Vorlesung: Gene und Genome

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1 Vorlesung: Gene und Genome Genomsequenzierung und Metagenomik Anke Becker WS 2008/ Themen in der Vorlesung Genomik und Metagenomik Genomik Pan- & Metagenomik Organisation pro- & eukaryotischer DNA Genom- & Genstrukturen Genomsequenzierung Genomannotation Komparative Genomik E. coli core genes Bakterienchromosom Kartierung Strategien Sanger Genvorhersage & Annotation Prokaryot Prokaryot Pangenomik Eukaryot Eukaryot Genorganisation Ultrafast Sequencing Metagenomik (zweistündig) (zweistündig)

2 Erstellen von genomischen Karten: ein wichtiger Schritt in der Sequenzierung eukaryotischer Genome Genetische Karte Physikalische Karte DNA-Sequenz Genetische Distanz --> Physikalische Distanz Rekombinationsereignisse in der Meiose führen zum Kopplungsbruch (intrachromosomale Rekombination) Zytologischer Beweis für Rekombination (Austausch zwischen Schwesterchromatiden)

3 Von Rekombinationsfrequenzen zu genetischen Karten Die Rekombinationswahrscheinlichkeit ist umso geringer je näher 2 Marker auf einem Chromosom lokalisiert sind 1 % Rekombination zwischen 2 Markern ist definiert als eine Rekombinationseinheit (1 Centi-Morgan) 50 % Rekombination unterscheidet gekoppelte nicht von unabhängigen Markern Verschiedene Ecotypen erleichtern genetische Kartierung in Pflanzen Phänotypische Polymorphismen in Medicago truncatula Molekularer Polymorphismus Hoffmann et al., MPMI 10: (1997) Barker et al., PMB Rep 8: (1990) Southern-Hybridisierungen Verschiedene Ecotypen zeichnen sich durch phänotypische aber auch durch molekulare Polymorphismen aus Beide Polymorphismen können zur Erstellung genetischer Karten genutzt werden

4 Kartierung durch Restriktionsfragment-Längenpolymorphismus (RFLPs) Nicht nur morphologische sondern auch molekulare Marker können für genetische Kartierung genutzt werden Kartierung durch PCR: Microsatelliten-Kartierung NNNNNNNNNNCTTCTTCTTCTTCTTCTTCTTCTTCTTNNNNNNNNN Kultivar 1 NNNNNNNNNNCTTCTTCTTCTTCTTCTTNNNNNNNNN Kultivar 2 M Cv1 Cv2 Cv1/Cv2 Kartierung basierend auf einer Kreuzung zwischen Kultivar 1 und 2 F1-Population: alle Pflanzen sind Heterozygote (Kultivar 1/Kultivar 2) F2-Population: 1/4 der Pflanzen sind homozygot für den Kultivar 1 Marker 1/4 der Pflanzen sind homozygot für den Kultivar 2 Marker 1/2 der Pflanzen sind heterozygot für beide Marker Kartierung: Wie häufig wird ein Marker zusammen mit einem anderen Marker auf dem gleiche Chromosom vererbt? --> Rekombination-Frequenz --> Kartierungseinheit (cm) --> Definition von Kopplungsgruppen Microsatelliten-Kartierung basiert auf PCR-Techniken und ist daher automatisierbar

5 Erstellen von genomischen Karten: ein wichtiger Schritt in der Sequenzierung eukaryotischer Genome Genetische Karte Physikalische Karte DNA-Sequenz Genetische Distanz --> Physikalische Distanz Zytogenetische Kartierung durch FISH (Fluorescence In Situ Hybridization) Chromosomale Lokalisation und Genpositionen können durch in situ Hybridisierungen bestimmt werden Korrelation der genetischen Kopplungsgruppen mit Chromosomen

6 Zytogenetische Kartierung auf meiotischen (Pachytän-Stadium) Chromosomen FISH Hybridisierung mit verschiedenen Proben Green: MtR1 repeat (c) or 45S rdna (b,d) Red: 5S rdna; Arrow: centromere Red: BAC59K07 Green: BAC58F01 Auflösung der Kartierung auf Metaphase-Chromosomen: im Bereich von Megabasen Auflösung der Kartierung auf Pachytän-Chromosomen: im Bereich von Kilobasen, erlaubt Positionskartierung von BACs entlang der Chromosomen Taken from: O. Kulikova et al., The Plant Journal 27: (2001) 11 Erstellen von genomischen Karten: ein wichtiger Schritt in der Sequenzierung eukaryotischer Genome Genetische Karte Physikalische Karte DNA-Sequenz Genetische Distanz --> Physikalische Distanz

