Von der Gemeinsamen Naturwissenschaftlichen Fakultät. der Technischen Universität Carolo-Wilhelmina. zu Braunschweig. zur Erlangung des Grades einer

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1 Untersuchungen zu molekularen und zellulären Interaktionen im Prozeß der Eliminierung von Lebermetastasen in einem murinen Zell-vermittelten Therapiemodell Von der Gemeinsamen Naturwissenschaftlichen Fakultät der Technischen Universität Carolo-Wilhelmina zu Braunschweig zur Erlangung des Grades einer Doktorin der Naturwissenschaften (Dr.rer.nat.) genehmigte Dissertation von Susanne Müerköster aus Braunschweig

2 Inhaltsverzeichnis I. Einleitung 1 1. Allgemeine Einführung 1 2. Tumorentstehung und Metastasierung Tumorentstehung Metastasierung 2 3. Imrountherapeutische Strategien gegen maligne Krebserkrankungen Tumorimmunologische Grundlagen Immunologische Therapiemöglichkeiten Unspezifische Immuntherapie Passive Immuntherapie Aktive Immuntherapie Adoptive Immuntherapie 6 4. Adoptive Immuntherapie (ADI) im ESb-Tumormodell Therapiemodell Tumormodelle für die Untersuchung der ADI 8 5. Die T-Zell-vermittelte Immunantwort Antigenerkennung und Aktivierung von antigenpräsentierenden Zellen Aktivierung von T-Lymphozyten Bedeutung der CD40-CD40Hnteraktion Apoptose induzierter Zelltod Superantigene und MMTV Strukturelle und funktioneile Organisation der Leber Aufgabenstellung 18 II. Material & Methoden Tierexperimentelle Verfahren Mausstämme Inokulationsmethoden Anästhesie Bestrahlung Therapiemodell In vivo Blockierung von Sn und CD40L 20

3 2. Zellbiologische Verfahren Zellinien Zellkulturbedingungen Kultivierung von Hybridomazellen Präparation von Milzzellen Präparation von Sn + -Makrophagen aus der Milz Unspezifische Stimulation der Milz Aufbereitung der Erythrozyten aus Schafsblut Isolierung von Sn + -Makrophagen Isolation von dendritischen Zellen aus der Milz Präparation von Vß6 + -T-Lymphozyten aus der Milz Generierung SAg-reaktiver Vß6 + -T-Lymphozyten gegen SAg + Tumorzellen Isolation von Vß6 + -T-Zellen mit Hilfe der magnetischen Separation Immunbiologische Verfahren Antikörper Zusatzreagenzien Aufreinigung von Antikörpern aus Zellkulturüberständen Immunhistochemische Färbung von Gewebeschnitten Schneiden und Fixieren Einfachfärbung mit Enzym-konjugierten Zweitantikörpern Einfachfärbung mit biotinylierten Antikörpern Einfachfärbung des SAgs mit Hilfe der indirekten Tyramid Signal Amplifikation Mehrfachfärbungen Entwicklung der Substratreaktionen Substratreaktion für Peroxidase-konjugierte Zweitantikörper Substratreaktion für alkalische Phosphatase-konjugierte Zweitantikörper Detektion von apoptotischen Zellen Detektion von apoptotischen Zellen auf Gefrierschnitten mit dem TUNEL-Test Bestimmung der frühapoptotischen Zellen durch Annexin-V-Färbung In situ Hybridisierung von Sn- und inos-rna auf Gefrierschnitten Präparation der DNA-Templates 34

4 III In vitro Transkription und Digoxigenin-Markierung der RNA Überprüfung der Transkripte durch Elektophorese In situ Hybridisierung auf Gefrierschnitten Präparation von Schnitten für die Eletronenmikroskopie Durchflußzytometrie Färbung von Oberflächenmolekülen für die FACS-Analyse Enzyme Linked Immuno Adsorbend Assay (ELISA) In vitro Tests mit lebenden Zellen Generierung Tumor-spezifischer Effektorzellen Zytotoxizitätstest ReStimulierung der generierten zytotoxischen T-Zellen gegen ß-Galaktosidase (Re-) Stimulierung der immunisierten und nichtimmunisierten Vß6 + -T-Zellen Cr-Freisetzungstest Zytotoxizitätsmessung durch Propidiumjodid Inkorporation Kompetitionstest und Neutralisation der kompetitiven Wirkung Tumorzellwachstumsinhibitionstest 43 HI. Ergebnisse Rolle der Sn + -Makrophagen in der metastasierten Leber während der ADI Bedingungen für die Verteilung und Expression von Sn in der Leber Aktivierungsstatus von Sn + -Makrophagen während der ADI Zeil-Zeil-Assoziationen von Sn + -Makrophagen mit dendritischen Zellen und T-Lymphozyten Proliferation von Cluster-assoziierten T-Lymphozyten In vivo Blockierung von Sn in der metastasierten Leber während der ADI Antigenpräsentation durch MHC I-Moleküle auf Sn + -Makrophagen in vitro Prozessierung und Präsentation von ß-Galaktosidase bzw. deren Peptid durch MHC I-Moleküle auf Sn + -Makrophagen Blockierung von Sn während der Restimulation Überprüfung der MHC I-Spezifität für die Antigenpräsentation auf Sn + -Makrophagen Potential von Sn + -Makrophagen und dendritischen Zellen bezüglich der Antigenprozessierung und -Präsentation durch MHC I-Moleküle 60

