Auflösung von Ambiguitäten bei der HLA-Klasse I- Typisierung mittels Sequenzanalyse

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1 Aus dem Institut für Transfusionsmedizin der Universität Ulm (Geschäftsführer: Prof. Dr. med. Hubert Schrezenmeier) Auflösung von Ambiguitäten bei der HLA-Klasse I- Typisierung mittels Sequenzanalyse Dissertation zur Erlangung des Doktorgrades der Medizin der medizinischen Fakultät Ulm der Universität Ulm vorgelegt von Luzie Oberdorf geboren in Gießen 2012

2 Amtierender Dekan: Prof. Dr. Thomas Wirth 1. Berichterstatter: Prof. Dr. Hubert Schrezenmeier 2. Berichterstatter: Prof. Dr. Gert Krischak Tag der Promotion:

3 Meinen lieben Eltern gewidmet.

4 Inhaltsverzeichnis I Inhaltsverzeichnis Abkürzungsverzeichnis... III 1 Einleitung Der Haupthistokompatibilitätskomplex (MHC) Aufbau des MHC Polymorphismen Struktur von HLA-Klasse I Molekülen und des HLA-Klasse I Gens Funktion von HLA-Molekülen Gewebetypisierung Serologische Gewebetypisierung Molekulargenetische Gewebetypisierung Ambiguitäten Klinische Anwendung von HLA Problemstellung Material und Methoden Laborgeräte und -materialien Chemikalien, Reagenzien, Enzyme Puffer Primer Probenmaterial verwendete Datenverzeichnisse H-Seq-ABC Sequenzierungskit Ermittlung von PCR-Primersequenzen Verwendete Statistik Primerdesign Polymerase-Kettenreaktion (PCR) Analyse der PCR-Amplifikationen Dokumentation und Interpretation der Amplifikations-Ergebnisse Sequenzierung der generierten Amplifikate Aufreinigung der PCR-Produkte vor der Sequenzierung Ansatz der Sequenzierreaktion (Cycle Sequencing) Aufreinigung der Sequenzierreaktionen und Probenvorbereitung für den Sequenzierlauf Elektrophoretische Analyse der aufgereinigten Sequenzierprodukte am DNA Analyzer 3730S Auswertung der Sequenzen mittels Auswertungsprogramm und Vergleich mit den Ergebnissen der Vortypisierung... 43

5 Inhaltsverzeichnis 2.15 Validierung der PCR-Primer Ergebnisse Ermittlung der geeigneten PCR-Primer Amplifikations-Primerpaare Amplifikations-Primerpaar für den Genort HLA-A Amplifikations-Primerpaare für den Genort HLA-B Amplifikations-Primerpaare für den Genort HLA-C Amplifikations-Ergebnisse und verwendete DNAs mit zugehörigen HLA- Merkmalen Vergleich der HLA-Typisierungs-Ergebnisse mittels Sequenzierung mit den Ergebnissen der HLA-Typisierung mittels Luminex-Verfahren Validierung der PCR-Primer-Sensitivität Zusammenfassung der Ergebnisse Diskussion Vergleich der Methoden zur Gewebetypisierung Diskussion des Testprinzips Zugewinn durch die entwickelten Amplifikations-Primer Zusammenfassung Literaturverzeichnis Danksagung Lebenslauf II

6 Abkürzungsverzeichnis Abkürzungsverzeichnis A ARMS bp C C CD datp dctp ddatp ddctp ddgtp ddntp ddttp dgtp DNA dntp dttp E. coli EDTA Ex2f Ex2r G GvHD HIV HLA HPLC HSP IgA IMGT Int kbp kv Adenin Amplification Refractory Mutation System Basenpaar Cytosin Grad Celsius Cluster of Differentiation Desoxyadenintriphosphat Desoxycytosintriphosphat Didesoxyadenintriphosphat Didesoxycytosintriphosphat Didesoxyguanintriphosphat Didesoxynukleotidtriphosphat Didesoxythymintriphosphat Desoxyguanintrsiphosphat Desoxyribonukleinsäure Desoxynukleotidtriphosphat Desoxythymintriphosphat Escherichia coli Ethylendiamintetraessigsäure Exon 2 forward Exon 2 reverse Guanin Graft-versus-Host-Disease Humanes Immundefizienz-Virus Humanes Leukozyten-Antigen High performance liquid chromatography Hitzeschockprotein Immunglobulin A The International Immunogenetics Information System Intron Kilobasenpaar Kilovolt III

7 M MHC ml ms n NMDP p% PCR PCR-SBT PCR-SSO PCR-SSP pmol POP 7 RNA STR-Analyse T Tm TNF Tris UV Volt µa µl Abkürzungsverzeichnis Morbus Major Histocompatibility Complex Milliliter Millisekunden Anzahl The National Marrow Donor Program Prozentangabe Polymerase-Kettenreaktion Polymerase-Kettenreaktion- Sequence-based typing Polymerase-Kettenreaktion mit sequenzspezifischen Oligonukleotidsonden Polymerase-Kettenreaktion mit sequenzspezifischen Primern Pikomol performance optimized polymer 7 Ribonukleinsäure Short Tandem Repeat-Analyse Thymin Schmelztemperatur Tumornekrosefaktor Tris(hydroxymethyl)aminomethan Ultraviolett Volt Mikroampere Mikroliter IV

8 Einleitung 1 Einleitung 1.1 Der Haupthistokompatibilitätskomplex (MHC) Der Haupthistokompatibilitätskomplex (Abk. MHC von engl. Major Histocompatibility Complex) umfasst eine Gruppe von Genen bei Vertebraten, die Proteine kodieren, die für die spezifische Immunantwort von großer Bedeutung sind. Da eines dieser Moleküle zuerst als Antigen auf Leukozyten nachgewiesen wurde, wird der Haupthistokompatibilitäts-komplex auch als HLA (= Humanes Leukozyten-Antigen) bezeichnet. Die Gene des HLA-Systems sind auf dem kurzen Arm des Chromosoms 6 lokalisiert (6p21.1-6p.21.3) (Breuning et al. 1977). In den 50er Jahren des letzten Jahrhunderts entdeckte Dausset, dass das Serum polytransfundierter Personen Antikörper enthält, die das Blut mancher anderer Personen agglutinieren ließ (Dausset 1954). Als Durchbruch in der Geschichte des Haupthistokompatibilitätskomplexes kann man die Erkenntnis bezeichnen, dass die Überlebensdauer von Hauttransplantaten bei Geschwistern mit identischer HLA- (und ABO-) Konstellation signifikant länger ist als bei Geschwistern, die nur in einem oder keinem HLA-Haplotypen übereinstimmen (van Rood et al. 1966). Damit war bewiesen, dass das HLA-System eine große Rolle in der Gewebeverträglichkeit spielt und auch heute noch die zentrale Rolle bei Transplantationen innehat. Der Haupthistokompatibilitätskomplex ist folglich von großer Bedeutsamkeit in der Vermittlung von Selbst und Nicht-Selbst und gehört zum adaptiven Immunsystem. Seitdem im Jahre 1999 der gesamte MHC im Rahmen des Human Genome Projects aufgeschlüsselt und publiziert wurde (Venter et al. 1999), sind zahlreiche Sequenzierstrategien zur Aufschlüsselung der DNA-Sequenzen entwickelt worden Aufbau des MHC Der humane MHC ist polymorph und besteht aus ca. 4x 10 6 bp (Travers P 2000). Man unterscheidet die als Klasse I bis III bezeichneten Regionen. Unter den HLA-Klasse I Genen sind sowohl funktionale als auch nicht exprimierte Gene zu finden. Die 3 Genorte HLA-A, -B und -C sind für die Antigenpräsentation 1

