Partielle Sequenzinformation

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1 Analyse der Sequenz Traditionell: Bestimmung einer Teilsequenz, Herstellung einer DNA-Sonde, Klonierung des Gens oder der cdna, Sequenzierung der DNA Keine Information zu PTM Limitiert: Isoformen Heute: Bestimmung einer Teilsequenz, Vergleich mit Datenbanken Alternativ: Proteolytischer Fingerabdruck Chemische Sequenzierung Enzymatische Sequenzierung Sequenzierung über Massenspektrometrie

2 Partielle Sequenzinformation Aminosäurezusammensetzung: Totalhydrolyse 6M HCl, C, 24 h (Minimalbedingungen) Ser, Thr, Tyr, Trp, Glu, Cys werden degradiert Separate Proben, unterschiedliche Zeit, Extrapolation auf Null-Zeitpunkt Protektive Reagenzien (z.b. Thiole schützen Trp, Tyr; Voroxidation von Cys) Beste Methode zur Konzentrationsbestimmung Partieller Verdau (chemisch, enzymatisch) Proteine können nicht vollständig "durchgelesen" werden Generation kleinerer Peptide für die Sequenzierung Bestimmung der N- und C-terminalen Aminosäuren

3 Identifikation und Quantifizierung der Aminosäuren Farbreaktion mit Ninhydrin Reaktion mit Fluorescamin HPLC

4 Partieller Verdau über Proteasen Einige Proteasen schneiden bevorzugt an bestimmten Stellen Chymotrypsin: nach Phe, Trp Trypsin: nach Lys, Arg Elastase: nach Ala, Val Überlagerung der Strukturen von Chymotrypsin and Trypsin

5 Spezifität über S1-Taschen von Chymotrypsin, Trypsin und Elastase

6 Chemische Spaltung der Polypeptidkette mit Cyanogenbromid

7 Definition des N-Terminus Ordnen der Peptide eines partiellen Verdaus Erste Reaktion bei chemischer Sequenzierung oft unsauber Alle Reagenzien reagieren auch mit Seitenkettenaminen Dansylchlorid Dinitrofluorbenzol Phenylisothiocyanat

8 Definition und Partialsequenz des C-Terminus Chemisch schwierig Enzymatisch: Carboxpeptidase Analyse des Zeitverlaufs des Verdaus

9 Sequenzierung nach Sanger

10 Sequenzierung nach Sanger Insulin (51 AS) - 10 Jahre g Insulin

11 Edman Abbau

12 Edman Abbau Wenige pmol Protein benötigt Auch längere Peptide möglich (30 60 AS)

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14 Zusammenfassung Sequenzanalyse Aminosäurezusammensetzung Totalhydrolyse, Farbreaktion und HPLC (Quantifizierung) Bestimmung der N-terminalen AS Markierung des N-Terminus und Totalhydrolyse Bestimmung einiger C-terminaler AS Zeitabhängiger Verdau mit Carboxypeptidase Spezifische Peptide Partieller Verdau über spezifische Proteasen oder CNBr

15 Zusammenfassung Sequenzanalyse Sanger Sequenzierung Markierung des N-Terminus und Totalhydrolyse Markierung des N-Terminus, Partialverdau, Peptidisolation, Totalhydolyse Edman Abbau Reaktion am N-Terminus, Abspaltung der N- terminalen AS, Identifikation Wiederholung der Prozedur mit dem verkürzten Peptid

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17 Proteomics Von Genen zu Proteinen Genomics - Transcriptomics - Proteomics DNA mrna Protein Gene Transkription mrna 1 mrna 2 mrna 3 mrna 4 mrna 5 mrna 6 mrna 7 Modifikationen, Spleißen Protein 1 Protein 2 Protein 3 Protein 4 Protein 5 Protein 6 Protein 7 Protein 8 Protein 9. Protein n

18 Proteomics Protein-Inventarisierung und Charakterisierung von komplexen Systemen Beipiele: Molekulare Maschinen (Alberts, B. (1998) Cell 92, 291) Biogenese von Ribosomenuntereinheiten Subzelluläre Lokalisation Proteininventar von Organellen Zelluläre Proteome Virulenzfaktoren von Pathogenen Vergleich von Proteomen Verschiedene Gewebe, verschiedene Zellstadien Post-translationale Modifikationen

19 Das MS/Proteomics Experiment Steen, H. & Mann, M. (2004) Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 5, 699

20 Massenspektrometer Zahl der Ionen bei bestimmtem m/z Verdampfung und Ionisierung Separation nach m/z Sequenzdatenbanken Problem: Wie bekommt man Peptide unversehrt in die Gasphase?

