Molekularbiologische Diagnostik beim Bronchialkarzinom Methoden und Ergebnisse der EGFR-Mutationsanalyse

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1 Molekularbiologische Diagnostik beim ronchialkarzinom Methoden und Ergebnisse der EGFR-Mutationsanalyse PD Dr. Thomas Mairinger Pathologie, HELIOS Klinikum Emil von ehring 2. randenburger Krebskongress, Potsdam 2011

2 efundzeiten.. Zeitschiene (Werktage) 1 H&E 2 Wann ist Tumorkonferenz???? Immun 3 4 dick schneiden/gewebe extrahieren/dna isolieren/pcr/sequenzierung 5 Postweg 6 Analyse extern randenburger Krebskongress 2011 Interpretation / efunderstellung efundübermittlung 1

3 Histo jede PE: 1 Stufenserie 1* PAS 1* EvG -> Fall wird vorgelegt Standard Anforderungsschein Zusatzuntersuchungen Lungen-PEs 2. randenburger Krebskongress

4 Nach der Immun: Gewinnung des Materials für MolPath aus dem lock Ziel: möglichst viel Material soll übrig bleiben! Markieren des zu untersuchenden Materials (mit Nikon- Markierungsstempel) und Übertragen der Markierung auf einen 20 µm dicken Paraffinschnitt Abschaben des Paraffinmaterials mit einer Pipettenspitze Aufpipettieren des abgeschabten Materials 2. randenburger Krebskongress

5 Zeitraum Sept 2009 August 2010 Untersuchtes Material - Ausschließlich Material aus der Lunge - Typing nach WHO - Interner Eingang streng sequentiell (ALLE NSCLC aus internem Eingang!) - Externe Einsendungen als Vergleichskollektiv Mutationsanalyse - Marodissektion am 20 µm Schnitt - DNA-Extraktion - PCR mit Primer f. Exon 18,19und 21 - Sequenzierung mittels Pyrosequencing - Kontrolle der Positiven mittels Sanger-Sequenzierung - Exon 19 zusätzlich mittels Light Cycler Assay (höhere Sensitivität) 2. Quo randenburger Vadis Afatinib Krebskongress

6 Kollektiv intern/extern Sept. 09-Aug.10 n = 791 Intern 598 (60,1%:39,9%) extern 193 (56%:44%) % 90% 80% 70% 60% 50% 40% 30% 20% 10% 0% intern extern w eiblich männlich w eiblich männlich intern extern männlich weiblich männlich weiblich 2. Quo randenburger Vadis Afatinib Krebskongress

7 Tumortyp männlich intern weiblich intern männlich extern weiblich extern Adeno PE GZ )* )* GZ männl. 44/94 TTF-1 pos GZ weiblich intern: 30/49 TTF-1 pos, 2. Quo randenburger Vadis Afatinib Krebskongress

8 EGFR-Mutationen 1 Jahr Adeno % PE % GZ männl intern 5 3,33 0 0,00 3 3,19 weibl intern 23 15,65 0 0,00 1 2,04 männlich ext 3 0,05 0 0,00 0 0,00 weiblich ext 10 17,24 0 0,00 2 8,00 2. Quo randenburger Vadis Afatinib Krebskongress

9 HJ 2. HJ Alter der Patienten mit EGFR-Mutationen (1. Jahr) HJ 63, HJ 65,5493 Durchschnittsalter externe Einsendungen mean max min 20 intern.ges 66, intern.ges intern.mut extern.ges extern.mut intern.mut 69, extern.ges 64, extern.mut 65, Quo randenburger Vadis Afatinib Krebskongress

10 Interne Mutationen im Vergleich zur Literatur EGFR-Mutationen als prädiktiver Faktor 1 EGF binding EGF binding TM Tyrosinkinase Autophosphorylation Exon Deaktivierende Mutationen D761Y T790M (50%) D770_N771 (ins NPG) D770_N771 (ins SVQ) D770_N771 (ins G), N771T V769L S768I <1% 5% Exon 18 (nucleotide-binding loop) Exon 19 Exon 20 Exon 21 4,1 % 54 % (activation 41,9 % loop) 5% 45% <1% 40-45% G719C G719S G719A V689M N700D E709K/Q S720P ΔE746-A750 ΔE746-T751 ΔE746-A750 (ins RP) ΔE746-T751 (ins A/I) ΔE746-T751 (ins VA) ΔE746-S752 (ins A/V) ΔL747-E749 (A750P) ΔL747-A750 (ins P) ΔL747-T751 ΔL747-T751 (ins P/S) ΔL747-S752 ΔL (E746V) ΔL (P753S) ΔL747-S752 (ins Q) ΔL747-P753 ΔL747-P753 (ins S) ΔS752-I759 V765A T783A L858R (40 45%) N826S A839T K846R L861Q G863D Aktivierende Mutationen 1 Sharma SV et al. Nature Reviews Cancer 2007; 7: randenburger Krebskongress

11 efundzeiten müssen inkl. molekularem Profil gerechnet werden! Zeitschiene (Werktage) 1 Zeitschiene (Werktage) 1 H&E 2 H&E 2 Immun 3 4 dick schneiden/gewebe extrahieren/dna isolieren/pcr/sequenzierung Immun dick schneiden/gewebe extrahieren/dna isolieren/pcr/sequenzierung Postweg Interpretation / efunderstellung efundübermittlung 5 6 Analyse extern randenburger Krebskongress 2011 Interpretation / efunderstellung efundübermittlung

12 Fälle Dauer der Untersuchungen (molekulare Diagnostik) Anzahl Mittelwert Mean September 18 10,11 8 Oktober 74 9,36 10 Juli 2010 Dauer MolPath November 63 10,25 9 Dezember 73 8,04 7 Januar 74 6,34 6 Februar 78 3, März 103 3,48 2 April 70 4,01 4 Mai 61 7,31 7 Juni 75 4, Tage Juli 68 3,65 2 August 74 4, randenburger Krebskongress

13 Eine entsprechende Integration in zeitnahe ehandlungspfade ist möglich Zeitschiene (Werktage) 1 2 dick schneiden/gewebe extrahieren/dna isolieren/pcr/sequenzierung Interpretation / efunderstellung efundübermittlung Sequenzieren im Haus randenburger Krebskongress

14 Sind die Daten valide? 454 ( Deep ) Sequencing und Methodenvergleich 40 Fälle, 10 aus dem HKEv, 1 aus periph. KH, aus Univ.-Kliniken Vergleich der gefundenen Mutationen gegenüber 454 Sequencing Vollbrecht Claudias achelor Thesis Senftenberg/Graz 2011 with permission 2. randenburger Krebskongress

15 Unser Motto: ganz oder gar nicht... Vollbrecht Claudias achelor Thesis Senftenberg/Graz 2011 with permission 2. randenburger Krebskongress

16 Take Home Das untersuchte Kollektiv scheint in ezug auf Alter und Geschlechtsverteilung plausibel und groß genug ei streng sequentieller Untersuchung ALLER Tumortypen zeigen wie erwartet praktisch nur Adeno-Cas Mutationen Die verschiedenen Nachweismethoden für die Mutationen haben unterschiedliche Eigenschaften und sind unterschiedlich verläßlich ei Positivität ist eine Validierung des Ergebnisses anzustreben Eine entsprechende Integration der Mutationsanalyse in zeitnahe ehandlungspfade ist möglich 2. randenburger Krebskongress

17 Vielen Dank! PD Dr. Thomas Mairinger HELIOS-Klinikum Emil von ehring Department Lungenklinik Heckeshorn 2. randenburger Krebskongress