9 Einleitung an T-Lymphozyten verantwortlich und haben für die Kompatibilität bei Transplantationen die größte Bedeutsamkeit. Aus diesem Grund werden alle Testungen in der hier beschriebenen Arbeit an diesen 3 Genorten durchgeführt. Auch die HLA-Klasse II Region ist polygen und enthält Bereiche, die für verschiedene Antigene kodieren. Zwischen den HLA-Klasse I und Klasse II Regionen liegt der HLA-Klasse III Bereich, zu dem alle Gene zählen, die sich nicht zu den anderen beiden Regionen zuordnen lassen (siehe Abbildung 1.) Langer Arm Kurzer Arm Telomer Zentromer Telomer HLA Region: 6p Klasse II Klasse III Klasse I DP DM DQ DR C4 C2 Hsp70 TNF B C E A G F Abb. 1: Aufbau des Humanen Leukozyten-Antigen (HLA)-Komplexes in Chromosom 6: Auf dem kurzen Arm des Chromosom 6 befindet sich die HLA-Region. Diese ist unterteilt in HLA Klassen I-III mit ihren unterschiedlichen Genorten. HLA: Humanes Leukozyten-Antigen, 6p : kurzer Arm des Chromosom 6, DP: Genort DP, DM, Genort DM, DQ: Genort DQ, DR: Genort DR, C4: Genort C4, C2: Genort C2, Hsp70: Hitzeschockprotein 70, TNF: Tumornekrosefaktor, B: Genort B, C: Genort C, E: Genort E, A: Genort A, G: Genort G, F: Genort F Polymorphismen Polymorphismen sind Punktmutationen, die dazu führen, dass es ein Gen in unterschiedlichen Formen gibt. Bei HLA-Molekülen nennt man diese unterschiedlichen Formen Allele. Innerhalb einer Population gibt es an jedem HLA-Genort eine hohe Anzahl von Allelen. Polymorphismen sind für HLA-Moleküle von großer funktioneller Bedeutung, da letztere eine Antigenbindungsstelle besitzen, um Antigene den T-Zellen zu präsentieren. Rapin et al. haben diese Antigenbindungsstelle 2008 visualisiert und publiziert (Rapin et al. 2008). Daran werden alle zu präsentierenden Proteinfragmente 2

10 Einleitung gebunden und der Organismus kann so zwischen Selbst und Nicht-Selbst unterscheiden Struktur von HLA-Klasse I Molekülen und des HLA-Klasse I Gens HLA-Klasse I und II sind Glykoproteine. Da sich die vorliegende Arbeit auf HLA- Klasse I bezieht, wird an dieser Stelle nur auf die Struktur von HLA-Klasse I Molekülen eingegangen. HLA-Klasse I Moleküle bestehen aus einer schweren polymorphen α-kette und einer leichten nichtpolymorphen β-kette. Die α-kette bildet die wichtige Antigenbindungsstelle, bindet CD4-/CD8, stabilisiert das Molekül in der Zellmembran und dient mußmaßlich der Signaltransduktion. (Roitt et al. 1986, Bjorkman et al 1987) Das HLA-Klasse I Gen besteht aus kodierenden Regionen (Exons), zwischen denen sich jeweils nicht kodierende Regionen (Introns) befinden (Singer und Maguire 1990). In den Exons 2 und 3 liegen die meisten Polymorphismen, weshalb sie für die molekulargenetische HLA-Typisierung relevant sind Funktion von HLA-Molekülen Die zentrale Rolle der HLA-Moleküle im Immunsystem ist es, prozessierte Proteinantigene zu präsentieren, die von T-Lymphozyten erkannt werden können (Hämmerling et al. 1999). Dies dient zur Steuerung der Reifung und Funktion der T-Lymphozyten. Die Verbindung zwischen HLA-Molekülen und T-Lymphozyten ist hierbei die Antigenbindungsstelle auf den HLA-Molekülen. Hier werden die Proteinantigene präsentiert, die von den T-Lymphozyten erkannt und entweder in die Kategorie Selbst-HLA-Molekül oder Nicht-Selbst-HLA-Molekül eingeordnet werden. 1.2 Gewebetypisierung Die Gewebetypisierung dient zur Charakterisierung von Polymorphismen der HLA- Moleküle eines Menschen. Da man heute weiß, dass das Ergebnis von 3

11 Einleitung Transplantationen maßgeblich von der HLA-Übereinstimmung bzw. der HLA- Disparität zwischen Spender und Empfänger abhängt, ist es wichtig, im Vorfeld einer Transplantation deren HLA-Merkmale zu bestimmen. Dazu stehen verschiedene Methoden zur Verfügung. Auf Grund ihrer Wichtigkeit wird in dieser Arbeit auf die serologischen und die molekulargenetischen Methoden zur HLA- Typisierung eingegangen. Bei einer niedrigauflösenden HLA-Typisierung, z.b. durch serologische Verfahren, wird die spezifische Allelgruppe bestimmt (z.b. HLA-A02). Des Weiteren gibt es die hochauflösende HLA-Typisierung, mit der sowohl die Allelgruppe, das spezifische HLA-Protein, Varianten mit synonymer Nukleotidsubstitution, einer Intronvariation und ggf. eines Suffixes aufgelöst wird (z.b. HLA-A*02:101:01:02N). Molekulargenetische Methoden zur HLA-Typisierung können HLA-Merkmale sowohl niedrig- als auch hochauflösend bestimmen. HLA-A*02:101:01:02N HLA-Prefix Gen Allelgruppe Spezifisches HLA-Protein Variante mit synonymer Nukleotidsu bstitution ( stumme Mutation) Suffix Intronvariation Abb. 2: Nomenklatur des Humanen Leukozyten-Antigen (HLA) -Systems HLA: Humanes Leukozyten-Antigen, *:molekulargenetisch definiert, ::Trennungszeichen für Allelbezeichnung (Marsh et al. 2011) 4

12 Einleitung Ein bedeutender Unterschied zwischen serologischen und molekulargenetischen Methoden ist, dass serologische Methoden auf die Expression von MHC- Molekülen auf der Zelloberfläche angewiesen sind, molekulargenetische Methoden dagegen nicht. Serologische Methoden beschreiben das MHC-Molekül selbst. Bei molekulargenetischen Methoden werden dagegen die HLA-Gene betrachtet. Hierbei kommt es nicht darauf an, dass MHC-Moleküle auf der Zelloberfläche exprimiert werden. Die molekulargenetischen HLA- Typisierungsmethoden ermöglichen die Typisierung einer größeren Vielfalt von Allelen und Spezifitäten (Ehrlich et al. 2001) Serologische Gewebetypisierung Die serologische Gewebetypisierung beruht auf dem Mikrolymphozytotoxizitätstest (Terasaki und McClealland 1954). Hierbei verwendet man Antikörper bzw. Antiseren, die für bestimmte HLA-Moleküle spezifisch sind. Diese Antikörper werden mit peripheren Blutlymphozyten inkubiert. Die Antikörper und die peripheren Blutlymphozyten werden zusammen mit Komplement inkubiert. Das Komplement lysiert die Zellen, die an die Antikörper gebunden wurden. Nicht gebundene Zellen bleiben intakt. Das Ergebnis dieses Vorgangs, nämlich lebende und tote Zellen, kann man anschließend durch Zugabe eines Farbstoffs unter dem Mikroskop betrachten. Das Ergebnis der serologischen Typisierung erschließt sich hierbei durch die Korrelation der Verteilung der positiven Testreaktionen mit den eingesetzten Antikörpern bzw. Antiseren und deren Spezifitäten Molekulargenetische Gewebetypisierung Bei der molekulargenetischen Gewebetypisierung wird nicht wie bei der serologischen Gewebetypisierung der Phänotyp des MHC-Moleküls betrachtet, sondern vielmehr der Genotyp. Das geschieht durch Nachweis von Punktmutationen in den einzelnen HLA-Genen. Noreen et al. verglichen 2001 die serologische Gewebetypisierung mit Methoden der molekulargenetischen Gewebetypisierung. Sie fanden heraus, dass es bei der Gewebetypisierung der beiden Methoden in 24% der Ergebnisse zu Diskrepanzen kam. Die molekulargenetischen Methoden werden in dieser Studie als zuverlässiger beschrieben, da sich hierbei im Gegensatz zur serologischen Gewebetestung bei 5

