Inaugural-Dissertation

Transkript

1 Prospektive Analyse des Einsatzes systemischer Antimykotika bei Tumorpatienten und Therapeutisches Drug Monitoring systemischer Antiinfektiva aus biologischen Matrizes Inaugural-Dissertation zur Erlangung des Doktorgrades (Dr. rer. nat.) der Fakultät für Chemie, Pharmazie und Geowissenschaften der Albert-Ludwigs-Universität Freiburg im Breisgau vorgelegt von Werner Christian Neubauer geboren in Grünstadt / Pfalz 2010

2 Dekan der Fakultät: Prof. Dr. Harald Hillebrecht Vorsitzender des Promotionsausschusses: Prof. Dr. Rolf Schubert Referent: Prof. Dr. Manfred Jung Korreferentin: Prof. Dr. Monika Engelhardt Drittprüferin: Prof. Dr. Regine Süss Datum der Verpflichtung:

3 Die vorliegende Arbeit entstand in der Zeit von Oktober 2006 bis Februar 2010 in der Abteilung Innere Medizin I (Schwerpunkt Hämatologie & Onkologie) des Universitätsklinikums Freiburg unter der fachlichen Leitung von Frau Prof. Dr. Monika Engelhardt. Ihr gilt mein besonderer Dank für die hervorragende Betreuung, ihren unermüdlichen und äußerst motivierenden Einsatz, die vielseitigen Aspekte wissenschaftlichen und klinischen Arbeitens, die ich von ihr lernen durfte, die Förderung bei Kongressen und Publikationen sowie die optimale Arbeitsatmosphäre. Weiterhin danke ich Herrn Prof. Dr. Manfred Jung für die freundliche Aufnahme in seinen Arbeitskreis am Institut für Pharmazeutische Wissenschaften, die Unterstützung der Arbeit durch viele konstruktive Diskussionen und Anregungen sowie die sehr angenehme Betreuung. Darüber hinaus möchte ich danken Herrn Prof. Dr. Klaus Kümmerer für die gute Betreuung des analytischen Teils der Arbeit und die Möglichkeit, diese Arbeiten am Institut für Umweltmedizin und Krankenhaushygiene des Universitätsklinikums Freiburg durchführen zu können. Frau Prof. Dr. Regine Süss für ihre freundliche Bereitschaft, als Drittprüferin zur Verfügung zu stehen. allen Kollegen der Abteilung Innere Medizin I für die sehr angenehme Zusammenarbeit, insbesondere Prof. Dr. Ralph Wäsch, Prof. Dr. Hartmut Bertz, Dr. Alf Zerweck, Dr. Anemone Finck und Volker Schmidt sowie Herrn Prof. Dr. Dr. h.c. Roland Mertelsmann für die freundliche Unterstützung der Arbeit. dem Team der Sektion für Good Clinical Practice, Klinische Studien und Qualitätsmanagement der Abteilung Innere Medizin I für die wunderbare und freundschaftliche Arbeitsatmosphäre. allen Kollegen der Klinikumsapotheke für die gute Zusammenarbeit; insbesondere danke ich Herrn Dr. Martin Hug und Herrn Prof. Dr. Egid Strehl für die vielseitige Unterstützung und Förderung. Herrn Armin König für die freundschaftliche und konstruktive Zusammenarbeit und die entspannte Atmosphäre im Labor. allen Kollegen aus den Arbeitskreisen von Prof. Dr. Jung, Prof. Dr. Engelhardt und Prof. Dr. Kümmerer für die herzliche Aufnahme und freundschaftliche Atmosphäre. der Firma Merck Sharp & Dohme GmbH für die finanzielle Unterstützung der Arbeit. Insbesondere danke ich Frau Dr. Barbara Gerlach und Frau Sibyll Escher für die angenehme Zusammenarbeit. Abschließend danke ich meinen Eltern und meiner Schwester für die vielseitige Unterstützung während der gesamten Studien- und Promotionszeit und meiner Freundin Karolin, die mich mit ihrem Optimismus ständig motiviert hat und immer für mich da ist.

