1. Proteinnachweis mit Bradford-Farbreagenz

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1 1. Proteinnachweis mit Bradford-Farbreagenz 96-well-Platte Pipetten (10, 20 und 200 µl) Pipettenspitzen Proteinvorratslösung (1 mg/ml Albumin in destillierten Wasser) Destilliertes Wasser Bradford Farbreagenz (vorher 1:5 verdünnt) Eichgerade erstellen, zeichnen und auswerten. Die Konzentration der Proteine in der unbekannten Probe bestimmen. Fünf Eppendorf-Reagiergefäße für die Standardreihe vorbereiten und beschriften. In das erste Gefäß 0 µl der Proteinvorratslösung geben. In das zweite Gefäß 5 µl der Proteinvorratslösung geben. In das dritte Gefäß 10 µl der Proteinvorratslösung geben. In das vierte Gefäß 15 µl der Proteinvorratslösung geben. In das fünfte Gefäß 20 µl der Proteinvorratslösung geben. Jedes der Gefäße mit destillierten Wasser auf 40 µl auffüllen und gut mischen. Jeweils 20 µl der Standardreihe in je ein well einer 96-well-Platte pipettieren. 20 µl der unbekannten Probe in zwei wells pipettieren. Zu der Standardreihe und der Probe jeweils 200 µl der Bradford Farbreagenz zugeben (alle zugleich!). Die Platte für 15 Minuten auf Raumtemperatur inkubieren. Die Platte im Photometer (Platereader) bei 595 nm vermessen. Eichgerade zeichnen und auswerten (x-achse = mg/ml Protein; y-achse = Extinktion). Mithilfe der Eichgerade die Konzentration der unbekannten Probe bestimmen (in mg/ml Protein). Beispiel einer Eichgerade 1

2 2. Blutzuckermessung Blutzuckermessgerät Blutzuckermesstreifen Lanzetten Stechhilfe Aufgabe: Bestimmung des Glucosegehaltes des Bluts (vor und nach dem Essen) Hände gründlich waschen Messstreifen in Messgerät stecken Warten bis das Gerät einen blinkenden Blutstropfen anzeigt Lanzette in die Stechhilfe einspannen und Schutz entfernen Mithilfe der Stechhilfe in die Fingerkuppe stechen Einen Blutstropfen auf die Spitze des Messstreifens geben Warten bis das Gerät den Messwert anzeigt (in mg/dl) Lanzette und Messstreifen in verschließbaren Behälter entsorgen (Verletzungsgefahr!) 2

3 96-well-Platte Lanzetten Pipetten (10µl, 200µl, 1000µl) Pipettenspitzen Box mit Eis 0,5 M EDTA 0,9% NaCl-Lösung Triglycerid-Reagenz (Infinity Triglycerides) 4mM Glycerin 3. Triglyceridnachweis aus Plasma Gewinnung von Plasma aus einer Blutprobe Die Konzentration der Triglyceride im Blutplasma bestimmen. In ein Regiergefäß 5 µl der 0,5 M EDTA-Lösung geben. Mit Lanzette in Fingerkuppe stechen und Blut in das Reagiergefäß rinnen lassen (ca. 50 µl). Reagiergefäß gut mischen und auf Eis stellen. Blutprobe bei 3500 rpm für 10 Minuten abzentrifugieren. Die klare Flüssigkeit (= Plasma) vorsichtig abpipettieren und in neues Reagiergefäß geben. Plasmaprobe auf Eis stellen, der Rest kann entsorgt werden. Sechs Eppendorf-Reagiergefäße für die Standardreihe vorbereiten und beschriften. In das erste Gefäß 5 µl der 4mM Glycerinlösung geben. In das zweite Gefäß 5 µl der 4mM Glycerinlösung geben + 5 µl 0,9% NaCl; gut mischen. In das dritte Gefäß werden 5µl aus dem zweiten Gefäß gegeben + 5 µl 0,9% NaCl; gut mischen. In das vierte Gefäß werden 5µl aus dem dritten Gefäß gegeben + 5 µl 0,9% NaCl; gut mischen. In das fünfte Gefäß werden 5µl aus dem vierten Gefäß gegeben + 5 µl 0,9% NaCl; gut mischen. In das sechste Gefäß werden 5µl der 0,9% NaCl-Lösung gegeben (Nullwert). Jeweils 2 µl der Standardreihe in ein well einer 96-well-Platte pipettieren (auf Eis!). 2 µl vom Blutplasma in ein well pipettieren. Zu der Standardreihe und der Probe jeweils 200 µl des Triglycerid-Reagenz geben (alle zugleich!!!). Die Platte für 10 Minuten auf 37 C inkubieren. Die Platte im Photometer (Platereader) bei 500 nm vermessen. Eichgerade zeichnen und auswerten (x-achse = mg/ml Glycerin; y-achse = Extinktion). Mithilfe der Eichgerade die Konzentration des Blutplasmas bestimmen (in mg/ml Glycerin). 3