13 Einleitung fast allen.gewebetypisierungen ein Ergebnis erzielen ließ (Noreen et al. 2001). Es gibt verschiedene Methoden zur molekulargenetischen HLA-Typisierung, die im Folgenden dargestellt werden. Die Polymerase-Kettenreaktion (PCR) ist eine Methode zur enzymatischen Vervielfältigung ausgewählter DNA-Sequenzabschnitte. Sie ist die Grundlage aller molekulargenetischen Methoden zur HLA-Typisierung. Durch den Einsatz von 2 Oligonukleotidprimern wird ein bestimmter, von den beiden Primern eingerahmter DNA-Sequenzabschnitt festgelegt. Das Enzym Taq Polymerase vervielfältigt diesen bestimmten DNA-Sequenzabschnitt in einem zyklischen Vorgang. Bei einer Temperaturerhöhung auf C erfolgt die Denaturierung der DNA-Stränge. Anschließend wird die Temperatur auf 65 C abgekühlt und die Primer lagern sich an den komplementären DNA-Strang an. Bei ihrem Temperaturoptimum von 72 C synthetisiert die Taq Polymerase die DNA- Sequenz des komplementären Strangs neu. Neben der genomischen DNA, den beiden Oligonukleotidprimern und der Taq Polymerase enthält der Reaktionsansatz zur Neusynthese eines DNA-Strangs noch die 4 Desoxynukleotide datp, dgtp, dttp und dctp sowie als Kofaktor Magnesiumchlorid. Dieser Amplifikationsvorgang ermöglicht eine exponentielle Vervielfältigung der DNA. Die PCR-Amplifikate können anschließend mit Hilfe von Gelektrophorese und Abfotografieren unter UV-Licht sichtbar gemacht werden. Vosberg beschreibt die Polymerase-Kettenreaktion als eine einfache, schnelle und überaus genaue Methode zur Amplifikation von DNA und RNA bis zu einer Länge von 2 kbp (Vosberg 1989). Im Folgenden werden die gängigsten Methoden zur molekularen HLA-Typisierung näher beschrieben. Mit Hilfe von spezifischen allel- bzw. gruppenspezifischen Primerkombinationen können beim PCR-SSP-Verfahren (siehe Abb. 3) Allele bzw. Allelgruppen differenziert werden. Bei diesem Verfahren werden spezifische Primerpaare hergestellt, die nur zu bestimmten Allelen oder Allelgruppen passen. Die Methode beruht darauf, dass nur Primer, deren Sequenzen vollständig komplementär zur Sequenz der DNA-Matrize sind, ein PCR-Produkt erzeugen. Nicht komplementäre Primer binden dagegen nicht und es wird kein PCR-Produkt erzeugt. Für eine 6

14 Einleitung komplette Typisierung braucht man für jedes Allel eine spezifische Primerkombination. Die DNA-Probe wird dann mit allen Primern getestet. Kommt es bei der Primerelongation zu einer Fehlpaarung (Mismatch) bei einem der beiden Primer, verhindert die Taq Polymerase die Fortführung der Elongation. Bei passender Basenkomibination lässt sich anschließend mittels Gelelektrophorese ein PCR-Produkt von definierter Länge nachweisen, das im Gel als Bande erkennbar ist. Findet keine Amplifikation statt, fehlt diese Bande. Zur Kontrolle der PCR-Amplifikation wird zu jedem PCR-Primerpaar ein Kontroll-PCR- Primerpaar hinzugefügt, das auf jeden Fall zu einem sichtbaren PCR-Produkt führt. Ohne diese Positivkontrolle wäre es schwierig zwischen einer misslungenen PCR-Reaktion und einer negativen PCR-Reaktion zu unterscheiden. Das HLA-Typisierungsergebnis des PCR-SSP-Verfahrens wird anhand des erhaltenen PCR-Produkts und des erwarteten Amplifikationsverhaltens der spezifischen Primerpaare für bestimmte Allele bzw. Allelgruppen interpretiert. Abb. 3: Polymerase Kettenreaktion-Sequenzspezifische Primer (PCR-SSP) In Abb. 3 ist der Ablauf des PCR-SSP-Verfahrens zur Humanen Leukozyten-Antigen (HLA) - Typisierung dargestellt. DNA: Desoxyribonukleinsäure, PCR: Polymerase-Kettenreaktion, matched: gepaart, mismatched: fehlgepaart (Waßmuth 2005) Das Verfahren der Polymerase-Kettenreaktion mit sequenzspezifischen Oligonukleotidsonden (PCR-SSO) funktioniert nach dem Hybridisierungsprinzip. 7

15 Einleitung Nach erfolgter Polymerase-Kettenreaktion werden die entstandenen PCR- Amplifikate als Einzelstrang-DNA an eine Trägermatrix gebunden. Die Oligonukleotidsonden, synthetisch hergestellte Oligonukleotide, werden z.b. mit Digoxigenin markiert, um später wieder identifiziert werden zu können. Die PCR-Amplifikate werden zusammen mit den Oligonukleotidsonden inkubiert, wobei eine Hybridisierung erfolgt durch komplementäre Basenpaarung entsteht. Die spezifischen Hybride aus Gensonde und PCR-Amplifikat können durch indirekte enzymatische Verfahren nachgewiesen werden und werden meist durch Fluoreszenz sichtbar gemacht. Anhand des entstandenen Hybridisierungsmusters wird auf Grund unterschiedlichen Hybridisierungsverhaltens der einzelnen Oligonukleotidsonden das HLA-Typisierungsergebnis interpretiert. Eine Modifikation des PCR-SSO-Typisierungsverfahrens ist das reverse PCR- SSO-Verfahren. Nach diesem Prinzip arbeitet auch die Luminex - Typisierungsmethode, mit welcher die Vortypisierung aller in dieser Arbeit beschriebenen Proben im Vorfeld durchgeführt wurde. Bei diesem Verfahren wird die DNA mittels Lokus-spezifischer Primer amplifiziert. Das Reaktionsmuster wird zur Interpretation des HLA-Typisierungsergebnisses mit Mustern bereits veröffentlichter HLA-Gensequenzen verglichen. Abb. 4: Polymerase-Kettenreaktion-Sequenzspezifische Oligonukleotide (PCR-SSO) In Abbildung 4 ist der Ablauf des PCR-SSO-Verfahrens zur Humanen Leukozyten-Antigen (HLA) - Typisierung dargestellt. DNA: Desoxyribonukleinsäure, PCR: Polymerase-Kettenreaktion (Waßmuth 2005) 8

