich höhere PEG- oder Salz-Konzentrationen gewählt werden, um eine Fällung kleiner PCR-Produkte zu erzielen (36). Die Trennung von Primern und dntps ist dennoch unproblematisch, da die Trennschärfe der PEG-Methode zu kleineren Nukleinsäuren hin zunimmt (siehe Abb. 4). Auch die Konzentration von PCR-Produkten ist im Gegensatz zur Plasmid-Aufreinigung weniger kritisch, da sie meist über 20 ng/µl liegt Automatisierung der PEG-Methode und ihre Grenzen Bisher gibt es in der Literatur keine Veröffentlichungen zu Anlagen, welche die Aufreinigung von Plasmiden oder PCR-Produkten durch PEG-Präzipitation im Hochdurchsatz ermöglichen. Dies liegt wahrscheinlich darin begründet, dass die Automatisierung der PEG- Präzipitation durch mehrere Faktoren erschwert wird. Dazu zählen notwendige Zentrifugationsschritte, die Viskosität hochkonzentrierter PEG-Lösungen und der hohe Salzgehalt der Fällungsansätze. Die Automatisierung von Zentrifugationsschritten ist aufwendig und erfordert speziell dafür konzipierte Zentrifugen (z.b. Hettich Rotanta). Zudem ist die Zentrifugation im 96er MTP- Format eine Limitierung für den Probendurchsatz. Dies ist einer der Gründe, weshalb viele der in 1.4 dargestellten Methoden die Immobilisierung der DNA an Festphasen gegenüber der Zentrifugation bevorzugen. Die Nutzung von 384er MTPs, welche auch stapelweise zentrifugiert werden können, relativiert diesen Nachteil. Die Durchmischung von Lysat und PEG / Salz zur Fällung kann sich gerade in den kleinen Kavitäten von 384er MTPs als sehr schwierig erweisen, da die verwendeten PEG / Salz Lösungen eine hohe Viskosität und Dichte aufweisen. Die PEG-Methode ist zudem relativ empfindlich, was Pipettierungenauigkeiten betrifft und gerade diese werden durch hohe Viskosität und niedriges Volumen gefördert. Der hohe Salzgehalt, der für die größenselektive Präzipitation notwendig ist (Tab. 2), erfordert mehrfaches Waschen der pelletierten DNA, um eine Inhibierung der Sequenzierungsreaktion auszuschließen. Die Waschschritte erhöhen die Anzahl der nötigen Zentrifugationsschritte und limitieren so wiederum den Probendurchsatz. Trotz der zuvor genannten Probleme, würde sich ein automatisiertes, auf PEG-Präzipitation basierendes DNA-Aufreinigungsverfahren, wegen des zugrunde liegenden Mechanismus der

27 Einleitung: Kartierung eukaryotischer Genome mit Hilfe von BAC-Klonen 13 selektiven Fällung von unterschiedlichen DNA-Molekülgrößen, nicht nur für die kostengünstige Plasmid-Isolation, sondern auch besonders für die Aufreinigung großer Vektorkonstrukte eignen, wie sie u.a. zur physikalischen Kartierung von eukaryotischen Genomen verwendet werden Kartierung eukaryotischer Genome mit Hilfe von BAC-Klonen Shizuya et al. beschrieben 1992 ein neuartiges Vektorsystem auf Basis des F-Plasmids von E. coli, welches die Klonierung von großen DNA-Fragmenten eukaryotischer Genome erlaubt und bacterial artificial chromosome (BAC) genannt wurde (37). Die para- und parb- Gene des F-Plasmids sorgen für eine niedrige Kopienzahl von 1-2 pro Zelle, so dass die genetische Stabilität der bis zu 300 kb großen Inserts im Vergleich zu den aus Hefe bekannten yeast artificial chromosomes (YAC) oder Cosmid-Vektoren wesentlich höher ist. Die BAC-Vektoren wurden im Laufe der Zeit verbessert, z.b. wurde der Vektor pcc1bac durch einen zusätzlichen high-copy Replikationsursprung ergänzt (38). Durch Zusatz von L-Arabinose ins Medium kann dieser indirekt induziert werden und die Ausbeute an BAC- DNA um ein Vielfaches steigern. Mittlerweile haben sich BACs als Klonierungssystem für große DNA-Fragmente etabliert und für viele Organismen