4 Aus der Dissertation hervorgegangene Publikationen Originalarbeiten Neubauer W, Koenig A, Bolek R, Trittler R, Engelhardt M, Jung M, Kuemmerer K. Determination of the antifungal agent posaconazole in human serum by HPLC with parallel column-switching technique. Journal of Chromatography B 2009; 877: Neubauer W, König A, Bolek R, Müller A, Kümmerer K. Determination of vancomycin in human tracheal aspirate by HPLC with heart-cut column-switching technique. (eingereicht) Neubauer W, Engelhardt M, König A, Hieke S, Jung M, Berz H, Kümmerer K. Therapeutic drug monitoring of posaconazole in hematological patients - experience with a new HPLC-based method. (eingereicht) Neubauer W, Jung M, Hieke S, Zerweck A, Bertz H, Wäsch R, Engelhardt M. Potential drug interactions, side effects and costs of systemic antifungal agents in the hematology and oncology setting - an analysis in 250 consecutive highrisk cancer patients. (in Vorbereitung) Tagungsbeiträge als Vortrag Neubauer W, Kleber M, Thierry V, Goebel A, Lubrich B, Bertz H, Engelhardt M. Detailed analysis of systemic antifungal treatment: efficacy, side effects and drug interactions in consecutive cancer patients on a general hematology/oncology and an autologous and allogeneic transplant-ward for developing standardized guidelines. 41. Jahrestagung der Deutschsprachigen Mykologischen Gesellschaft (DMykG), , Berlin. Neubauer W, Kleber M, Thierry V, Goebel A, Lubrich B, Bertz H, Engelhardt M. Detailed analysis of systemic antifungal treatment: efficacy, side effects, and drug interactions in 87 consecutive cancer patients for developing standardized guidelines for systemic antifungal treatment in high-risk cancer patients. Jahrestagung der Deutschen, Österreichischen und Schweizerischen Gesellschaften für Hämatologie und Onkologie (DGHO, ÖGHO, SGMO), , Basel.

5 Neubauer W, Zerweck A, Goebel A, Lubrich B, Bertz H, Engelhardt M. Therapeutic and prophylactic use of systemic antifungal agents in cancer patients a prospective analysis of clinical parameters, side effects, drug interactions and costs. Jahrestagung der Deutschen, Österreichischen und Schweizerischen Gesellschaften für Hämatologie und Onkologie (DGHO, ÖGHO, SGMO), , Mannheim. Tagungsbeiträge als Poster Neubauer W, Kleber M, Thierry V, Goebel A, Lubrich B, Bertz H, Engelhardt M. Therapeutic and prophylactic use of systemic antifungal drugs in cancer patients - a prospective analysis of clinical parameters, side effects, drug interactions and risk factors. 23. Symposium der International Association for Comparative Research on Leukemia and Related Diseases (IACRLRD), , Freiburg. Neubauer W, Kleber M, Zerweck A, Thierry V, Goebel A, Lubrich B, Bertz H, Engelhardt M. Analysis of efficacy, safety and potential drug interactions of systemic antifungal agents in 144 consecutive high-risk cancer patients for the establishment of standardized guidelines. 42. Jahrestagung der Deutschsprachigen Mykologischen Gesellschaft (DMykG), , Jena. Neubauer W, Kleber M, Zerweck A, Thierry V, Goebel A, Lubrich B, Bertz H, Engelhardt M. Analysis of efficacy, safety and costs of systemic antifungal agents in 159 consecutive high-risk cancer patients for the establishment of standardized guidelines. 50. Jahrestagung der American Society of Hematology (ASH), , San Francisco. Neubauer W, Hug MJ, Jung M, Strehl E, Engelhardt M. Tätigkeit des Apothekers im interdisziplinären Team der Hämatologie und internistischen Onkologie. 34. Wissenschaftlichen Kongress des Bundesverbands Deutscher Krankenhausapotheker (ADKA), , Darmstadt. Auszeichnung mit dem Posterpreis.

