Molekulare Diagnostik in der Dermato-Onkologie: Wie? Wann? Warum? Was? Und was kostet es?

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1 Molekulare Diagnostik in der Dermato-Onkologie: Wie? Wann? Warum? Was? Und was kostet es? Ralf Gutzmer Klinik für Dermatologie, Allergologie und Venerologie Haut- Tumor- Zentrum Hannover

2 Wann+Warum? Wenn eine Diagnose davon abhängt B-/T-Zell Rezeptor Rearrangement bei Lymphomen EWS/ATF1 Translokation bei Klarzellsarkomen Wenn eine Therapieentscheidung davon abhängt KIT/BRAF/NRAS bei Melanomen

3 Wann+Warum?

4 Was? Therapeutisch relevante Zielstrukturen

5 RAS-RAF-MEK-ERK - Signalweg KIT-Mutationen: 2-5% NRAS-Mutationen: 15-25% BRAF Mutationen: 40-60% Flaherty & McArthur, Cancer 2010

6 Wie begründen sich die unterschiedlichen Angaben zu Mutationen eines Gens? Unterschiedliche Patientenkollektive Unterschiedliche Nachweisverfahren Unterschiedliche Bandbreite an Mutationen untersucht

7 KIT Melanome der Schleimhaut / Akrolentiginiöse Melanome Verschiedene Mutationen Exon 9,11,13,17 Patientengruppen Postow et al., Cancer J 2012

8 Patientengruppen KIT Melanome der Schleimhaut / Akrolentiginiöse Melanome Verschiedene Mutationen Exon 9,11,13,17 NRAS Noduläre Melanome Ältere Patienten >80% Exon 2 Q61 betroffen, seltener Exon 1 R12/R13 BRAF Superfiziell spreitende Melanom Jüngere Patienten >90% Exon 15 V600 Mutationen, seltener L597/K601 oder Exon 11

9 Wie? Je besser das relevante Areal eingegrenzt ist, desto sensitivere Verfahren können eingesetzt werden. Beispiel: BRAF V600 Mutationsnachweis Vergleich: Sanger-Sequenzierung cobas -Test Pyrosequenzierung Next generation sequencing (NGS)

10 MeWo WM35

11 cobas Test: High resolution melting analysis

12 cobas BRAF Mutation Test* <50% cobas z 480 Analyzer *verfügbar seit 08/2011

13 Pyro-Sequencing Amplifikate werden mittels Streptavidin immobilisiert Herstellung Einzelstrang DNA Hybridisierung Sequenzierprimer Pyrosequenzierung

14 Die Pyrosequenzierungsreaktion Hinzugabe jeweils eines Nukleotides(dNTP) Der Nukleotideinbau setzt Pyrophosphat (PP i ) frei Pyrophosphat (PP i ) wird in Licht konvertiert welches im Pyrogramm als Peak sichtbar wird Überschüssiges Nukleotid wird abgebaut bevor die nächste Base hinzugefügt wird. Light PPi ATP Time

15 Das Prinzip der Pyrosequenzierung Ablauf ~ 2h ~ 15 min ~ min Assay Design PCR Probenvorbereitung Pyrosequenzierung Die zu analysierende Region wird mit einem biotinylierten Primer (~ bp) amplifiziert Trennung in Einzelstrang DNA durch streptavidincoated Beads. Hybridisierung der Sequenzierungsprimer. Sequenzierung durch Synthese. Sequenzdaten werden von der ersten Base nach dem Sequenzierungsprimer generiert.

16 Pyrosequenzierung SNP und Mutationsanalyse Sequence to analyze: Dispensierungsabfolge: a/g C T G C C T C A G T C T G C T C A G T C T G C T

17 Pyrosequenzierung SNP und Mutationsanalyse Sequence to analyze: Dispensierungsabfolge: a/g C T G C C T C A G T C T G C T Single height ref peaks Double height ref peak C A G T C T G C T Negative Kontrollen Referenz Peaks

18 Pyrosequenzierung SNP und Mutationsanalyse Sequence to analyze: Dispensierungsabfolge: Analysierter Genotyp: a/g C T G C C T C A G T C T G C T A/G Heterozygot 2 half height peaks Single height ref peaks Double height ref peak C A G T C T G C T Negative Kontrollen Referenz Peaks

19 Pyro-Sequencing

20 Pyro-Sequencing

21 therascreen BRAF Pyro Kit Für die Detektion von Mutationen in den Codons 600 und Zu analysierende Sequenz: Codon 600» CWCTGTAGC»CAYTGTAGC»CVCTGTAGC Codon » CTGTTNCAAATGATHCAGATHCA Das Kit ermöglicht die automatisierte Detektion der folgenden Mutationen V600E/M/A/G G464V/E, G466V/E, G469A/V/E