7 Konstruktion genomischer Bibliotheken Plattieren & Picken Bibliothek in Mikrotiterplatten Typische Vehikel für die Konstruktion von Bibliotheken Plasmid/BAC Vektoren Phage Vektoren Plasmide Phage λ Bibliotheken Cosmid Bibliotheken BAC* Bibliotheken bis zu 10 kb Insertertionen 8-23 kb Insertionen kb Insertionen bis zu 200 kb Insertionen * BAC = bacterial artificial chromosome

8 Wie wird ein BAC-Contig aus tausenden BACs erstellt? Genetische Karte Physikalische Karte DNA-Sequenz Genetische Distanz --> Physikalische Distanz DNA-Sequenzierung: Erstellen eines BAC-Contigs durch terminale Sequenzierung T7 SP6 BAC Insert Sequenzierung der Insert-Enden Alignment mit Endsequenzen anderer BACs zur Identifizierung von Überlappungen Überlappende Sequenz Überlappende Sequenz

9 Erstellen eines BAC-Contigs durch Hybridisierung T7 BAC Insert SP6 A 1 24 T7 Restriktion SP P Synthese terminaler Hybridisierungs- Proben durch RNA- Polymerase Sonde Hybridisierung Identifizierung Überlappender BACs T7 SP6 Restriktionskartierung zur Identifizierung der Überlappung Erstellen eines BAC-Contigs durch Hybridisierung

10 Von BAC-Contigs zu Genomsequenzen Genetische Karte Physikalische Karte DNA-Sequenz Genetische Distanz --> Physikalische Distanz Didesoxy DNA-Sequenzierung nach Sanger: Biochemisches Prinzip der Sequenziermethode 3' A C T G T A T G A C 5' OH A PP i PPP OH Desoxynucleotide 3' A C T G T A T G A C A 5' OH T PP i PPP OH 3' A C T G T A T G A C 5' OH A PP i PPP H Didesoxynucleotide 3' A C T G T A T G A C A 5' H T PPP OH

11 Didesoxy DNA-Sequenzierung nach Sanger Primer Template 5' 3' 3' 5' +dntps + Polymerase +ddatp +ddctp +ddgtp +ddttp GCTCTCA GC GCTC GCTCTC G GCTCTCAG GCT GCTCT Electrophorese A C G T 3' G A C T C T C G 5' Leserichtung Eine automatisierte Variante des Sanger Protokolls: Cycle Sequencing Mix für "A" Reaktion Polymerase Puffer dntps ddatp Annealing Extension Primer or "A" Reaktion Template Denaturierung A ACA ACATA ACATAGA Es wird weniger Template DNA benötigt. Automation für die Hochdurchsatz-Sequenzierung ist möglich

12 Strategien zur Markierung der Sequenzierprodukte Primer 5 -Markierung durch markierte Primer Interne Markierung durch markierte dntps Terminale Markierung durch markierte ddntps Markierungen: früher radioaktive P 32 markierte Nucleotide, heute meist Fluoreszenzmarkierung Markierung der Sequenzierprodukte durch DyeTerminators datp, dctp, ditp, dttp Primer ddctp + ddatp Template DNA ddgtp ddttp

13 Vom Autoradiogramm zur Mehrfarben-Fluoreszenzdetektion Autoradiogramm A C G T A C G T ACGT Elektropherogramm Automatische Detektion fluoreszenzmarkierter Sequenzierprodukte im Polyacrylamid-Plattengelsystem Polyacrylamidgel Puffertank - Emission Detektor Mehrfarben- Fluoreszenzdetektion Einfarben- Fluoreszenzdetektion nm + Zeit

14 Kommerzielle Sequenziermaschinen mit Plattengel-System LiCor 4200L IR ABI 377 Prism 16(32) - 48 Sequenzierreaktionen pro Lauf Automatische Hochdurchsatz-Sequenzierung ABI Prism probes in parallel up to 1536 probes (500 bp) per 24 h