6 Neubauer W, Jung M, Kümmerer K, Engelhardt M. Therapeutic drug monitoring of antifungal agents in hematological patients - first experience with a newly developed method for the determination of posaconazole in human serum. 43. Jahrestagung der Deutschsprachigen Mykologischen Gesellschaft (DMykG), , Köln. Neubauer W, Zerweck A, Goebel A, Lubrich B, Bertz H, Engelhardt M. Invasive mycoses in high-risk cancer patients - a prospective analysis of clinical parameters, side effects, drug interactions and costs for the safe and economically appropriate use of systemic antifungal agents. 51. Jahrestagung der American Society of Hematology (ASH), , New Orleans. Weitere Veröffentlichungen (Buch- und Zeitschriftenbeiträge) Neubauer W, Hug MJ, Bertz H, Strehl E, Engelhardt M. Die Rolle des Apothekers bei der Erarbeitung klinischer Leitlinien am Beispiel des Einsatzes systemischer Antimykotika bei Tumorpatienten. Krankenhauspharmazie 2009; 30: Berger D, Engelhardt M, Mertelsmann R. (Hrsg.) Das Blaue Buch. Chemotherapie-Manual Hämatologie und Internistische Onkologie, 2. Auflage, Springer Verlag Engelhardt M, Berger D, Mertelsmann R. (Hrsg.) Das Blaue Buch. Chemotherapie-Manual Hämatologie und Onkologie, 3. Auflage, Springer Verlag Neubauer W, Goebel A, Lubrich B. Arzneimittelinteraktionen und -inkompatibilitäten. In: Berger D, Engelhardt R, Mertelsmann R. (Hrsg.) Das Rote Buch. Hämatologie und Internistische Onkologie, 4. Auflage, Ecomed Verlag (im Druck) Potthoff K, Scheele J, Neubauer W, Waesch R. Targeted Therapies. In: Berger D, Engelhardt R, Mertelsmann R. (Hrsg.) Das Rote Buch. Hämatologie und Internistische Onkologie, 3. Auflage, Ecomed Verlag (im Druck)

7 Engelhardt M, Spoo A, Thierry V, Kleber M, Neubauer W, Waesch R. Hematopoietic growth factors: much ado about something? In: Spyridonidis A. (Hrsg.) New insights on hematopoietic cell transplantation (im Druck)

8 Inhaltsverzeichnis 1 Thema der Arbeit Einleitung Invasive Mykosen bei Tumorpatienten Risikopopulationen Epidemiologie Mortalität Indikationen des Einsatzes systemischer Antimykotika Prophylaxe Empirische Therapie Präemptive Therapie Therapie nach Erregernachweis Systemische Antimykotika in Hämatologie und Onkologie Polyene Amphotericin B Azole Fluconazol Voriconazol Posaconazol Echinocandine Caspofungin Antimykotische Kombinationstherapien Therapeutisches Drug Monitoring Hochdruckflüssigkeitschromatographie Massenspektrometrie Prospektive Analyse des Einsatzes systemischer Antimykotika auf drei hämato-onkologischen Stationen des Universitätsklinikums Freiburg Hintergrund und Ziele Methodik Klinische Datenerfassung Untersuchte Parameter Ergebnisse... 36

9 3.3.1 Kosten des Einsatzes systemischer Antimykotika Patientenpopulation Einsatz systemischer Antimykotika bei Patienten nach allogener, autologer und ohne periphere Blutstammzelltransplantation Vergleichende Darstellung der Daten für liposomales Amphotericin B, Voriconazol, Caspofungin und Posaconazol Antimykotische Kombinationstherapien in der untersuchten Kohorte Nachgewiesene Erreger in der untersuchten Kohorte Derzeitige interne Leitlinie der Abteilung Innere Medizin I des Universitätsklinikums Freiburg zum Einsatz systemischer Antimykotika Diskussion Bestimmung von Posaconazol aus humanem Serum mittels HPLC und fluorimetrischer Detektion Hintergrund Bestehende Methoden Methodik Ausgangsstoffe und Lösungsmittel Kalibration Patientenproben HPLC: Einfache Säulenschaltung Ergebnisse und Diskussion Selektivität Linearität Sensitivität Wiederfindung Richtigkeit und Präzision Methodenentwicklung: Optimierung wichtiger Schritte Methodenentwicklung: Detektionsverfahren Klinische Anwendung bei hämatologischen Patienten Patientenpopulation Datenerfassung und relevante Definitionen Statistische Analyse Ergebnisse... 73