22 Next generation sequencing 454 Sequencing 454 LifeScience als Unter-Firma von CuraGen im Jahr 2000 gegründet, 454 war der firmeninterne Code für das Projekt Ziel: kostengünstige DNA Sequenzierung Aufkauf durch Roche März 2007 (154MioD) Mai 2007 erste komplette Sequenzierung eines menschlichen Genoms (von James D. Watson) Prinzip: parallele Pyrosequenzierung von tausender einzelner Genkopien

23 454 Sequencing Workflow One fragment One bead One well Shear DNA and add linkers Emulsion PCR Deposition of beads into wells of Clonal amplification PicoTiterPlate device One read Sequencing-by-synthesis Detection of PPi release Flowgram displays the sequence of reads based on light intensity

24 Sensitivity of EGFR Mutation Detection in NSCLC Conclusion For all patients with a confirmed response to EGFR inhibition, only 454 massively parallel sequencing detected all relevant mutations. Querings et al. (2011), PlosOne

25 MHH: Sanger-Sequenzierung Pyrosequenzierung (Lena Marks, Antje Walter, Imke Satzger) MPI: next generation sequencing (Bernd Timmermann) targos molecular pathology: cobas-test (Thomas Henkel, Josef Rüschoff)

26 Sensitivität der Untersuchungsmethoden %-BRAFpositiver WM35 Zellen cobas-test Sanger Sequenzierung 100% Positiv positiv positiv 30% Positiv positiv positiv 20% positiv positiv positiv 10% positiv negativ positiv 5% positiv negativ negativ 2,5% negativ negativ negativ 1% negativ negativ negativ 0,5% negativ negativ negativ 0% negativ negativ negativ Pyrosequenzierung

27 Welche Methode? 179 Proben analysiert, NGS-Daten V600E Mutation: 72 Proben V600K Mutation: 15 Proben V600E2: 2 Proben V600E+K: 4 Proben V600E+E2: 1 Probe V600E+R: 2 Proben

28 Welche Methode? Allelfrequenz

29 Welche Methode? Seltene Mutationen

30 Alternative: BRAF-V600E spezifische Immunhistochemie?

31 Welche Methode? Beispiel BRAF-V600 Analyse: Sanger: Allelfrequenz >15% Erfasst auch seltene Mutationen Pyrosequenzierung/cobas : Allelfrequenz >6% Seltene Mutationen häufig nicht erfasst Welche Sensitivität wird für die Therapieentscheidung benötigt?

32 Welche Methode für KIT / NRAS? KIT verschiedene Exone und Bereiche nur Sanger praktikabel NRAS Hotspot Q61, sensitive Verfahren (Pyrosequenzierung) auch in Routine möglich

33 Welches Gewebe? Vergleich Primärtumor Metastasen von einem Patienten BRAF Exon 15 und NRAS Exon 2 Sanger Sequenzierung Colombino et al., J Clin Oncol 2012

34 Welches Gewebe? Colombino et al., J Clin Oncol 2012

35 Welches Gewebe? Colombino et al., J Clin Oncol 2012

36 Welches Gewebe?

37 Ambulante Patienten Überweisungsschein zur Abrechnung Labor Krankenkasse analog zu anderer molekularer Diagnostik Abrechnung (bislang) nur Pathologen möglich Stationäre Patienten Wer bezahlt? Inkludiert in DRG-Pauschale

38 Was kostet es? GoÄ: Gebührenordnung für Ärzte Kapitel M (Laboruntersuchungen) Paragraph III: Zelluntersuchungen Sektion 11: Nukleinsäuren

39 GoÄ 4800 H&E Färbung 217 Punkte, 12,65 Euro

40 GoÄ 3920 DNA Isolation 900 Punkte, 52,46 Euro

41 GoÄ 3922 Amplifikation von Kernsäuren (PCR) 500 Punkte, 29,14 Euro

42 GoÄ 3924 Identifikation von Kernsäuren mittels Hybridisierung mit radioaktiven oder nicht-radioaktiven Sonden 300 Punkte, 17,49 Euro