15 Kapillarelektrophorese Wanderungsrichtung der DNA Kapillare Injektionsrichtung der Gelmatrix - + Vom Anoden-Ende aus werden die Kapillaren mit Gelmatrix gefüllt. Die DNA wandert von der Kathode zur Anode Probeninjektion Kapillare und Kathode tauchen in die Probe. Spannung wird angelegt. Negative geladene DNA Moleküle wandern in die Kapillare

16 ABI PRISM 310 Genetic Analyzer Syringe pump Heating plate Capillary Detection window Syringe with polymer Cathode & Capillary Autosampler Anode buffer Pump block Cathode buffer Detektionszelle

17 Sequenzdaten, die mit einer Kapillar-Sequenziermaschine erzeugt wurden Ultrafast (Deep) Sequencing-Technologien 454 Sequenziertechnologie (Roche Applied Science) Solexa Sequenziertechnologie (Solexa/Illumina)

18 Genome Sequencer 20 System: 454 Sequenzier-Technologie (Roche Applied Science) Übersicht Sequenziert mehr als 20 Millionen Basen in 4.5 Stunden Präparation der DNA Bibliothek

19 Übersicht über die emulsionsbasierte klonale Amplifikation (empcr) Verteilen der DNA-tragenden Partikel in die Picotiter-Platte

20 Sequenzierreaktion Flowgram Flowgram of a 113-bases read from an Mycobacterium genitalium run. Nucleotides are flowed in the order T, A, C, G. The signal value intervals corresponding to the various homopolymers are indicated on the right. The first four bases (in red, above the flowgram) constitute the key sequence, used to identify wells containing a DNA-carrying bead

21 Solexa/Illumina Sequenzier-Technologie Solexa/Illumina Sequenzier-Technologie

24 Vergleich der Leseweiten verschiedener Sequenzier-Technologien Länge eines bakteriellen Gens ~1000 nt Leseweite Sanger Leseweite 454 FLX Leseweite 454 FLX (Titanium) Leseweite Solexa ~600 nt ~250 nt ~400 nt ~30 nt Wie wird ein Genom sequenziert? Bakterielle Genomgrößen variieren zwischen Mycoplasma genitalium and Myxobacteria: 0.6 Mb to ~13 Mb Leseweiten der DNA-Sequenzierung variieren von nt (abhängig von der Sequenziertechnologie) Aufteilung des Genoms für die Sequenzierung notwendig Das Genom muss in Fragmente geeigneter Größe für die Sequenzierung geteilt werden. Individuelle Sequenzfragmente müssen in die native Reihenfolge gebracht werden. Für diese Reassemblierung sind Überlappungen der Sequenzen der Fragmente erforderlich. Sequenzierstrategie: Whole Genome Shotgun

25 Whole genome shotgun sequencing: Drei Phasen Shotgun phase: Sequenzierung von Shotgun Klonen, Assemblierung der Sequenzen zu Contigs (scaffold assembly) Linking phase: individuelle Contigs werden zu einem Contig zusammengefügt Polishing/finishing phase: Resequenzierung von Regionen geringer Sequenzabdeckung und Bereichen geringer Datenqualität Whole genome shotgun sequencing: Generieren und Klonieren kurzer überlappender Fragmente genomische DNA partialler Restriktionsverdau oder mechnisches Scheren überlappende Fragmente Klonierung in Plasmidvektoren Shotgun-Klonbibliotheken mit Insert- Längen von 1-2 kb

26 Whole genome shotgun sequencing: shotgun phase Sequenzierung von Shotgun Klonen bis zu einer 7-12 fachen Sequenzabdeckung Beispiel: Genomgröße: 4.6 Mb Sequenzierungsreaktionen: (Leseweite ~580 bp) Gesamtsequenzlänge: 40.6 Mb (8.8 x) Assemblierung von Shotgun Sequenzen zu Contigs (scaffold assembly) Die Shotgun Phase ended normalerweise mit einigen nicht-überlappenden Contigs (meist ~98% der Gesamtgenomsequenz bei bakteriellen Genomprojekten) Beispiel eines Contigs in einem Assemblierungsprogramm: Whole genome shotgun sequencing: linking phase Was sind die Gründe für Lücken in der Sequenz? Einige genomische Regionen sind in der Shotgun Bibliothek unterrepräsentiert hoher G+C Gehalt ausgeprägte Sekundärstrukturen letale Gene Hohe Kopienzahl der Plasmide in der Bibliothek können für die Instabilität bestimmter klonierter Regionen verantwortlich sein Individuelle Contigs müssen zu einem Contig (Gesamtgenom-Sequenz) zusammengefügt werden Strategien: primer walking über die Contig-Enden hinaus Identifizierung und Sequenzierung verbindender Klone PCR Amplifikation und Sequenzierung