10 Patientencharakteristika Gemessene Posaconazol-Serumspiegel Einfluss von Alter, Geschlecht, Grunderkrankung und Anzahl der Begleitmedikamente Einfluss der parallelen Gabe von Pantoprazol Einfluss der allogenen Stammzelltransplantation Korrelation mit hepatotoxischen Effekten Korrelation mit prophylaktischer Wirksamkeit Spiegelbestimmungen bei Patienten unter Posaconazol-Therapie Diskussion Bestimmung von Vancomycin aus humanem Trachealaspirat mittels HPLC und UV/VIS-Detektion Hintergrund Bestehende Methoden Methodik Ausgangsstoffe und Lösungsmittel Kalibration Patientenproben HPLC: "Heart-Cut"-Säulenschaltung Ergebnisse und Diskussion Selektivität Linearität Sensitivität Wiederfindung Richtigkeit und Präzision Methodenentwicklung: Optimierung wichtiger Schritte Klinische Anwendung bei Frühgeborenen Abbildungsverzeichnis Tabellenverzeichnis Abkürzungsverzeichnis Literaturverzeichnis

11 Thema der Arbeit 1 1 Thema der Arbeit Die vorliegende Arbeit befasst sich zum einen mit der prospektiven Analyse des Einsatzes systemischer Antimykotika bei hämato-onkologischen Patienten und zum anderen mit dem Therapeutischen Drug Monitoring systemischer Antiinfektiva aus biologischen Matrizes. Invasive Mykosen haben signifikanten Einfluss auf die Morbidität und Mortalität hämatoonkologischer Patienten. Insbesondere mit langandauernden Neutropenien assoziierte zytostatische Therapien bergen ein hohes Risiko für infektiologische Komplikationen und im Besonderen invasive Pilzinfektionen. Zugelassene systemische Antimykotika weisen eine Vielzahl unerwünschter Arzneimittelwirkungen und potentieller Arzneimittelinteraktionen auf. Stringente Ein- und Ausschlusskriterien führen bei klinischen Studien zu einer Vorselektion von Patienten mit gutem Allgemeinzustand und geringer Komorbidität, weswegen diese die klinische Realität nur unzureichend abbilden. Aus diesem Grund ist die Analyse unselektierter Patientenkohorten notwendig und klinisch hochrelevant. Die im Rahmen dieser Arbeit durchgeführte prospektive Untersuchung des Einsatzes systemischer Antimykotika bei konsekutiven Tumorpatienten erfolgte auf drei hämato-onkologischen Stationen des Universitätsklinikums Freiburg. Erhaltene Daten wichen z.t. erheblich von früheren Studienergebnissen ab. So wurde u.a. bei Posaconazol eine deutlich höhere Rate hepatotoxischer Effekte gesehen als in früheren Studien gezeigt. Zudem wiesen alle untersuchten Arzneistoffe zahlreiche potentielle Arzneimittelinteraktionen auf. Arzneimittelinteraktionen sind meist nur mit Hilfe von Blutspiegelmessungen sicher nachweisbar. Die Verfügbarkeit entsprechender analytischer Methoden und die regelmäßige Durchführung derartiger Analysen ist daher essentielle Vorraussetzung für einen sicheren und effektiven Medikamenteneinsatz. Dies gilt insbesondere für den durch eine äußerst komplexe Pharmakotherapie gekennzeichneten Bereich der Hämatologie und Onkologie. Im Rahmen dieser Arbeit wurde eine analytische Methode zur Bestimmung des Azol- Antimykotikums Posaconazol aus humanem Serum entwickelt, welche in der Folge für die Analyse von Proben hämato-onkologischer Patienten eingesetzt wurde. Dabei konnte eine an gesunden Probanden beschriebene Interaktion mit dem Protonenpumpeninhibitor Esomeprazol für Pantoprazol als weiteren Vertreter dieser Wirkstoffklasse bestätigt werden. Auch bei anderen systemischen Antiinfektiva ist die Durchführung regelmäßiger Spiegelbestimmungen sinnvoll, wobei Messungen am Ort der Infektion häufig klinisch relevanter sind als in Blutserum. Im Rahmen der vorliegenden Arbeit wurde erstmals eine

12 Thema der Arbeit 2 analytische Methode zur Quantifizierung des Glykopeptid-Antibiotikums Vancomycin aus humanem Trachealaspirat entwickelt und zur Analyse von Proben pädiatrischer Intensivpatienten erfolgreich angewandt.