43 GoÄ 3925 Separation von Kernsäuren mit Elektrophorese und Blotten 600 Punkte, 34,97 Euro

44 GoÄ 3926 Identifikation von Kernsäuren mittels Sequenzierung 2000 Punkte, 116,57 Euro

45 Erstattung PCR Methode Erstattung H&E (GoÄ4800) 12,47 Euro Isolation (GoÄ3920) 52,46 Euro PCR (GoÄ3922) 29,14 Euro Identifikation mit Sonde (GoÄ3924) 17,49 Euro Id. mit Elektrophorese (GoÄ3925) 34,97 Euro Total 111,56-129,04 Euro Kosten Reagenzien BRAF Testung: COBAS: ca. 80 Euro PCR: ca Euro

46 Erstattung Sequenzierungs-Methode Erstattung H&E (GoÄ4800) 12,47 Euro Isolation (GoÄ3920) 52,46 Euro PCR (GoÄ3922) 29,14 Euro Sequenzierung (GoÄ3926) 116,57 Euro Total 220,64 Euro Kosten Reagenzien BRAF Testung: Sanger Sequenzierung: ca Euro Pyrosequenzierung: ca. 60 Euro

47 Erstattung Sequenzierungs-Methode bei KIT-Analyse (4 Exone) Erstattung H&E (GoÄ4800) 12,47 Euro Isolation (GoÄ3920) 52,46 Euro 4xPCR (GoÄ3922) 4 x 29,14 Euro 4xSequenzierung (GoÄ3926) 4 x 116,57 Euro Total 647,77 Euro Kosten Reagenzien Testung: 4 Sanger Sequenzierungen: ca. 80 Euro

48 Zusammenfassung Honorierung Kein Test-spezifisches, sondern Methodenspezifisches Honorar Beruht auf der Anzahl der Schritte, die für ein Verfahren notwendig sind Honorar korreliert nicht mit den tatsächlichen Unkosten / der Testqualität

49 Beispiel Externer Befund einer 74 jährigen Patientin, vor einem Jahr am Stamm SSM, jetzt in transit und regionäre Lymphknoten-Filiae

50 Beispiel

51 Interpretation KIT: erwartungsgemäß negativ BRAF: Überprüfung mit sensitiverer Methode Evtl. NRAS wenn Studieneinschluß möglich

52 Fazit / Persönliche Empfehlung 20. Februar 2013 Alle Tumore ab Stadium IIIb BRAF-Analyse ( Screening mit Sanger,? Immunhistologie) positiv negativ Therapieentscheidung möglich BRAF-Analyse -anderer Gewebeblock -sensitiveres Verfahren Weitere Targets KIT: akral/schmleimhaut NRAS: Studie

53 Vision Next generation sequencing-assays Sequenzierung von relevanten molekularen Zielstrukturen (auch Strukturen mit Relevanz für Resistenzen wie MEK- Mutationen) Angabe von Mutationen mit Allelfrequenzen

54 Economic issues money power for reagents and test platform feasibility of platform laos for other tests man power reimbursement Quality issues test sensitivity test specificity selection of optimal tissue sample determination of multiple targets from one sample if clinically indicated Interaction of Physician and Molecular Pathology Lab required!

55 BRAF-Mutationen beim Melanom Greaves et al., J Mol Diagnostics 2013

56 BRAF-Mutationen beim Melanom Edlundh-Rose et al., Melanoma Res 2006

57 Mutationen beim Melanom Jacob et al., Cancer 2012

58 Mutationen beim Melanom Hodis et al., Cell 2012

59 Mutationen beim Melanom Woodman et al., Clin Cancer Res 2012

60 Mutationen beim Melanom Woodman et al., Clin Cancer Res 2012

61 KIT-Mutationen Garrido & Bastian, J Invest Dermatol 2010

62 KIT-Mutationen Postow et al., Cancer J 2012

63 RAS-RAF-MEK-ERK - Signalweg KIT-Blocker: bei KIT- Mutation MEK-Blocker: Bei NRAS, BRAF Mutation (?KIT) BRAF-Blocker: bei BRAF-V600 Mutation Flaherty & McArthur, Cancer 2010

64 BRAF-Mutationen Exon15 Meistens V600-Mutationen 80% V600E 12% V600K 8% andere Seltener andere (aktivierende) Mutationen (Dahlman et al., Cancer Discov 2012) L597 K601

65 Frage 1 Welches ist das sensitivste Verfahren zum Nachweis einer BRAF-Mutation? A Sanger-Sequenzierung B cobas -Test C Pyrosequenzierung D next generation sequencing

66 Frage 2 Welcher molekulare Befund sollte vor der Therapieentscheidung bei einem Patienten mit inoperabel metastasiertem Melanom vorliegen? A BRAF V600 Analyse B BRAF Exon 11 Analyse C KIT Analyse D NRAS Analyse

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