16 Einleitung Die direkte Sequenzierung (PCR-SBT) dient der Bestimmung der Nukleotid- Abfolge in einem DNA-Molekül. Sie basiert auf dem Kettenabbruchverfahren enzymatisch synthetisierter Extensionsprodukte an einer komplementären DNA- Matrix (Waßmuth, S. 137, 2005). Bei dieser Methode, die die genauesten und weitreichendsten Informationen liefert, werden die genort- bzw. allelspezifischen PCR-Produkte hinsichtlich ihrer Sequenzvariabilität untersucht. Da der Polymorphismus der HLA-Klasse I Gene fast ausschließlich in den Exons 2 und 3 liegt, lassen sich durch die Sequenzierung dieser Bereiche alle funktionell bedeutsamen HLA-A-, -B- und -C-Allele unterscheiden. Nach erfolgter Polymerase-Kettenreaktion werden hier die entstandenen PCR- Produkte aufgereinigt und dann erneut für die direkte Sequenzierung amplifiziert. Das Sanger-Verfahren basiert auf einer modifizierten DNA-Replikation mit Hilfe einer DNA-Polymerase, die beim Einbau von Didesoxynukleotiden (ddntps) zum Kettenabbruch der Synthese führt. (Sanger et al. 1977). Zusätzlich zu den vier üblichen 2 -Desoxynukleotiden, dem PCR-Produkt, den Sequenzierprimern und der DNA-Polymerase enthält der Ansatz auch noch eine gewisse Menge von vier Nukleotiden, die sich dadurch von den anderen unterscheiden, dass ihnen am dritten C-Atom der Ribose die notwendige Hydroxylgruppe fehlt, an die normalerweise das nächste Nukleotid geknüpft wird. Wird statt eines 2 -Desoxynukleotids (dntp) ein solches 2,3 -Didesoxynukleotid (ddntp) eingebaut, kann der Strang nicht weiter verlängert werden. Das Didesoxynukleotid, das eingesetzt wird (ddatp, ddctp, ddgtp oder ddttp), bestimmt also, mit welcher Base die neu synthetisierten DNA-Fragmente enden. Die anschließend im automatischen Sequenzierer befindlichen synthetisierten Fragmente sind mit Fluoreszenzfarbstoff markierten Didesoxynukleotiden gekennzeichnet und werden vom Gerät während der Elektrophorese mittels Laser angeregt und detektiert. Nach dem Cycle Sequencing wird der Ansatz noch einmal kurz aufgereinigt und anschließend in den DNA Analyzer gestellt. Mit Hilfe eines Auswertungsprogramms, das die generierten Sequenzen mit einer aktuellen Version der HLA-Datenbank vergleicht, können die vierfarbigen Sequenzen (eine Farbe für jede Base) angeschaut werden. 9

17 1.3 Ambiguitäten Einleitung Bei Ambiguitäten handelt es sich um Mehrdeutigkeiten der DNA-Sequenz auf Allelebene. Es gibt unterschiedliche Ursachen, warum Ambiguitäten entstehen: Ambiguitäten treten bei der Gewebetypisierung zum Beispiel dann auf, wenn Nukleotidunterschiede außerhalb der amplifizierten Region liegen. Lassen sich bei der HLA-Typisierung von Proben alle polymorphen Positionen bestimmen, ist eine hochauflösende Typisierung möglich. Lassen sich dagegen nicht alle polymorphen Positionen detektieren, so können einige Allele nicht von einander unterschieden werden, es entstehen dadurch Ambiguitäten. Die Auflösung von Ambiguitäten ist von großer Bedeutung, da man bei einer Knochenmarktransplantation eine möglichst große HLA-Kompatibilität zwischen Transplantat-Spender und Transplantat-Empfänger erreichen möchte, um ein möglichst geringes Risiko für eine Abstoßungsreaktion zu erzielen. Für eine Transplantatabstoßung sind in erster Linie die MHC I und II-Gene mit ihren Genprodukten MHC I und MHC II-Molekülen verantwortlich. Alle Menschen, mit Ausnahme von HLA-identischen Geschwistern, unterscheiden sich in ihren MHC I und II-Genen. MHC I und II-Moleküle binden antigene Peptide und präsentieren diese durch antigenpräsentierende Zellen den T-Zellen, die wiederum eine Immunantwort auslösen. Bei Transplantationen sollten Spender und Empfänger möglichst in ihren MHC I und II-Genen übereinstimmen, um eine Transplantatabstoßung zu verhindern. Dies zeigt die wichtige Bedeutung der exakten HLA-Typisierung und somit auch der Auflösung von Ambiguitäten. Da mehr und mehr Allele entdeckt werden und so auch die Zahl an Ambiguitäten wächst, wäre eine Lösung für dieses Problem bei der molekulargenetischen HLA-Typisierung der Einsatz von mehr PCR- Primern, die für eine bestimmte Allelgruppe spezifisch sind. Dadurch können einzelne DNA-Stränge amplifiziert und analysiert werden und somit die Ambiguitäten dieser Allelgruppe aufgelöst werden. 10

18 Einleitung Abb 5: Zuwachs der Anzahl von Allelen zur International Immunogenetics Information System (IMGT) / Humanen Leukozyten-Antigen (HLA) -Datenbank Anhand dieser Grafik wird deutlich, dass ein deutlicher Zuwachs an Humanen Leukozyten-Antigen (HLA) -Klasse I und -II Allelen seit 1987 zu vermerken ist. (Robinson et al. 2011) 11

19 1.4 Klinische Anwendung von HLA Einleitung Transplantationen sind mittlerweile ein etabliertes Therapieverfahren. Das Verfahren kann die Lebensqualität verbessern oder sogar das Überleben eines Patienten ermöglichen. Bei Transplantationen beeinflusst die Übereinstimmung von HLA-Antigenen entscheidend die Transplantatüberlebenszeit. Die meisten Transplantatabstoßungsreaktionen sind auf HLA-Fehlpaarungen zwischen Organspender und Organempfänger zurückzuführen. Der Effekt der HLA- Kompatibilität ist bei den verschiedenen Arten der Organtransplantation unterschiedlich. Die Relevanz der Übereinstimmung der HLA-Antigene bei Nierentransplantationen ist heutzutage gut belegt (Mytilineos et al. 1997). Hierbei sollte vor allem eine Übereinstimmung in den Genorten HLA-A, -B und - DR berücksichtigt werden. Nierentransplantate mit HLA-Fehlpaarungen führen zu einem deutlich schlechteren Transplantationsergebnis. Anders stellt sich dieser Sachverhalt beispielsweise bei Lebertransplantationen dar. Hier scheint eine HLA-Inkompatibilität keinerlei Einfluss auf das Transplantatüberleben zu haben (Opelz et al. 1999). Bei Lebertransplantationen kommt es selbst bei Auftreten von bereits vorhandenen Donor-spezifischen Antikörpern nicht zu einer vermehrten Anzahl an hyperakuten Abstoßungsreaktionen (Donaldson et Williams 1997). Eine überragende Bedeutung hat die HLA-Kompatibilität bei der allogenen Stammzelltransplantation, d.h. Transplantation von Zellen, die im Körper des Transplantatempfängers zur Blutbildung imstande sind. Die allogene Stammzelltransplantation wird vorwiegend bei malignen hämatologischen Erkrankungen, aber auch bei nichtmalignen Erkrankungen wie z. B. der Thalassämie durchgeführt. Hämatopoietische Stammzellen können aus folgenden Quellen gewonnen werden: Knochenmark, peripheres Blut sowie Nabelschnurblut. Das Vorkommen von Graft-versus-Host-Reaktion sowie deren Ausmaß ist maßgeblich abhängig von der HLA-Kompatibilität zwischen Spender und Empfänger des allgogenen Stammzelltransplantats. Welche Genorte oder Mismatchkombinationen entscheidend für die Transplantatabstoßung sowie das Patientenüberleben verantwortlich sind, ist noch nicht abschließend geklärt. Nagler et al. führten im Jahr 1996 das Auftreten von transplantationsassoziierter Mortalität sowie einer GvHD als Konsequenz aus der HLA-C Inkompatibilität auf. 12