13 Einleitung 3 2 Einleitung 2.1 Invasive Mykosen bei Tumorpatienten Risikopopulationen Invasive Mykosen stellen für immunsupprimierte Patienten eine erhebliche Bedrohung mit hohen Morbiditäts- und Mortalitätsraten dar. Patienten mit hämatologischen und onkologischen Erkrankungen unterliegen dabei dem weitaus höchsten Risiko, gefolgt von Patienten mit Lungenerkrankungen, Organtransplantierten und mit dem humanen Immundefizienz-Virus (HIV) infizierten Patienten. Abbildung 1 veranschaulicht dies beispielhaft für das Krankheitsbild der invasiven Aspergillose. Abbildung 1: Zugrundeliegende Erkrankungen bei 595 Patienten mit invasiver Aspergillose (aus [1]). SOT: Organtransplantation, BMT: Knochenmarktransplantation. Im Bereich der Hämatologie und internistischen Onkologie ist die Häufigkeit invasiver Mykosen vor allem bei Patienten mit schwerer und langanhaltender Neutropenie bzw. Granulozytopenie erhöht. Hierzu gehören Patienten nach allogener und autologer Knochenmark- oder Stammzelltransplantation (SZT) sowie Patienten unter hochdosierter Induktions-Chemotherapie zur Behandlung akuter Leukämien oder myelodysplastischer Syndrome (MDS) [2,3].

14 Einleitung Epidemiologie Durch den Einsatz intensiver Hochdosis-Therapieprotokolle, die Entwicklung und Anwendung effektiver Immunsuppressiva und die Behandlung immer älterer Patienten ist die Zahl immungeschwächter Hochrisiko-Patienten und damit auch die Häufigkeit systemischer Pilzinfektionen im Bereich der Hämatologie und internistischen Onkologie in den letzten Jahren kontinuierlich gestiegen [3]. Zu unterscheiden sind dabei durch Hefepilze ausgelöste Infektionen von solchen, deren Ursache Schimmelpilze sind. Während Hefepilze zur physiologischen Flora von Haut- und Schleimhäuten gehören und sich erst bei verstärkter Immunsuppression als fakultativ pathogene Erreger in Form einer Mykose manifestieren können, gelangen die ubiquitär im Boden vorkommenden Schimmel- oder Fadenpilze meist über die Atemluft in den Körper und verursachen bei immunsupprimierten Patienten vorwiegend pulmonale Infektionen. Abbildung 2 zeigt die Häufigkeitsverteilung Mykosen-auslösender Pathogene bei Patienten nach SZT oder Organtransplantation. Abbildung 2: Auslöser invasiver Mykosen unter Patienten nach SZT oder Organtransplantation (aus [1]). PCP: Pneumocystis carinii-pneumonie. In Abbildung 2 ist zu erkennen, dass Pilze der Gattung Candida die weitaus häufigsten Auslöser invasiver Mykosen unter den Hefepilzen darstellen. In den USA liegen sie bei den Sepsis-verursachenden Keimen als häufigste Pilzgattung an vierter, in Europa an fünfter Stelle [4-6]. Während die Spezies C. albicans lange für die überwiegende Zahl systemischer Hefepilz-Infektionen verantwortlich war, erfolgte in den letzten Jahren eine deutliche Verschiebung in Richtung so genannter non-albicans-arten, zu denen beispielsweise C. glabrata, C. krusei, C. parapsilosis oder C. tropicalis zählen, die mittlerweile fast die Hälfte aller Candidosen ausmachen [7]. Neben Vertretern der Gattung Candida ist im Bereich der Hefepilze allenfalls noch Cryptococcus neoformans von epidemiologischer Bedeutung. Bei den Schimmelpilzen nehmen Infektionen mit Vertretern der dominierenden Gattung Aspergillus unter hämatologischen und onkologischen Patienten weiter zu und stellen für

15 Einleitung 5 diese eine massive Bedrohung dar. Neben A. fumigatus sind hier vor allem auch A. terreus, A. flavus und A. niger als klinisch relevante Pathogene zu nennen. Mit einer kumulativen Inzidenz von bis zu 10% ein Jahr nach SZT weisen allogen stammzelltransplantierte Patienten das höchste Risiko für invasive Aspergillosen auf. Dieses liegt deutlich über dem von autolog transplantierten Patienten (Abbildung 3). Abbildung 3: Inzidenz nachgewiesener und wahrscheinlicher invasiver Aspergillosen am Fred Hutchinson Cancer Center, Seattle ( ). Dunkel: allogene SZT, Hell: autologe SZT (aus [8]). Im Gegensatz zu vielen bakteriellen Infektionen treten invasive Mykosen und hierbei insbesondere Infektionen mit Aspergillus spp. häufig auch noch Monate nach allogener SZT auf (Abbildung 4). In Einzelfällen wird sogar von Infektionen bis zu zehn Jahre nach Transplantation berichtet, wobei hier ein ursächlicher Zusammenhang mit der SZT nicht eindeutig belegt werden kann [9]. Abbildung 4: Zeitlicher Verlauf des Auftretens nachgewiesener oder wahrscheinlicher invasiver Aspergillosen nach allogener SZT (aus [10]).

