Luke Alphey. DNA-Sequenzierung. Aus dem Englischen übersetzt von Kurt Beginnen. Spektrum Akademischer Verlag

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1 Luke Alphey DNA-Sequenzierung Aus dem Englischen übersetzt von Kurt Beginnen Spektrum Akademischer Verlag

2 Inhalt Abkürzungen 11 Vorwort 15 Danksagung 16 Teil 1: Grundprinzipien und Methoden Was ist DNA-Sequenzierung? 17 Einführung 17 Die Struktur der Nucleinsäure 18 DNA-Sequenzierung 21 Literatur 25 Die Technik des chemischen Abbaus (Maxam-Gilbert-Methode) 27 Die Methode 27 Literatur 29 Die Technik des Kettenabbruchs (Sanger-Didesoxy-Methode) 31 Einführung 3 1 Zyklische Sequenzierung 39 Literatur 45 Geräte und Reagenzien 47 Für den Anfang: Sequenzierungskits 47 Oligonucleotidprimer Konstruktion von Primern Konstruktion von Primern für die zyklische Sequenzierung 50 DNA-Polymerase 5 1 Markierung 52 dntps und ddntps ditp und 7-Desaza-dGTP 57 Pyrophosphatase 58

3 6 DNA-Sequenzierung Literatur 59 Herstellung der Matrize 61 Einführung 61 Herstellung einzelsträngiger DNA-Matrizen 61 Herstellung doppelsträngiger DNA-Matrizen (Plasmide) 66 PCR-Produkte Einzelsträngige DNA-Matrizen aus PCR-Produkten 69 Große Matrizen (Lambda, Cosmide, 70 Matrizen für halbautomatisches Sequenzieren 72 Literatur 72 Gelelektrophorese 75 Einführung 75 Überblick 75 Lesen einer Sequenz aus dem Autoradiogramm 76 Gelsysteme Sicherheit Gelplatten Kämme Breite der Gele Stärke der Gele Länge der Gele Temperaturkontrolle 79 Reagenzien Long RangerTM Glycerintolerante Gele Formamidgele Kapillarelektrophorese 87 Literatur 87 Nichtradioaktive Methoden 89 Einführung 89 Halbautomatische Sequenzierer 90 AB Chemie der Farbterminatoren Chemie der Farbprimer 97 Optimierung der Sequenzierung mit dem ABI Qualität der Matrize Primerqualität Konzentration von Matrize und Primer 100

4 Inhalt Entfernen nicht eingebauter Markierung Zukünftige Entwicklungen Kräftigere Farbstoffe Verbesserung der elektrophoretischen Auflösung Bessere Software Einheitliche Signalstärke Erhöhter Durchsatz 103 LI-COR 104 Literatur 105 Fehlersuche 107 Einführung 107 Coterminationen Sekundärstruktur Verunreinigte Matrize Sequenzierung in Primernähe Falsche dntp-konzentration Reaktionsbedingungen ditp 113 Kompressionen Basenanaloga Formamidgele 114 Literatur Teil 2: Anwendungen 9. Sequenzbestätigung Einführung Überprüfung von Konstrukten Sequenzierung von Allelvarianten Alternativen zur DNA-Sequenzierung Restriktionsendonucleasen Oligonucleotidhybridisierung PCR Literatur Sequenzierung von PCR-Produkten Einführung Sequenzierung von PCR-Produkten Sequenzanalyse von PCR-Produkten 128

5 8 DNA-Sequenzierung Kopiergenauigkeit anderer Polymerasen 128 Nachweis von Mutanten durch Sequenzierung von PCR-Produkten Primer mit Anhängen Maßgeschneiderte Farbprimer Farbterminatoren Nachweis von Heterozygoten 135 Sequenzierung methylierter DNA 137 Literatur Strategien für die Entschlüsselung neuer Sequenzen Einführung 139 Gezielte und ungezielte Strategien 139 Die Technik der Primerwanderung (primer walking) Restriktionsverdau und Subklonierung 142 Schrotschuß"-Verfahren Häufig schneidende Restriktionsendonucleasen Ultraschall DNase I-Verdau 145 Sequenzierung mit Hilfe von Transposons Deletionsreihen Die Exonuclease schneidet zu schnell oder zu langsam Die Exonuclease baut die DNA vollständig ab Probleme bei der Klonierung von Deletionsprodukten Deletionen mit Hilfe des Literatur Teil 3: Sequenzanalyse 12. Einführung in die Bioinformatik und das Internet (A. Brass) Einführung Die Bioinformatik ist ein theoretisches Fachgebiet, das auf vorhandenem Wissen aufbaut Zugang zu Bioinformatikprogrammen Wie bekommt man einen Zugang zu Programmen im Internet? Navigation im Internet oder: Wie finde ich, was ich suche? 155

6 Inhalt Benutzung von Programmen aus dem Internet Server Zugang zu nützlicher Software auf fremden Computern - anonymes ftp 159 Etikette im Internet Sequenzdatenbanken (A. Brass) 163 Hintergrund 163 Primäre Datenbanken DNA-Datenbanken Genomdatenbanken Datenbanken für Proteinsequenzen Datenbanken für Proteinstrukturen 167 Anmerkungen in primären Sequenzdatenbanken 168 Systeme, die beim Auffinden von Daten helfen Einspeisung einer Sequenz in eine Datenbank Sequenzvergleich und Datenbankrecherche (A. Brass) Einführung 175 Bewertungsmatrices 175 Bewertung von Lücken 178 Vergleich zweier Sequenzen 179 Vergleich mehrerer Sequenzen 179 Vergleich von Sequenzen mit einer Datenbank Wann ist ein Treffer signifikant? 186 Literatur Sequenzierungsprojekte und Contiganalyse (A. Brass) Einführung 189 Klonanalyse Entfernen des Sequenzierungsvektors Entfernen anderer Klonierungsartefakte 190 Zusammenstellung eines Contigs 191 Voraussage proteincodierender Bereiche Codierende Bereiche in cdna Codierende Bereiche in genomischer DNA 194 DNA-Analyse Restriktionskarten Promotoren und andere Kontrollelemente der DNA Voraussage von RNA-Sekundärstruktur 197 Literatur

7 10 DNA-Sequenzierung Prognosen zur Funktion von Proteinen (A. Brass) Einführung 199 Bestimmung einer Proteinfunktion durch Vergleich der Proteinsequenz mit einer Datenbank Hydrophobizität, Transmembranhelices, Leadersequenzen und Sortieren Berechnung von Hydrophobizitätsprofilen Voraussage von Transmembranhelices Leadersequenzen und Lokalisation von Proteinen Coiled coil-strukturen 205 Bestimmung einer Proteinfunktion durch Vergleich der Proteinsequenz mit einer Datenbank für Motive und Profile Motivdatenbanken - PROSITE Profildatenbanken 208 Literatur 2 10 Vorhersage der Proteinstruktur Einführung 211 Informationen zur Proteinstruktur Vorhersage der Sekundärstruktur Vorhersage der Tertiärstruktur Vergleich mit Sequenzen, bekannt ist Homologiemodelle 216 A. Brass) eren Struktur Algorithmen zur Sequenzanpassung und Faltungserkennung 2 17 Kritische Beurteilung von Strukturvorhersagen (critical assessment structure prediction, CASP) 219 Literatur 220 Anhang Anhang A: Glossar 223 Anhang B: Aminosäure- und Nucleotidcode 23 1 Anhang C: Hersteller 233 Adressen 234 Index 237