20 Einleitung Getestet wurde eine Patientengruppe mit einer Vielzahl von Erkrankungen, denen T-Zell-depletiertes oder -repletiertes Knochenmark transplantiert wurde (Nagler et al. 1996). Petersdorf et al. publizierten 1997 in ihrer Studie den Zusammenhang zwischen HLA-C-Inkompatibilität und Transplantatversagen bei nichtverwandten Spendern (Petersdorf et al. 1997). Eine weitere wichtige Bedeutung hat HLA auch in der Pharmakogenetik. Bei verschiedenen Individuen wirken Arzneimittel unterschiedlich. Dies beeinflusst beispielsweise die HIV-Therapie. Bei Trägern des Allels HLA-B*57:01:01 wurde eine Überempfindlichkeit auf das Medikament Abacavir festgestellt. Es empfiehlt sich deshalb vor Abacavir-Verabreichung die HLA-Merkmale des Patienten zu bestimmen (Chaponda et al. 2011). Einige HLA-Merkmale sind mit bestimmten Erkrankungen assoziiert. Das bedeutet, dass Individuen, die das bestimmte HLA-Merkmal häufiger oder seltener exprimieren als die Normalbevölkerung, ein höheres relatives Risiko haben eine solche Krankheit zu entwickeln. Man spricht von HLA-assoziierten Erkrankungen. Beispiele: Narkolepsie HLA-DR-2, Psoriasis vulgaris HLA-Cw6, M. Bechterew HLA-B27. Die Ursache hierfür ist bisher nicht abschließend geklärt. Es gibt einige Hypothesen wie z.b. die Ähnlichkeit zwischen bakteriellen Erregern und HLA-Molekülen. Eine andere Möglichkeit wäre, dass die HLA-Moleküle als Rezeptoren für krankheitsauslösende Erreger fungieren. Bei der Diagnostik von M. Bechterew hat sich die Bestimmung von B*27 durchgesetzt. Auch in der Narkolepsie-Diagnostik wird DR*2/DQ*6 bestimmt. 1.5 Problemstellung Die allogene Stammzelltransplantation ist eine sehr wirksame und manchmal die einzige Heilmethode für Patienten, die z.b. an Leukämie leiden. Sie birgt jedoch auch lebensbedrohliche Risiken. Durch die Stammzellen, die von einem Spender auf einen Empfänger übertragen werden, erhält der Transplantatempfänger ein neues Immunsystem. Erkennt dieses neue Immunsystem das Patientengewebe als fremd an, kommt es zur Graft-versus-Host-Reaktion (GvHD). Hierbei arbeiten vor allem die T-Zellen des Spenders im Transplantat gegen den Empfängerorganismus, was eine Schädigung aller Organe zur Folge haben kann. 13

21 Einleitung Das Transplantat kann dabei entzündlich geschädigt oder sogar abgestoßen werden. Der Grund für eine GvHD ist eine unterschiedliche Struktur der HLA-Moleküle auf den Zellen von Transplantatspender und -empfänger. Sowohl die Transplantatverträglichkeit als auch das Ausmaß der Transplantatabstoßung stehen eng mit dem Ausmaß der Disparität der HLA-Klasse I und -II Moleküle von Spender und Empfänger in Verbindung. T-Zellen erkennen Epitope in der Antigenbindungsstelle der HLA-Moleküle. Je unterschiedlicher diese Epitope zwischen Spender und Empfänger sind, desto größer ist die Wahrscheinlichkeit für eine Transplantatabstoßung oder dem Auftreten einer GvHD. Da die Antigenbindungsstelle molekularbiologisch den Exons 2 und 3 entspricht, ist es von großer Bedeutung bei der HLA-Typisierung besonders diesen Bereich aufzulösen, um eine bestmögliche Spender-Empfänger-Kompatibilität (Matching) zu ermöglichen. Chen et al. untersuchten das Transplantationsergebnis von 53 an Leukämie erkrankten Kindern nach Stammzelltransplantation mit nichtverwandten Spendern. Sie kamen zu dem Schluss, dass sowohl das Alter der Kinder bei Transplantation, als auch die Art der Leukämie und vor allem das Maß an HLA- Kompatibilität zwischen Spender und Empfänger ein Prädiktor für das Überleben der erkrankten Kinder sei. Je mehr mismatches zwischen Spender- und Empfänger-DNA auftraten, desto schlechter das Outcome (Chen et al. 2010). Auf dem Gebiet der Sequenzierung hat sich in den letzten Jahrzehnten viel getan. Dadurch dass es heute Sequenzierautomaten gibt und man kaum noch von Hand sequenziert, kann man in kürzerer Zeit wesentlich mehr und längere Sequenzen auflösen. So wurden eine Vielzahl bisher nicht bekannter Allele entdeckt. Mit der Zahl der neu entdeckten Allele steigt aber auch die Zahl der Ambiguitäten, die ein bestmögliches Matching zwischen einem Transplantatspender und -empfänger erschweren. In der vorliegenden Arbeit werden deshalb neue allelgruppenspezifische PCR-Primer entwickelt. Mit Hilfe dieser können bisher nicht auflösbare Ambiguitäten in den Sequenzen der wichtigen Exons 2 und 3 bei der HLA-Klasse I-Typisierung mittels Sequenzanalyse aufgelöst werden. Durch die Auflösung der Ambiguitäten kann ein besseres Spender-Empfänger-Matching für die Stammzelltransplantation gewährleistet werden und somit zum Teil lebensbedrohliche Komplikationen minimiert werden. 14

22 Material und Methoden 2 Material und Methoden 2.1 Laborgeräte und -materialien 4,5 ml Röhrchen, Thermo Electron LED GmbH, Langenselbold, Deutschland 8-Kanalpipette Eppendorf Research (Mehrkanal), 0,5-10 µl, Eppendorf AG, Hamburg, Deutschland 8- oder 12-Kanalpipette 5-50 µl, Eppendorf AG, Hamburg, Deutschland 96-well optical reaction plate with barcode Part.No and optical caps, Applied Biosystems GmbH, Foster City, USA 96-well PCR Platten: Thermo-Fast 96, Non-skirted AB-600, ABgene, Epsom, UK Abzugshaube: mc6 Elektromodul, Waldner Holding GmbH und Co. KG, Wangen, Deutschland Analysen-Waage: Sartorius L610D, Sartorius AG, Göttingen, Deutschland Becherglas: Duran 800ml Retrace code , Schott AG, Mainz, Deutschland Chromato Vue Transilluminator Model TS-20, Serva Electrophoresis GmbH, Heidelberg, Deutschland Combitips plus: 0,5ml, 0,1ml, Eppendorf AG, Hamburg, Deutschland Direct Inject Plate (für DNA Analyzer 3730S), Beckman Coulter GmbH, Krefeld, Deutschland Eisschrank: Froster, Philipp Kirsch GmbH, Offenburg, Deutschland Filme für Polaroid-Kamera: FujiFilm FP-3000B professional, Fujifilm Deutschland, Niederlassung der Fujifilm Europe GmbH, Düsseldorf, Deutschland Gel-Elektrophoresekammer: Prod. No 501, Universitätsklinikum Heidelberg: Institut für Immunologie, Deutschland Gummimatte (zum Verschließen der 96-well Platte für Sequencer): Septa(96), Applied Biosystems GmbH, Weiterstadt, Deutschland Janus 4 Tip (Automated Workstation), Perkin Elmer LAS GmbH, Rodgau Jügesheim, Deutschland Kamera Polaroid Gelcam, Hoefer, Inc., Holliston, MA, U.S.A. 15