16 Einleitung 6 Wie bei Aspergillus spp. wird in den letzten Jahren auch unter Zygomyzeten (Rhizopus, Mucor, Rhizomucor) und bei Vertretern der Gattung Fusarium eine Zunahme der Infektionshäufigkeit beobachtet [1,10-15] Mortalität Da invasive Pilzinfektionen bei Immunkompetenten äußerst selten sind, ist deren Anteil an der Gesamtmortalität mit weniger als 0,01% sehr gering. Allerdings steigt die Anzahl der durch systemische Mykosen bedingten Todesfälle in den USA kontinuierlich an, was vor allem auf eine Zunahme von Infektionen mit Aspergillus spp. zurückzuführen ist. Die Candida-assoziierte Mortalität nimmt dagegen seit einigen Jahren ab [16]. Im Gegensatz zu Immunkompetenten sind die Morbiditäts- und Mortalitätsraten in Zusammenhang mit Pilzinfektionen bei Patienten mit hämatologischen oder onkologischen Erkrankungen sehr hoch, was insbesondere für Patienten mit nachgewiesener Aspergillus- Infektion nach allogener SZT zutrifft (Abbildung 5). Trotz deutlicher therapeutischer und diagnostischer Verbesserungen in den vergangenen Jahren liegt die kumulative Mortalität ein Jahr nach Diagnosestellung mit über 70% immer noch weit über der Mortalitätsrate der meisten bakteriellen Infektionen [8,17]. Abbildung 5: Gesamt-Überleben von Patienten nach allogener SZT ab Diagnosestellung einer invasiven Aspergillose (aus [17]). Ursachen für die seit einigen Jahren verbesserte Prognose liegen unter anderem in der Weiterentwicklung diagnostischer und therapeutischer Möglichkeiten (u.a. serologische Testung auf β-d-glucan, Markteinführung von Voriconazol) sowie einer veränderten

17 Einleitung 7 Transplantpraxis (u.a. Verwendung peripherer Blutstammzellen statt Knochenmark) Indikationen des Einsatzes systemischer Antimykotika Tabelle 1: Indikationen des Einsatzes systemischer Antimykotika. BAL: bronchoalveoläre Lavage. Indikation Prophylaxe Empirische Therapie Präemptive Therapie Therapie nach Erregernachweis Definition Kein Anhaltspunkt für eine Infektion Antibiotika-refraktäres Fieber unklarer Genese in der Neutropenie, erhöhter CRP-Wert im Serum Pilzverdächtige Infiltrate im CT-Thorax, positive Testung auf Aspergillus-Antigen Eindeutiger Erregernachweis aus Biopsat von normalerweise steriler Körperstelle oder aus BAL Prophylaxe Der Nutzen des Einsatzes systemischer Antimykotika aus prophylaktischer Indikation ist bisher nur für Höchstrisiko-Patienten belegt. So konnte in zwei Studien gezeigt werden, dass Patienten nach allogener SZT von einer Prophylaxe mit Fluconazol 400 mg/d profitieren [18,19]. Eine Reduktion der Inzidenz systemischer Mykosen konnte in beiden Studien nachgewiesen werden (15,8% vs. 2,8%, 18% vs. 7%), wohingegen ein Einfluss auf das Gesamtüberleben nur durch letztere belegt ist [19]. Bei allogen stammzelltransplantierten Patienten mit schwerer Graft-versus-Host-Disease (GvHD, häufige immunologische Komplikation nach SZT mit hohem Einfluss auf Morbidität und Mortalität), erwies sich Posaconazol 600 mg/d in der Vermeidung invasiver Mykosen als ebenso effektiv wie Fluconazol 400 mg/d, wobei der Schutz gegenüber invasiven Aspergillosen signifikant besser (2,3% vs. 7,0%) und die Rate pilzbedingter Todesfälle signifikant niedriger war (1% vs. 4%) [20]. Auch bei Patienten mit akuter myeloischer Leukämie (AML) oder MDS unter Induktions- Chemotherapie war Posaconazol 600 mg/d gegenüber Fluconazol oder Itraconazol (jeweils 400 mg/d) überlegen. Dies konnte hinsichtlich der Inzidenz invasiver Mykosen allgemein (2% vs. 8%) und invasiver Aspergillosen (1% vs. 7%) sowie des Gesamtüberlebens gezeigt werden (Abbildung 6) [21].