sind BAC-Bibliotheken erhältlich ( BAC- Bibliotheken leisten insbesondere einen Beitrag zur physikalischen Kartierung großer Genome. Verschiedene Strategien für die Genomkartierung mit Hilfe von BAC-Bibliotheken sind im Folgenden dargestellt BAC-Filterhybridisierung Mit BACs transformierte Klone können auf Nylon-Membranen gezüchtet werden. Nach Lyse der Zellen und Denaturierung der DNA bleiben die einzelsträngige genomische und die BAC- DNA auf der positiv geladenen Membran immobilisiert. Auf diesen BAC-Filtern können mehrere Klone durch Hybridisierung mit radioaktiv markierten Sonden parallel untersucht werden. Diese Technik wurde u. a. für die Genomkartierung von Medaka (Oryzias latipes) verwendet (39). Dafür wurden mer-Oligonukleotide anhand von bekannten Medaka cdna- Sequenzen synthetisiert. Diese wurden radioaktiv markiert und auf BAC-Filtern mit Klonen hybridisiert. Unterschiedliche Klone, welche nach Hybridisierung eines Oligonukleotids ein Signal geben, können einander zugeordnet werden. Theoretisch muss für jedes Oligonukleotid eine Hybridisierung durchgeführt werden, was einen immensen

28 Einleitung: Kartierung eukaryotischer Genome mit Hilfe von BAC-Klonen 14 Arbeitsaufwand bedeutet. Durch eine 2D-Poolingstrategie konnte der Aufwand immerhin um den Faktor 3,4 auf 695 nötige Hybridisierungen reduziert werden. Trotzdem ist die Methode aufwändig und wegen des Arbeitens mit Radioaktivität schlecht automatisierbar. Die Kartierung des Medaka Genoms (~800 Mb) lieferte 902 Bereiche, welche von überlappenden BAC-Inserts abgedeckt wurden (BAC-Contigs). Von diesen konnten 462 den 24 Chromosomen von Medaka zugeordnet werden BAC-Klon Fingerprinting Das Fingerprinting von BAC-Klonen erfolgt durch den Verdau der BAC-DNA mittels Restriktionsenzymen. Dabei entsteht ein klonspezifisches Muster verschiedener Fragmentgrößen, welches durch Elektrophoresetechniken sichtbar gemacht werden kann. Klone, die teilweise überlappen, werden einige gemeinsame Banden in ihren Restriktionsmustern aufweisen und können einander so zugeordnet werden. Dabei gilt grob: Je mehr gemeinsame Banden, desto größer die Überlappung und desto höher ihre Signifikanz. Die Größe von BAC-Inserts macht die Analyse durch Agarose-Gelelektrophorese äußerst schwierig. Setzt man selten schneidende Restriktionsenzyme ein, so erhält man zwar mit Standardfärbemethoden gut nachweisbare Fragmente, welche aber wegen ihrer Größe schlecht auftrennbar sind. Zusätzlich müssen BAC-Klone stärker überlappen, um größere gemeinsame Banden aufweisen zu können. Werden die BAC Klone mit häufiger schneidenden Enzymen fragmentiert, so lassen sich die kleinen Fragmente zwar besser auftrennen, durch die große Anzahl der Fragmente relativiert sich dieser Effekt allerdings. Zusätzlich werden kleinere Fragmente mit Standardfärbemethoden schwerer nachweisbar. Durch Nutzung von Fluoreszenzmarkierung der Restriktionsfragmente in Kombination mit hochauflösender Kapillargelelektrophorese, können diese Probleme bewältigt werden und es steht ein besser automatisierbares Analyseverfahren zur Verfügung. Die Methode wurde bisher zur Kartierung zahlreicher Genome verwendet (40, 41) und ist weiter verbessert worden. Die Enden von DNA-Fragmenten, welche von verschiedenen Restriktionsenzymen geschnitten wurden, können mit unterschiedlichen Farbstoffen markiert werden. Diese SnaP- Shot genannte Methode erhöht die Anzahl unterscheidbarer Fragmente und ermöglicht somit auch weniger stark überlappende BACs einander signifikant zuzuordnen (42). Die erwähnten Referenzen erzielten die Anordnung von mehreren BAC-Klonen in BAC- Contigs.