21 Sanft in die Gasphase Nobelpreis in Chemie 2002 John B. Fenn Electrospray ionization, ESI Koichi Tanaka Soft laser desorption/ionization, LDI Matrix-assisted laser desorption/ionization, MALDI Franz Hillenkamp Michael Karas

22 Electrospray Ionization

23 MALDI Matrix-assisted laser desportion/ionization Peptide Matrix

24 α-cyano-4-hydroxyzimtsäure 2,5-Dihydroxybenzoesäure Absorption im UV (337 nm)

25 MALDI Extraktorplatte U hν Funktion der Matrix Probenteller Aufnahme der Energie (keine Fragmentierung der Analyte) (De-)Protonierung der Analytmoleküle Desorption der Analytmoleküle

26 Time-of-Flight (TOF) Massenspektrometer Ionenquelle Probenteller Extraktorplatte Driftstrecke (D) Detektor v = D/t U t = TOF ist proportional zu m/z

27 TOF (~ µs) (m/z) 1/2

28 Quadrupol Massenspektrometer Ionen durchwandern den Quadrupol auf einer komplizierten Bahn Eine stabile Bahn ist abhängig von m/z des Ions und den angelegten Spannungen U - Amplitude der Gleichspannung V - Amplitude der Wechselspannung

29 Massenspektrum Quasimolekulares Ion Ionenstrom (Intensität) (M + nh) n+ (M + Na) m/z

30 Bestimmung der molekularen Masse intakter Proteine über MALDI m/z Tanaka et al., 1987 m/z Karas und Hillenkamp, 1988 Ungefähre molekulare Masse z.b. aus SDS PAGE bekannt Erlaubt Rückschlüsse auf Ladungszahl

31 ESI-MS m/z Wähle zwei benachbarte Peaks, (m/z) 2 > (m/z) 1 Henning Urlaub, MPI Göttingen (m/z) 1 = (M + nx) / n (m/z) 2 = [M + (n-1)x] / (n-1) n = [(m/z) 1 - X] / [(m/z) 2 - (m/z) 1 ] M = n[(m/z) 1 - X] M - Molekulare Masse Analyt X - Masse einer "Ladung" (z.b. + 1 für ein Proton) n - Ladungszahl

32 Isotopenverteilung 12 C (n-1) 13 C 1 Bei niedriger Auflösung erscheint die Gruppe als ein Peak 12 C (n-2) 13 C 2 Gleiche Ladungszahl für alle Peaks der Gruppe 12 C n m/z-abstände erlauben Rückschlüsse auf Ladungszahl m/z

33 Ladungszahl über Isotopenverteilung Loo, J.A. et al. (1992) PNAS 89, 286

34 Trennung von Protein/Peptid-Gemischen Traditionell: 2D Gelelektrophorese Heute: Nano-Flüssigchromatographie (+ 1D Gelelektrophorese) Problem: Einspeisung ins MS

35 1. Trennung nach pi (Einlegen der Gelsäule in SDS Puffer) 2. Trennung nach Molekulargewicht

36 2D Gelelektrophorese IEF ph 3 ph 10 MW 150 kda SDS 15 kda

37 1D SDS-PAGE als 1. Dimension 1D SDS-PAGE Nano-Chromatographie 170 kda ESI-MSMS

38 Nano-Flüssigchromatographie

39 Online Nano-Flüssigchromatographie

40 Ionen-Cromatogramm Ionenstrom ("Intensität") 1 MS-Scan

41 Offline Nano-Flüssigchromatographie

42 100 nl (50 nl Probe + 50 nl Matrix)

43 Online Nano-Flüssigchromatographie ESI MSMS

44 Sequenzierung über MS Triple-Quadrupol MS/MS Experiment

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46 ESI-MS-Experiment (Triple Quadrupol) siehe "Lottspeich" Neubauer et al., PNAS, 1997

47 ESI-MS-Experiment (Triple Quadrupol) Neubauer et al., PNAS, 1997

48 Bevorzugte Fragmentierung der Polypeptidkette b-typ - Ladung verbleibt am N-terminalen Teil y-typ - Ladung verbleibt am C-terminalen Teil

49 Ionenreihen G E G N P F E G T Q E M K + z.b. Ar b-reihe G E G N P F E G T Q E M G E G N P F E G T Q E + G E G N P F E G T Q G E G N P F E G T G E G N P F E G + G E G N P F E G + K M K E M K Q E M K T Q E M K T Q E M K y-reihe

50 K K 147 E M K + M K M 131 Q E M K E Q T T Q E M K G 57 G G E G N P F E G T Q E M K G E G N P F E G T Q E M+ + G E G N P F E G T Q E + G E G N P F E G T Q G E G N P F E G T + + T Q E M K m/z Q E M K 146

51 QEMK GTQEMK b-type series y-type series K M E 129 Q T G Q E 129 M 131 K 146 m/z