Phylogenetisches Praktikum im ITZ

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Wilfried Haupt
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1 Phylogenetisches Praktikum im ITZ Zellzyklus- und neuronale Gene in Trichoplax adhaerens S. Sagasser Praktikanten: Patrick Reinke und Jan Kleveman Betreuerin: Karolin von der Chevallerie

2 1) Einleitung - das basalste Metazoon - nur 4-5 Zelltypen - verschiedene Haplotypen H1 - Grell H2 - Roscoff 16S-basierender Baum, M. Eitel

3 2) Gene - P53 - Tumorsuppressorgen - Relevant für Apoptose - bremst die Aktivität vieler Gene P53-Proteinstruktur Figure: de.wikipedia.org/wiki/p53 PCNA-Proteinstruktur Figure: en.wikipedia.org/wiki/ PCNA - PCNA - Klammer an DNA Polymerase - Nur in S-Phase des Zellzyklus exprimiert - Indikator für Zellproliferation SNARE-Phylogeny - SNAP25 - SNARE-Komplex - Vesikel-Membran-Fusion - Neurosekretorischer Apparat Kloepper et al. - SNAREing the Basis of Multicellularity (Mol. Biol. Evol.)

4 3) Methoden Detailerklärung RNA-Isolation DNA-Verdau cdna-synthese PCR-Check (Trox2, Actin) Jan PCR-Amplifikation Nested-PCR Ausschneiden/ A-Tailing/ Aufreinigung Ligation Patrick Transformation Bac-PCR Cycle-Sequencing Detailerklärung

5 - je Haplotyp ca. 100 Tiere - Nukleinsäureisolation 0.8% Gel (Check) - DNA Verdau mit DNase (spätere PCRs sollen ausschließlich exprimierte Gene amplifizieren) - cdna Synthese im Detail - PCR-Kontrolle: cdna wird mit bekannten, funktionierenden und intronübergreifenden Primern für Trox-2 und Aktin amplifiziert und auf 1.2 % Gel aufgetragen RNA-Isolation DNA-Verdau cdna-synthese PCR-Check (Trox2, Actin) PCR-Amplifikation Nested-PCR Ausschneiden/ A-Tailing/ Aufreinigung Ligation Transformation Bac-PCR Cycle-Sequencing

6 M M RNA-Isolation DNA-Verdau cdna-synthese PCR-Check (Trox2, Actin) PCR-Amplifikation 1: cdna H1 1:1 - Aktin 2: cdna H1 1:100 - Aktin 3: cdna H2 1:1 - Aktin 4: cdna H2 1:100 - Aktin 5: gdna H2 1:100 - Aktin 6: gdna H2 1:100 - Aktin 7: Negativkontrolle M: Marker 1KB - PCR: Amplifikation von p53, PCNA und SNAP25 mit H2 2.2 und H1 Karo, H1 8.1 verworfen - Aufreinigung mit NaAc und EtOH bei -80 C Nested-PCR Ausschneiden/ A-Tailing/ Aufreinigung Ligation Transformation Bac-PCR Cycle-Sequencing

7 3) Methoden: cdna-synthese RNA-Isolation DNA-Verdau cdna-synthese PCR-Check (Trox2, Actin) PCR-Amplifikation Nested-PCR Ausschneiden/ A-Tailing/ Aufreinigung Ligation Transformation Bac-PCR Cycle-Sequencing

8 Ligation: Transformation: pgem-t Vektor ß-Galactosidase PCR-Produnkt RNA-Isolation DNA-Verdau cdna-synthese PCR-Check (Trox2, Actin) PCR-Amplifikation Nested-PCR Bac-PCR: für Blau-weiß-Screening xgal als Zusatz Ausschneiden/ A-Tailing/ Aufreinigung Ligation Transformation Bac-PCR Cycle-Sequencing

9 3) Methoden: Cycle-Sequenzing RNA-Isolation DNA-Verdau cdna-synthese PCR-Check (Trox2, Actin) PCR-Amplifikation Nested-PCR Ausschneiden/ A-Tailing/ Aufreinigung Figures: Clark - Molecular Biology; Elsevier 2006 Sequenzierung nach Sanger Fluoreszenz markierte ddntps Figure 2000 by Griffiths et al. Ligation Transformation Bac-PCR Cycle-Sequencing

10 4) Ergebnisse Consensus-Sequenz: vorausgesagte Sequenz: P53 - Übereinstimmung der Consensus-Senquenz 98% P53-Sequenz #1 P53-Sequenz #2 P53-Sequenz #3 vorausgesagte Sequenz: P53-Sequenz #1 P53-Sequenz #2 P53-Sequenz #3 P53-Sequenz #4 P53-Sequenz #5

11 SNAP25 - Übereinstimmung der Consensus- mit der vorausgesagten Sequenz 96% vorausgesagte Sequenz: SNAP25-Sequenz #1 SNAP25-Sequenz #2 SNAP25-Sequenz #3 SNAP25-Sequenz #4 PCNA - Übereinstimmung der Consensus- mit der vorausgesagten Sequenz 99% vorausgesagte Sequenz: PCNA-Sequenz #1 PCNA-Sequenz #2 PCNA-Sequenz #3 PCNA-Sequenz #4

12 5) Diskussion Fehlerdiskussion: Warum nur kurze Fragmente bei der Sequenzierung? - nicht sauber genug gearbeitet - zu viel DNA - Sequenziermaschine Weiteres Vorgehen: Expressionsstudien - RNA-Interferenz - In situ-hybridisierung - Antikörpermarkierung - qpcr

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