23 Material und Methoden Klebefolie für 96-well Platten, Thermo Electron LED GmbH, Langenselbold, Deutschland Kühlschrank: Super, Philipp Kirsch GmbH, Offenburg, Deutschland Mehrkanalpipette Research µl, Eppendorf AG, Hamburg, Deutschland Mikrowelle Exquisit 850 Watt Modell ED S, GGV Handelsgesellschaft mbh & Co. KG, Kaarst, Deutschland Multipette plus, Eppendorf AG, Hamburg, Deutschland PCR-Thermocycler GeneAmp PCR Systems 9700, Applied Biosystems GmbH, Foster City, USA PCR-Thermocycler PTC-200, MJ Research, Ltd., Watertown, MA, USA Pipette Eppendorf Research (variabel) 0,5-10 µl, µl, µl, Eppendorf AG, Hamburg, Deutschland Pipettenspitzen: - 10 µl Safe Seal Tips premium, Biozym Scientific GmbH, Hess. Oldendorf, Deutschland µl Safe Seal Tips premium, Biozym Scientific GmbH, Hess. Oldendorf, Deutschland µl Safe Seal Tips premium, Biozym Scientific GmbH, Hess. Oldendorf, Deutschland Präzisionswaage: Scout Pro 2000g, Ohaus Waagen Vertriebs GmbH, Gießen, Deutschland Reaktionsgefäße 1,5 ml, Prod. No , Eppendorf AG, Hamburg, Deutschland Schüttler: Variomag Monoshake, Thermo Electron LED GmbH, Langenselbold, Deutschland Sequencer: DNA Analyzer 3730S, Applied Biosystems GmbH, Weiterstadt, Deutschland Sequenzauswertungsprogramm Sequence Pilot TM -HLA SBT Allele Identification Software, JSI medical systems GmbH, Kippenheim, Deutschland BD Falcon Serologische Pipetten, 5 ml, 25 ml, Becton Dickinson GmbH, Heidelberg, Deutschland Skalpell: Disposable Scalpel, Feather Safety Razor Co., Ltd., Osaka, Japan 16

24 Material und Methoden Spannungsversorger Pharmacia Biotech EPS 300 (für Gel- Elektrophoresekammer), Pharmacia Biotech AG, Uppsala, Schweden Spektralphotometer (zur Einstelllung der DNA-Konzentration): Beckman DU 640, Beckman Coulter GmbH, Krefeld, Deutschland Thermometer: Standard Glasthermometer Best.Nr. E737.1, Carl Roth GmbH und Co. KG, Karlsruhe, Deutschland Tischzentrifuge: Biofuge pico, Heraeus Holding GmbH, Hanau, Deutschland Vortex-Genie 2, Scientific Industries, Inc., Bohemia, NY, USA Zentrifuge: Multifuge3 S-R, Heraeus Holding GmbH, Hanau, Deutschland 2.2 Chemikalien, Reagenzien, Enzyme Agarose Biozym LE, Biozym Scientific GmbH, Hess. Oldendorf, Deutschland Agencourt AMPure (zur Aufreinigung der PCR-Produkte), Beckman Coulter GmbH, Krefeld, Deutschland Agencourt CleanSEQ (Beads) (zur Aufreinigung der Sequenzier-Produkte), Beckman Coulter GmbH, Krefeld, Deutschland Big Dye TM Terminator (Cycle Sequencing Kit Version 1.1) + Sequencing Buffer (5X), Applied Biosystems GmbH, Weiterstadt, Deutschland dntp-sets 100mM (für Mastermix), GE Healthcare, München, Deutschland Ethanol absolute for analysis, Merck KGaA, Darmstadt, Deutschland Ethidiumbromid 0,07%, Inno-Train Diagnostik GmbH, Kronberg, Deutschland HiDi Formamid, Merck KGaA, Darmstadt, Deutschland LiChrosolv -Wasser, Merck KGaA, Darmstadt, Deutschland Master Mix bestehend aus Ammonium Sulfat, Tris, MgCl², Glycerol, Tween, dntp-mix 100mM und LiChrosolv -Wasser, Institut für Klinische Transfusionsmedizin und Immungenetik Ulm ggmbh, Deutschland POP 7 (performance optimized polymer) (Reagenz für Sequenzierautomat 3730), Applied Biosystems GmbH, Weiterstadt, Deutschland 17

25 Material und Methoden Sodium-Acetat buffer solution for molecular biology 3M ph 5,2, Sigma- Aldrich Chemie GmbH, Steinheim, Deutschland Taq DNA Polymerase, 5units/ µl Mat.Nr , Qiagen, Hilden, Deutschland 2.3 Puffer Boratpuffer bestehend aus Borsäure 900mM, EDTA 25mM Titriplex III und Tris(hydroxymethyl)aminomethan 900mM, jeweils von Merck KGaA, Darmstadt, Deutschland Ladepuffer (Bromphenolblau), Fermentas GmbH, St. Leon-Rot, Deutschland 2.4 Primer Primer: mit HPLC aufgereinigt, lyophilisiert, synthesis scale 0,2µmol, Metabion International AG, Martinsried, Deutschland 2.5 Probenmaterial Die anonymisierten DNA-Proben, die für die Polymerase-Kettenreaktion und nachfolgende Sequenzierung zwecks Primer-Austestung verwendet wurden, stammen alle von gesunden Blutspendern. Diese Blutspender haben im Rahmen der Blutspende eine Einwilligungserklärung unterschrieben, dass ihr Blut zu Forschungszwecken verwendet werden darf. Die DNA wurde bereits im Vorfeld aus dem Vollblut der Blutspender gewonnen, um die HLA-Typisierung mittels Luminex Technologie vorzunehmen. Dazu wurde der DNA-Isolierungsautomat Chemagic Magnetic Separation Module I der Firma Chemagen verwendet. 18

26 Material und Methoden Die isolierte DNA mit einer Konzentration von ng/µl wurden in dieser Arbeit verwendet, um die Funktionalität der hier neu entwickelten PCR-Primer zu beweisen. Das Projekt wurde von der Ethikkommission der Universität Ulm beurteilt. Ein positives Votum vom liegt vor. 2.6 verwendete Datenverzeichnisse Exon identities and ambiguous typing combinations des Anthony Nolan Research Institute, Stand Januar The HLA dictionary 2004: A summary of HLA-A, -B, -C, -DRB1/3/4/5 and DQB1 alleles and their association with serologically defined HLA-A, -B, -C, -DR and DQ antigens (Schreuder G.M.Th. et al. 2004) Immunogenetische Datenbank (IMGT/HLA) des Anthony Nolan Research Institute H-Seq-ABC Sequenzierungskit Das H-Seq-ABC Sequenzierungskit des Instituts für Klinische Transfusionsmedizin und Immungenetik Ulm ggmbh wird zur hochauflösenden Typisierung der HLA- Merkmale A, B und Cw eingesetzt. Die Auswertung der Daten erfolgt mittels des Programms Sequence Pilot TM -HLA-SBT Allele Identification Software der Firma JSI Medical Systems GmbH, Freiburg. Einzelne Sequenzen der Exons 2-3 können angesehen werden, heterozygote Positionen und Mismatches werden angezeigt und die Sequenzen können bearbeitet werden. Der Hersteller des H-Seq-ABC Sequenzierungskits ist: DRK-BSD Baden-Württemberg-Hessen ggmbh 19