27 Whole genome shotgun sequencing: linking phase primer walking Sequenzen der Contig-Enden werden durch Verwendung spezifisch generierter Primer verlängert genomische Template-DNA oder verbindender Klon (linking clone) erforderlich Sequenz wird durch die aufeinanderfolgende Verwendung spezifisch generierter Primer weiter verlängert und die Lücke schließlich geschlossen Contig 1 Contig 2 linked contig 1+2 linking/walking primer Whole genome shotgun sequencing: linking phase linking clones Identifizierung verbindender Klone in genomischen Bibliotheken mit großen Inserts (BACs oder Fosmids) terminale Sequenzierung Hybridisierung, etc. Sequenzierung mit spezifisch generierten Primern Contig 1 Contig 2 Contig 3 Überlappende Sequenz Überlappende Sequenz linking/walking primer BAC oder Fosmid Klonbibliothek

28 Whole genome shotgun sequencing: linking phase PCR-Amplifikation Generierung spezifischer Primer an den Contig-Enden PCR-Amplifikation Sequenzierung des PCR-Produkts Contig 1 Contig 2 verbindender Contig PCR-Produkt Shotgun- Sequenzierung PCR-Primer Whole genome shotgun sequencing: polishing & finishing Resequenzierung unterrepräsentierter Regionen und von Bereichen geringer Datenqualität mit spezifisch generierten Primern: Polishing geringe Datenqualität einzelsträngig polishing primer

29 Bestätigung der Genomassemblierung durch einen BAC- und/oder Fosmid-Contig Große Fragmente genomischer DNA werden in BAC oder Fosmid Vektoren kloniert: Klonbibliothek Generierung eines Contigs und Identifizierung überlappender Bereiche Bakterielles Chromosom Insert (ca kb) Minimal tiling path aus BAC- oder Fosmid-Klonen Beispiele für Fosmid-Contigs

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31 Die Sequenzierung eines Genoms ist abgeschlossen Wie geht es weiter? Annotation!

32 Was ist Annotation? Definition: Identifizierung, Definition und Interpretation von Eigenschaften der Genomsequenz durch die Kombination von biologischem Wissen mit Bioinformatikansätzen Sequenzelemente: Gene: - Protein-kodierende Gene - trna Gene - rrna Gene Exon-Intron Struktur von Genen Promotorelemente Terminatorsequenzen Ribosombindestellen Vorhersage der Funktion von Sequenzelementen und Genprodukten transponierbare Elemente Prophagen Origin of replication Sequenzwiederholungen Computer-gestützte Genvorhersage Welche Region kodiert für ein Protein? Welcher DNA-Strang ist der kodierende Strang eines Gens? Welches Leseraster wird genutzt? Wo beginnt und wo endet eine Kodierregion (Startcodon, Stoppcodon)? Wo sind die Exon-Intron Grenzen in eukaryotischen Genen? Welches sind die regulatorischen Sequenzen eines Gens?

33 Vergleich der Genvorhersage in Prokaryoten und Eukaryoten Prokaryoten Kleine Genome Mb Hohe Gendichte (>80 %) Geringer Anteil repetitiver Sequenzen Keine Introns" Identifizierung der Gene ist relativ einfach, Erfolgsrate ~ 99 % Probleme: Überlappende Kodierregionen Kurze Gene Vorhersage von Promotoren und Transkriptionsstarts Eukaryoten Große Genome bp Niedrige Gendichte (<50 %) Hoher Anteil repetitiver Sequenzen Intron-Exon Struktur Identifizierung der Gene ist ein komplexes Problem, Genauigkeit auf der Ebene einzelner Genstrukturen ~50 % Probleme: viele Sequenzelemente zur Genvorhersage in Eukaryoten: Signal Sensors Signal eine Abfolge von Nukleotiden in der DNA die von zellulären Komponenten erkannt werden