4 4. ph-wert einer Urinprobe bestimmen Spritzflasche mit destillierten Wasser Urinprobe Kalibrierlösungen für ph-meter (ph 4,01; 7,00 und 10,01) Kalibrieren des ph-meters Bestimmung des ph-werts einer Urinprobe ph-messgerät einschalten. Zur Kalibrierung auf CAL drücken. Geeigneten Puffer auswählen und CAL drücken, nicht verwendete Puffer ausschalten. Elektrode aus dem Lagerpuffer holen und gründlich mit destillierten Wasser spülen. Elektrode in die zu messende Pufferlösung tauchen. Auf dem Bildschirm Kalibrier auswählen und CAL drücken. Den Anweisungen auf dem Bildschirm folgen. Nach dem Kalibrieren die Elektrode gründlich mit destillierten Wasser spülen. Elektrode in die Probelösung tauchen und Messwert vom Bildschirm ablesen. Nach dem Gebrauch Elektrode nochmals gründlich mit destillierten Wasser spülen. Elektrode zurück in den Lagerpuffer geben. ph-messgerät ausschalten. 4

5 5. SDS-Page mit Proteinen Pipetten (10 µl, 100µl und 1000 µl) Messzylinder (1000 ml) Stripetten (25 ml) Pipettierhilfe Proteinprobe Petrischale 20x MOPS Running Buffer Gel für die Elektrophorese (4-12% Bis-Tris-Gel mit 15 wells) 4x LDS Sample Buffer Proteinstandard 0,5 M DTE Antioxidans-Lösung Simply Blue Safe Stain (Coomassie dye) Auftrennen einer Proteinprobe über Gelelektrophorese. Sichtbarmachen der Proteinbanden am Gel. In ein Reagiergefäß werden die gewünschte Menge an Protein + 7,5 µl 4x LDS Sample Buffer + 1 µl 0,5 M DTE gegeben und mit destillierten Wasser auf 25 µl aufgefüllt. Den Ansatz für 10 Minuten auf 70 C inkubieren. In einem Reagiergefäß den Proteinstandard vorbereiten: 15 µl destilliertes Wasser + 10 µl Protein Standard + 5 µl 4x LDS Sample Buffer. 30 ml vom 20x MOPS Running Buffer in den 1000 ml Messzylinder geben und mit destillierten Wasser auf 600 ml auffüllen. Das Gel aus der Verpackung nehmen, mit Wasser spülen und vorsichtig den Kamm sowie den weißen Streifen entfernen. Gele mit der Schrift nach außen in die Elektrophoresekammer einspannen (darauf achten das sie sich auch richtig schließen lässt!). Den MOPS-Buffer in den Zwischenraum zwischen den zwei Gelen schütten (bis über die Slots des Geles; es muss dicht sein!) und 500 µl der Antioxidans-Lösung dazugeben. Den restlichen Buffer in die Elektrophoresekammer schütten. Die Slots der Gele mit der Bufferlösung durchspülen (mit Pipette auf- und abpipettieren). Den Standard und die Proteinproben vorsichtig und langsam in die Gelslots pipettieren (darf nicht in ein anderen Slot gelangen!). In leerbleibende Slots 15µl destilliertes Wasser + 5 µl 4x LDS Sample Buffer pipettieren. Elektrophoresekammer verschließen und die Elektrophorese für 1 Stunde bei 175 Volt laufen lassen. Nach der Gelelektrophorese das Plastik um das Proteingel vorsichtig öffnen und das Gel in eine Petrischale legen. Ca. 20 ml des Simply Blue Safe Stains zum Gel geben. Das Gel für 1 Stunde auf einem Schüttler mit geringen rpm geben. Nach der Stunde sind die Proteinbanden am Gel sichtbar. 5