27 Material und Methoden Das H-Seq-ABC besteht aus den folgenden 3 Komponenten: 1. PCR-Primermix-Satz (Lagerung bei +4 C): Die 8 PCR-Primermixe wurden in Doppelstreifen abgefüllt. Ein Doppelstreifen besteht aus 2 Reihen mit jeweils 8 wells. (siehe Tab.3). Tab. 3: PCR-Primermixe, die in einem Doppelstreifen enthalten sind PCR: Polymerase-Kettenreaktion, AGE: Genort A generisch, A02: Genort A Allelgruppe 02, A24: Genort A Allelgruppe 24, BCG: Genort B Basen C und G, BTA: Genort B Basen T und A, B07: Genort B Allelgruppe 07, B44: Genort B Allelgruppe 44, CGE: Genort C generisch. A AGE AGE B A02 A02 C A24 A24 D BCG BCG E BTA BTA F B07 B07 G B44 B44 H CGE CGE Tab. 4: Spezifität der Primermixe HLA: Humanes Leukozyten-Antigen, PCR:Polymerase-Kettenreaktion, AGE: Genort A generisch, A02: Genort A Allelgruppe 02, A24: Genort A Allelgruppe 24, BCG: Genort B Basen C und G, BTA: Genort B Basen T und A, B07: Genort B Allelgruppe 07, B44: Genort B Allelgruppe 44, CGE: Genort C generisch, CGG: gemeint ist die Basenabfolge CGG, TGA: gemeint ist die Basenabfolge TGA, *: molekulargenetisch definiert, Int: Intron Reihe PCR-Primermix Spezifität A AGE HLA-A*generisch, alle HLA-A-Allele B A02 HLA-A*02 C A24 HLA-A*23, 24 D BCG HLA-B, alle HLA-B-Allele mit dem Motiv CGG an Position Int (HLA-B*13, 15, 18, 27, 37, 40, 41, 44, 45, 46, 47, 49, 50, 54, 55, 56, 57, 82) außer B* 73 E BTA HLA-B, alle HLA-B-Allele mit dem Motiv TGA an Position Int (HLA-B*07, 08, 14, 35, 38, 39, 42, 48, 51, 52, 53, 58, 67, 78, 81) F B07 HLA-B*07, 48 G B44 HLA-B*44, 57 H CGE HLA-C*generisch, alle HLA-C-Allele 20

28 2. Mastermix (Lagerung bei -20 C) Der Mastermix ist in Kryoröhrchen abgefüllt. Material und Methoden 3. Sequenzierprimer-Satz (Lagerung bei -20 C) Die Sequenzierprimer sind in Safe Lock Tubes abgefüllt. Tab. 5: Sequenzierprimer im H-Seq-ABC Kit In Tabelle 5 sind die Sequenzierprimer aufgelistet, die im H-Seq-ABC Kit enthalten sind. HLA: Humanes Leukozyten-Antigen HLA-Locus Etikett Exon Richtung A2F 2 Vorwärts HLA-A A2R 2 Rückwärts A3F 3 Vorwärts A3R 3 Rückwärts B2F 2 Vorwärts HLA-B B2R 2 Rückwärts B3F 3 Vorwärts B3R 3 Rückwärts C2F 2 Vorwärts HLA-C C2R 2 Rückwärts C3F 3 Vorwärts C3R 3 Rückwärts Dieses Sequenzierungskit wurde in der hier vorliegenden Arbeit um 7 PCR- Primerpaare erweitert, um noch mehr Ambiguitäten auf Allelebene auflösen zu können. Alle Methoden zur Austestung der 7 neuen PCR-Primer werden in dieser Arbeit in Anlehnung an die Arbeitsanleitung des HLA-Seq-ABC Sequenzierungskit beschrieben. Für die Austestung der 7 neuen PCR-Primerpaare wurden die in Tabelle 5 aufgelisteten Sequenzierprimer verwendet, um die PCR-Primer in das bereits vorhandene Sequenzierungskit einbauen zu können. Durch das Sequenzierungskit werden die klinisch relevanten Sequenzen der Exons 2 und 3 analysiert. Die Sequenzierung der Exons 2 und 3 erfolgt in beide Richtungen. Zur Durchführung der Sequenzierung mit Hilfe des Sequenzierungskits werden auch einige Materialien benötigt, die vom Hersteller direkt bestellt werden können: 21

29 Material und Methoden Agencourt AMPure, Taq DNA Polymerase und Big Dye TM Terminator Cycle Sequencing Kit Version Sequencing Buffer. Herstellung von Lösungen, die nicht dem Kit beigefügt sind, aber zur Sequenzierung benötigt werden: a) Agarose Gel 2%ig: 6 g Agarose werden in ein Becherglas abgefüllt und ad 300 ml mit 1x Boratpuffer aufgefüllt. Das Gemisch wird in der Mikrowelle aufgekocht und zwischendurch geschwenkt bis die Lösung klar ist. Anschließend stellt man die Lösung unter den Abzug, lässt sie auf 60 C abkühlen und versetzt sie mit 6 Tropfen 0,07% Ethidiumbromid. Die Agaroselösung wird in einen schon vorbereiteten Gelschlitten (mit Kämmen) gegossen. Nachdem das Gel fest geworden ist, werden die Kämme entfernt, und der Gelschlitten samt Gel in eine mit 1x Boratpuffer gefüllt Gelkammer gesetzt. b) 1x Boratpuffer: 200 ml 10 x Boratpuffer werden ad 2000 ml mit Aqua destillata aufgefüllt. c) 10x Boratpuffer: 544,60 g Tris 278,00 g Borsäure 46,52 g EDTA Die 3 Einzelsubstanzen werden abgewogen und ad 5000 ml mit Aqua destillata aufgefüllt. Die Lösung wird umgerührt bis sie vollständig klar ist. d) 1 x EDTA-Laufpuffer: 135 ml LiChrosolv -Wasser werden mit 15 ml 10 x EDTA-Puffer 3730 gemischt. e) Ethanol 70%: 35 ml Ethanol absolut werden mit 15 ml Aqua destilllata gemischt. 22

30 Material und Methoden 2.8 Ermittlung von PCR-Primersequenzen Mit Hilfe des Datenverzeichnisses Exon identities and ambiguous typing combinations des Anthony Nolan Research Institute, Stand Januar 2005 ( das unter anderem alle möglichen Ambiguitäten in den Exons 2 und 3 des HLA-A/B/C Gens auflistet, wurden diejenigen Ambiguitäten eliminiert, die durch das Ulmer H-Seq-ABC Sequenzierungskit aufgelöst werden können. Das H-Seq-ABC Sequenzierungskit enthält die bereits in Punkt 2.7 aufgelisteten Primermixe: AGE, A02, A24, BCG, BTA, B07, B44 und CGE mit ihren jeweiligen Spezifitäten. Somit konnten im HLA-A Genlocus folgende Ambiguitäten aus der Liste gestrichen werden, da sie Hilfe des HLA-Seq-ABC Sequenzierungskits aufgelöst werden können: A*02 + A*beliebig A*23 + A*beliebig A*24 + A*beliebig Nicht aufgelöst werden können die Ambiguitäten: A*02xx + A*02xx A*23xx + A*23xx A*24xx + A*24xx A*23xx + A*23xx (Anmerkung: xx steht hierbei für beliebiges Allel ) HLA-B-Genlocus: Es konnten alle Ambiguitäten aufgelöst und somit gestrichen werden, in denen eine Kombination aus den Spezifitäten der Primer BCG + BTA vorkommen (s. Tab. 4), z.b. B*13 + B*07. Auch gestrichen werden konnten diese folgenden Kombinationen, da sie durch die entsprechenden Primer aufgelöst werden können: 23

31 Material und Methoden B*07 + andere Spezifität aus der BCG-Gruppe z.b.: B*07 + B*13 B*48 + andere Spezifität aus der BCG-Gruppe z.b.: B*48 + B*15 B*44 + andere Spezifität aus der BTA-Gruppe z.b.: B*44 + B*07 B*57 + andere Spezifität aus der BTA-Gruppe z.b.: B*57 + B*08 Ambiguitäten, die nicht gestrichen werden konnten: Eine Spezifität des Primers BCG + eine Spezifität des Primers BCG, z.b. B*13 + B*15 außer B*44 + BCG oder B*57 + BCG Eine Spezifität des Primers BTA + eine Spezifität des Primers BTA, z.b. B*14 + B*08 außer B*14 + BTA oder B*48 + BTA Da im HLA-C-Genlocus nur der Primermix CGE vorliegt, konnte man hier keine vorkommenden Ambiguitäten streichen. 2.9 Verwendete Statistik Alle Ambiguitäten, die nicht durch die Primermixe des H-Seq-ABC ausgeschlossen werden konnten, wurden mit Hilfe des Programms Excel ausgewertet und einer Plausibilitätskontrolle unterzogen. Auf Basis des HLA dictionary 2004 wurde die Häufigkeit, mit der die jeweiligen Allele auftreten, ermittelt und für die Plausibilitätskontrolle herangezogen. Weiterhin wurden die Daten des NMDP (The National Marrow Donor Program ) verwendet. Das NMPD bestimmte die zugrunde liegenden Daten durch die HLA-Typisierung von Personen für HLA-A, Personen für HLA-B und 6234 Personen für HLA-C. 24