34 Strategien zur Genvorhersage: Protein-kodierende Gene Similarity-based methods (extrinsisch) nutzen Ähnlichkeiten zu annotatierten Sequenzen: Proteine cdnas ESTs Vergleichende Genomik - Alignierung genomischer Sequenzen verschiedener Spezies Ab initio Genvorhersage-Methoden: nutzen nur Sequenzinformationen (intrinsisch) Integrierte Ansätze Sequence annotation of genomes DNA sequence DNA analysis frameshift prediction gene, trna prediction generation of facts assignment of features protein inventory submission to databases

35 Was sind orthologe und paraloge Gene? Zwei Gene sind paralog, wenn sie durch ein Duplikationsereignis enstanden sind. Outparalogs (Paraloge Gene, deren Duplikation vor einem Speziationsereignis stattgefunden hat) Inparalogs (Paraloge Gene, deren Duplikation nach einem Speziationsereignis stattgefunden hat) Orthologe Gene sind durch ein Speziationsereignis entstanden Clusters of Orthologous Groups of Proteins (COGs) COG categories E amino acid transport and metabolism H coenzyme transport and metabolism G carbohydrate transport and metabolism P inorganic ion transport and metabolism U intracellular trafficking F nucleotide transport and metabolism J translation Q secondary metabolite biosynthesis C energy production and conversion T signal transduction mechanisms D cell cycle control M cell wall N cell motility V defense mechanisms S function unknown; K transcription L replication O posttranslational modification R general function prediction only X no function

36 Pangenomik Pangenomik ist der Vergleich multipler Genomsequenzen von verschiedenen Vertretern einer Spezies. Pangenom = alle Gene, die für "unique proteins" innerhalb einer Spezies kodieren Core genome = alle Gene, die innerhalb der Spezies für konservierte Proteine kodieren Pangenome können deutlich größer sein, als die Genome einzelner Vertreter einer Spezies Die Anzahl der core genome Gene kann sehr klein sein (z.b. nur etwa 10% der Gene eines Vertreters der Art) Die Genomgrößen innerhalb einer Spezies können stark variieren (z.b. E. coli 4,2-5,6 Mb, Frankia Spezies 5,4-9,0 Mb) Core genome E. coli (32 Genome im Vergleich) Two-dimensional density plot of 'core genes' for the E. coli pan-genome. The plot illustrates the number of E. coli core genes for n = 2,...,32 genomes based on a maximum of 3,200 random combinations of genomes for each n. The density colors reflect the count of combinations giving rise to a certain number of core genes Genome Biology 8:R267 (2007) 72

37 Mögliche Ursachen biologischer Diversität Gene acquisition: by insertion (mobile elements, phages) by duplication (recombinations) by plasmid uptake Gene loss: by excision (mobile elements, phages) by deletion (recombinations) by plasmid loss Metagenomik Metagenomik ist die Analyse der DNA-Sequenzen aller Mikroorganismen, die aus einer definierten Umwelt isoliert wurden. Metagenom = Gesamtheit der genetische Information der Mikroorganismen einer bestimmten Lebensgemeinschaft oder eines Biotops In einigen Metagenomprojekten hatten weniger als 10% der identifizierten Gene (oder Genfragmente) signifikante Homologien zu bekannten Genen

38 Anzahl der Genomprojekte (GOLD, Genomes OnLine Database: Gesamtanzahl der Genomprojekte 3939 Publizierte abgeschlossene Genomprojekte Eukaryoten Bakterien Archaea Laufende Genomprojekte Eukaryoten Bakterien Archaea Metagenomprojekte Beispiele für Metagenomprojekte Saragossa Meer Klimaanlagen-Luftfilter (Singapur) Antarktischer See Kläranlage Menschlicher Darm (gesunde Erwachsene und Erwachsenen mit Morbus Crohn Erkrankung) Neandertaler Knochen CAMERA (Community Cyberinfrastructure for Advanced Marine Microbial Ecology Research and Analysis) Es wird angenommen, dass mehr als 99% aller existierenden Mikroorganismen nicht kultivierbar sind. Metagenomische Methoden ermöglichen die Identifizierung von Mikroorganismen unabhängig von ihrer Kultivierbarkeit