18 Einleitung 8 Abbildung 6: Neutropenische Patienten mit AML oder MDS: Zeit bis zum Auftreten einer invasiven Mykose (A) oder bis zum Tod des Patienten (B) (aus [21]). In anderen als den genannten Patientenpopulationen (u.a. Lymphom-Patienten oder Patienten nach autologer SZT) konnte der Nutzen einer systemischen antimykotischen Prophylaxe bisher nicht belegt werden [22-25]. Mögliche Gründe hierfür sind eine geringere Immunsuppression dieser Patienten bzw. weniger intensive Chemotherapien und dadurch kürzere neutropenische Episoden. Drei Studien zur Effektivität und Verträglichkeit des prophylaktischen Einsatzes von liposomalem Amphotericin B bei hämatologischen Patienten lieferten sehr heterogene Daten und führten nicht zur Zulassung des Arzneistoffs in dieser Indikation [26-28]. In einer Studie an n=132 hämatologischen Patienten mit verlängerter Neutropenie konnte eine signifikante Reduktion der Häufigkeit nachgewiesener oder wahrscheinlicher Pilzinfektionen (7% vs. 35%) bei Gabe von 50 mg liposomalem Amphotericin B jeden zweiten Tag gezeigt werden, wobei dies nur für invasive Aspergillosen, nicht jedoch invasive Candidosen zutraf [26]. Die Gabe von 2 mg/kg Körpergewicht dreimal wöchentlich führte dagegen zu keiner

19 Einleitung 9 signifikanten Reduktion der Häufigkeit invasiver Mykosen bei n=161 hämatologischen Patienten [27] und die hochdosierte wöchentliche Gabe mit 7 mg/kg Körpergewicht bei n=21 Patienten zu einer hohen nebenwirkungsbedingten Abbruchquote von 33% [28] Empirische Therapie Eine empirische antimykotische Therapie liegt vor, wenn der Einsatz systemischer Antimykotika bei Antibiotika-refraktärem Fieber unklarer Genese in der Neutropenie oder erhöhten Werten des Entzündungsparameters C-reaktives Protein (CRP) im Serum erfolgt (Tabelle 1). Aufgrund des fehlenden klaren Infektfokus eignen sich vor allem Substanzen mit breitem Wirkspektrum für diese Behandlungsstrategie. Die empirische Therapie entwickelte sich aus dem Wissen darüber, dass die Prognose von Patienten mit invasiven Mykosen stark von der zeitnahen Initiierung einer adäquaten Therapie abhängt, die Diagnostik dabei aber komplex und zeitaufwändig ist und nur in ca % der Fälle einer febrilen Neutropenie zur Erregersicherung intra vitam führt [29]. Abbildung 7 zeigt beispielhaft die Auswirkungen einer verzögerten antimykotischen Therapie auf die Mortalität bei Patienten mit nachgewiesener Candidämie [30]. Abbildung 7: Korrelation zwischen Mortalität und Zeit bis zur Initiierung einer Therapie mit Fluconazol bei positivem Kulturnachweis von Candida spp. (aus [30]). Erstmals nachgewiesen werden konnte die Effektivität empirischer antimykotischer Therapien mit konventionellem Amphotericin B, dessen zusätzliche Gabe bei neutropenischen Patienten zu einer häufigeren Senkung des Fiebers gegenüber einer ausschließlich antibiotischen Behandlung führte (69% vs. 53%) [31]. Im Rahmen dieser Studie konnte jedoch keine Verbesserung des Gesamtüberlebens gezeigt werden. Eine