6 6. DNA-Isolation aus Bakterienzellen Pipetten (100µl und 1000 µl) Pipettenspitzen Becherglas Destilliertes Wasser P1 Buffer (50mM Tris-HCl ph 8,0; 10 mm EDTA; 100µg/ml RNase A) TENS Buffer (50 mm NaOH; 5 mm HCL; 0,5% SDS) 3 M Natriumacetat ph 5,2 100% Ethanol 70% Ethanol Isolation von Plasmid-DNA aus Bakterienzellen 1,5 ml der Bakterienkultur werden in ein Reagiergefäß gegeben und bei 5000 rpm für 5 Minuten zentrifugiert. Der Überstand wird abgeschüttet oder abpipettiert (vorsichtig damit das Pellet nicht mitentsorgt wird) Das Pellet wird in 50 µl des P1 Buffers gelöst (auf- und abpipettieren) Zur Lösung werden 300 µl des TENS Buffers gegeben und wird durch fünfmaliges invertieren des Reagiergefäßes durchmischt. Danach werden 100 µl des 3 M Natriumacetatlösung zur Probe gegeben und erneut gemischt. Erneut bei 5000 rpm für 5 Minuten zentrifugieren. Der Überstand wird in ein neues Reagiergefäß überführt (vorsichtig pipettieren). Zum Überstand wird 1 ml eiskalter 100% Ethanol gegeben. Erneut bei 5000 rpm für 5 Minuten zentrifugieren. Der Überstand wird abpipettiert und das Pellet wird mit 0,5 ml 70% Ethanols gewaschen (vorsichtig invertieren). Das Ethanol wird nach dem Waschen vorsichtig abpipettiert (es muss sämtliche Flüssigkeit entfernt werden) und das Pellet wird für 10 Minuten bei geöffneten Reagiergefäß luftgetrocknet. Das luftgetrocknete Pellet wird in 30 µl destillierten Wassers gelöst (auf- und abpipettieren). Bei dem gelösten Pellet handelt es sich um die Plasmid-DNA (Ansatz A). 6

7 7. Schneiden von Plasmiden mit Enzymen Pipetten (2µl und 20 µl) Pipettenspitzen (mit Filter) Box mit Eis Plasmid-DNA Restriktionsenzyme Buffer für die Enzyme (CutSmart Buffer und NEBuffer 3.1) Schneiden des HisMax C Plasmids mit zwei Restriktionsenzymen. Jeweils 1 µg der Plasmid-DNA in zwei Reagiergefäß (Ansätze B und C) pipettieren und auf 16 µl mit destillierten Wasser auffüllen. 2 µl vom Enzymbuffer sowie zum Ansatz B 1µl eines Restriktionsenzyms und zum Ansatz C jeweils 1 µl von zwei Restriktionsenzymen dazu pipettieren (Enzyme mit Filterspitzen langsam einrühren ). Ansätze bei 37 C in ein Wasserbad für 30 Minuten inkubieren. Nach den 30 Minuten ist die Plasmid-DNA geschnitten und kann auf ein Agarosegel aufgetragen werden. 7

8 8

9 Pipetten (10 µl und 100 µl) Pipettenspitzen Erlmeyerkolben Messzylinder DNA-Probe 1x TAE-Buffer Agarose 6x Loading Dye DNA-Farbstoff DNA-Standard (GeneRuler Laddermix) Auftrennung und Sichtbarmachung von DNA. 8. Gelelektrophorese mit DNA Die Gelkammern sowie die Gussform für das vorbereiten. Für ein 140 ml 1%iges Agarosegel mit 20 Slots werden 1,4 g Agarose eingewogen. Die Agarose wird in einen Erlmeyerkolben gegeben und es werden 140 ml 1x TAE-Buffer dazugegeben. Der Buffer wird nun bis zum Aufkochen erhitzt (die Lösung muss klar sein). Danach werden 12 µl des DNA-Farbstoffes zur Agaroselösung gegeben. Die Lösung in die Gussform schütten und sichergehen das keine großen Luftblasen vorhanden sind. Die Kämme für die Slots im Gel einsetzen. Das Gel aushärten lassen (dauert circa 30 Minuten) In der Zwischenzeit zu der vorher im Punkt 6 gewonnenen DNA (Ansatz A) 5 µl des 6x Loading Dye geben. Zu der in Punkt 7 geschnittenen Plasmid-DNA (Ansätze B und C) jeweils 3,3 µl des 6x Loading Dye geben. Zusätzlich als Kontrolle 1 µg des ungeschnittenen Plasmids aus Punkt 7 in neues Reagiergefäß pipettieren und auf 20 µl mit destillierten Wasser auffüllen (Ansatz D). Zum Ansatz D ebenfalls 3,3 µl des 6x Loading Dye geben. Nachdem das Gel ausgehärtet ist, vorsichtig die Kämme entfernen und es in die Elektrophoresekammer geben. Die Elektrophoresekammer mit 1x TAE-Buffer auffüllen bis das Gel komplett in der Flüssigkeit eingetaucht ist. Vorsichtig den DNA-Standard sowie die DNA-Proben (Ansätze A, B, C und D) in die Slots pipettieren (darf nicht in die anderen Slots gelangen). Das Gel für 45 Minuten bei 110 Volt laufen lassen. Danach kann man unter UV-Licht (Augen schützen!) die DNA-Banden erkennen. 9

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