32 Material und Methoden Durch die spezifische Häufigkeit des Auftretens eines Allels wurde in der hier vorliegenden Arbeit das prozentuale Auftreten des Allels mit folgender Formel errechnet: spezifische Auftrittshäufigkeit des Allels Gesamtzahl der Personen x 100 = Auftreten des Allels in % Das Ergebnis wurde auf zwei Dezimalstellen auf- bzw. abgerundet. Mit Hilfe der Angabe wie häufig ein jeweiliges Allel auftrat, konnte auch berechnet werden, wie häufig bestimmte Ambiguitäten (in der Tabelle: Kombinationen) auftreten [Bsp.: (Allel 1/Gesamtzahl der Personen)*(Allel 2/Gesamtzahl der Personen)*100]. Das Ganze wurde für die Allele 1-8 bzw. 10 oder 14 berechnet. Am Ende wurde die Gesamthäufigkeit der Ambiguitäten auf eine Anzahl von 100 Proben ausgerechnet und diese so sortiert, dass die Ambiguitäten, die am häufigsten vorkommen oben in der Tabelle stehen. So konnte bestimmt werden, welche Ambiguitäten in der klinischen Diagnostik am häufigsten vorkommen und für welche Ambiguitäten es am sinnvollsten ist, neue Primer zu modellieren, um so viele Ambiguitäten wie möglich auflösen zu können. Bei der Auflistung beschränkten wir uns auf die 25 häufigsten Ambiguitäten. Bsp. für Werte zur Tabelle 11-13: Gesamtzahl der getesteten Personen: Allel 1: A*25:01:01 Allel 2: A*29:02:01 NMDP Häufigkeit Allel 1: 1375 NMDP Häufigkeit Allel 2: 1488 Allel 1/Gesamtzahl der getesteten Personen: 0, Allel 2/Gesamtzahl der getesteten Personen: 0, Allel 1 in %: 2,35 Allel 2 in %: 2,55 25

33 Gesamthäufigkeit auf 100 Proben: 0, ,06% Material und Methoden Tab.6: Skizze des Aufbaus der Tabellen Auflistung der Ambiguitäten im Genlocus (siehe Punkt 3.1 im Ergebnisteil) Kombination 1 Kombination 2 Gesamhäufigkeit auf 100 Proben Allel 1 Allel 2 Kombi 1 in % Allel 3 Allel 4 Kombi 2 in % (errechnet durch Werte aus Kombi 1-7) 2.10 Primerdesign Zur Ermittlung der PCR-Primersequenzen wurden publizierte Sequenzalignments des Anthony Nolan Research Institutes ( verwendet, die die Basenabfolge der Allele der Genorte HLA-A, -B- und -C auflisten. Für die Amplifikation der DNA wurden PCR-Primer hergestellt, die an Positionen innerhalb der DNA-Sequenz anlagern, die für das jeweilige Allel oder eine Allelgruppe eines HLA-Genortes spezifisch sind. Die Bindungsstellen wurden so gewählt, dass sie außerhalb der zu sequenzierenden Exons 2 und 3 liegen. Die Vorwärts-PCR-Primer liegen im Intron 1 des Gens, die Rückwärtsprimer dagegen im Intron 3. Somit sind sowohl Exon 2 als auch Exon 3 eingeschlossen. Exon 1 Intron 1 Exon 2 Intron 2 Exon 3 Intron 3 Vorwärtsprimer Rückwärtsprimer Abb. 5: Aufbau eines Gens und Lage der Polymerase-Kettenreaktion (PCR)-Primer Die Pfeile zeigen an aus welchem Bereich die jeweiligen Primersequenzen stammen. Gelb: Introns, blau: Exons In der immunogenetischen Datenbank (IMGT/HLA) des Anthony Nolan Research Institutes wurden für den PCR-Primer, der sich an die DNA-Sequenz der 26

34 Material und Methoden Allelgruppe A*01 anlagern soll, die Sequenzalignments des HLA-Genlocus A nach für diese Allelgruppe spezifischen Basenabfolgen durchsucht. Entsprechend wurden für die PCR-Primer der Allelgruppen B*08 und B*15 die Introns 1 und 3 im Genlocus B durchsucht sowie für die PCR-Primer der Allelgruppen C*03, C*04, C*07 und C*16 die Introns 1 und 3 im Genort C. Ein Vorwärtsprimer lagert sich mit seiner letzten Base an die DNA an und liest den Strang von rückwärts nach vorwärts. Ein Rückwärtsprimer dagegen bindet mit seiner ersten Base an die DNA. Hierbei wird der Strang von vorwärts nach rückwärts gelesen. Abb. 6: Ausschnitt aus Intron 1 des Genlocus C der Humanen Leukozyten-Antigen (HLA) - Sequenz des Anthony Nolan Research Instituts. ( Primersequenz beispielhaft blau umrahmt. Cw: Genort Cw, *:molekulargenetisch definiert, -:gleiche Base wie oben angegeben, A:Adenin, C:Cytosin, G: Guanin, T: Tymidin. Ein Primer sollte aus zwischen Basen bestehen, damit er eine Schmelztemperatur von C hat. Da die Temperatur zum Anlagern an die DNA (=Annealing) im Thermocycler auf 65 C eingestellt ist, wären 65 C Annealingtemperatur oder auch Schmelztemperatur (Tm) optimal für einem PCR- Primer. Die Länge eines zu entwickelnden PCR-Primers wurde also durch seine Annealingtemperatur limitiert. Die Schmelztemperatur wurde mit Hilfe eines 27

35 Material und Methoden Programms ermittelt, das je nach Base (Adenin, Thymin, Cytosin oder Guanin) unterschiedliche C-Werte verteilt und diese anschließend addiert und somit die aktuelle Annealingtemperatur der in das Programm eingegebenen Basenabfolge angibt. Hierbei wurde die Schmelztemperatur Tm näherungsweise aus dem GC- Gehalt des Primers auf Grundlage der folgenden Gleichung berechnet: Tm = 4 x (Anzahl G bzw. C) + 2 x (Anzahl A bzw. T) Nach der Ermittlung der Schmelztemperatur des Primers wird ein Rückwärtsprimer noch so umgeschrieben, dass er den komplementären DNA- Strang ablesen kann. Erst wird die Sequenzabfolge des Primers durch die komplementären Basen ersetzt und dann die neue Sequenzabfolge in umgekehrter Abfolge aufgeschrieben. 5 -GGG ACC CCT GAT CAG TAT TCT-3 Komplementäre Basen 5 -CCC TGG GGA CTA GTC ATA AGA-3 Abfolge umdrehen 3 -AGA ATA CTG ATC AGG GGT CCC-5 Abb.7: Umschreiben eines Rückwärtsprimers Sequenzen der ursprünglichen Primersequenz werden nochmals mit den jeweils komplementären Basen aufgeschrieben. Anschließend wird die Abfolge der Sequenz umgedreht, um einen Rückwärtsprimer zu erhalten. 5 : 5 -Ende der Sequenz, 3 : 3 -Ende der Sequenz, A: Adenin, C: Cytosin, G: Guanin, T: Thymin. Die Pfeile zeigen auf, welche Schritte nacheinander durchzuführen sind. Die aus den publizierten Sequenzalignments herausgesuchten Primermodelle wurden bei der Firma Metabion, Martinsried, Deutschland in lyophilisierter Form zu 28

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