5 IV 1.7 Effektorfunktion von Sn + -Makrophagen in der metastasierten Leber während der ADI inos-expression in der metastasierten Leber während der ADI inos-expression auf Sn + -Makrophagen Detektion und Charakterisierung von apoptotischen Zellen Kolokalisation von Sn + -Makrophagen und inos-expression mit apoptotischen Zellen Involvierung der CD40-CD40L-Interaktion in die Stimulierung von inos während der ADI Kinetik der CD40- und CD40L-Expression in der Leber während der ADI Charakterisierung der CD40-exprimierenden Zellpopulationen CD40/iNOS Ko-Expression in der Leber während der ADI In vivo Blockierung von CD40L während der ADI Herunterregulation von CD40 und inos durch die Blockierung von CD40L Bedeutung der Superantigenexpression auf Lebermetastasen und der Superantigen-reaktiven T-Lymphozyten während der ADI Detektion des S Ags auf Lebermetastasen Infiltration von Vß6 + -T-Zellen in die metastasierte Leber während der ADI Charakterisierung der Leber infiltrierenden Vß6 + -T-Zellen Cluster-Bildung von Vß6 + -T-Zellen mit aktivierten Sn + -Makrophagen ADI-Behandlung von tumortragenden Tieren mit Vß6 + -T-Zellen Inhibition der Proliferation von ESb-MP-Zellen durch Vß6 + -T-Zellen Zytokinprofil von in vitro stimulierten Vß6 + -T-Zellen Zytotoxizität von Vß6 + -T-Zellen gegen SAg-exprimierende Tumorzellen in vitro MHC- und MHC Ü-Expression auf SAg + und SAg Tumorzellen Überprüfung der zytotoxischen Reaktivität gegen SAg + und SAg" Tumorzellen Vergleich von SAg hoch und SAg * 1 " exprimierenden Zellen zur Stimulierung von Vß6 + -T-Zellen Inhibition der Tumorzellyse durch Blockierung von Oberflächenmolekülen Inhibition der spezifischen Lyse von ESb-MP-Zellen durch Kompetition mit SAg + CH 12.S7-Zellen und deren Neutralisation 89

6 2.8.6 Induktion von Apoptose in ESb-MP-Zellen durch Vß6 + -T-Zellen 90 IV. Diskussion Rolle der Sn + -Makrophagen in der metastasierten Leber während der ADI Bedingungen für die Akkumulierung und Expression von Sn in der Leber Aktivierungsstatus von Sn + -Makrophagen während der ADI Clusterformationen von Sn + -Makrophagen mit dendritischen Zellen und T-Lymphozyten in vivo Blockierung von Sn in der metastasierten Leber während der ADI Rolle der Sn + -Makrophagen bei der Antigenpräsentation durch MHC I- Moleküle in vitro Potential von Sn + -Makrophagen und dendritischen Zellen bezüglich der Antigenprozessierung und -Präsentation durch MHC I-Moleküle Effektorfunktion von Sn + -Makrophagen und die Bedeutung der CD40-CD40L-Interaktion in der metastasierten Leber während der ADI Bedeutung der Superantigen-reaktiven T-Lymphozyten während der ADI Charakterisierung der Leber infiltrierenden Vß6 + -T-Zellen SAg-reaktive Vß6 + -T-Zellen als Anti-Tumoreffektorzellen in vivo Induktion einer zytostatischen und zytotoxischen Immunantwort von Vß6 + -T-Zellen gegen SAg + -Tumorzellen in vitro 107 V. Zusammenfassung 113 VI. Literaturverzeichnis 115 VII. Anhang 130 Abkürzungen 130