20 Einleitung 10 Untersuchung mit liposomalem Amphotericin B konnte zeigen, dass dessen empirischer Einsatz bei gleicher Effektivität vor allem hinsichtlich des Auftretens nephrotoxischer Effekte (19% vs. 34%) signifikant besser verträglich ist als bei konventioneller Formulierung [32]. Wichtigster Nachteil der empirischen Strategie ist die häufig unnötige Behandlung vieler Patienten bei noch ausstehender Diagnostik. Dies führt zu hohen Behandlungskosten sowie hohen Raten unerwünschter Arzneimittelwirkungen und Arzneimittelinteraktionen. Zudem wird hierdurch auch die Entwicklung von Resistenzen begünstigt [33-36]. Trotz dieser Aspekte wird die empirische Therapie in der Situation einer prolongierten Neutropenie häufig angewandt, da die Patienten hierbei von invasiven Mykosen hochgradig bedroht sind und ein verzögerter Einsatz systemischer Antimykotika wie erwähnt zu einer deutlichen Erhöhung der Mortalität führt Präemptive Therapie Beim präemptiven Therapieansatz liegt im Gegensatz zur empirischen Therapie ein klarer Infektfokus in Form pilzverdächtiger Infiltrate in der computertomographischen Darstellung des Thorax (CT-Thorax, Abbildung 8) oder einer positiven Testung auf Aspergillus-Antigen im Blutserum vor. Abbildung 8: Dringend pilzverdächtige Infiltrate im CT-Thorax eines Patienten mit AML (aus [9]). Sowohl das radiologische als auch das serologische Verfahren stellten sich als verlässliche

21 Einleitung 11 Instrumente bei der Diagnostik invasiver Mykosen in neutropenischen Patienten heraus. Vorteile der präemptiven gegenüber der empirischen Therapie sind die seltenere unnötige Applikation von Antimykotika und damit einhergehend niedrigere Behandlungskosten, seltenere Neben- und Wechselwirkungen sowie eine geringere Resistenzrate. Ein wichtiger Nachteil der präemptiven Behandlungsstrategie ist die ungenügende Erfassung von Pilzinfektionen, die nicht durch Arten der Gattung Aspergillus ausgelöst werden. Dies liegt daran, dass für diese Infektionen eine zur serologischen Testung auf Aspergillus-Antigen äquivalente Diagnostik noch nicht verfügbar ist [37-41] Therapie nach Erregernachweis Die antimykotische Therapie nach Erregernachweis ist eine aus klinischer Sicht gewünschte Situation, da der betreffende Erreger gezielt eradiziert werden kann und aufgrund der gesicherten Mykose kein unnötiger Antimykotika-Einsatz erfolgt. Kriterien für das Vorliegen einer gesicherten invasiven Mykose sind der direkte Nachweis des Erregers in bestimmten Körperflüssigkeiten (Blutkultur, bronchoalveoläre Lavage [BAL], Liquor) oder Gewebeproben von normalerweise sterilen Körperstellen. Der Nachweis kann über eine mykologische Kultur oder im Rahmen histologischer Untersuchungen erfolgen [42]. Aufgrund der zeitaufwändigen Diagnostik sowie der potentiellen Gefährdung von Patienten, die für die Durchführung einer BAL oder Biopsie-Entnahme (z.b. aufgrund erhöhter Blutungsgefahr) ungeeignet sind, werden ein Erregernachweis und die nachfolgende konkrete Behandlungsstrategie leider selten erreicht. Meist wird aufgrund der Bedeutung eines zeitnahen Therapiebeginns (zunächst) eine empirische oder präemptive antimykotische Therapie initiiert. Aufgrund der niedrigen Obduktionsrate in Deutschland (ca. 5%), die auch am Universitätsklinikum Freiburg mit etwa 14% nur unwesentlich höher liegt, kann der Verdacht auf eine invasive Mykose als Todesursache selbst post mortem häufig nicht verifiziert werden.

22 Einleitung Systemische Antimykotika in Hämatologie und Onkologie Die derzeit für die Therapie und Prophylaxe invasiver Mykosen im Bereich der Hämatologie und internistischen Onkologie zur Verfügung stehenden Substanzklassen umfassen Polyene, Azole und Echinocandine. Auf eine Beschreibung der früher häufig eingesetzten Substanzen Flucytosin und Griseofulvin wurde bewusst verzichtet, da diese im klinischen Alltag hämato-onkologischer Stationen heute praktisch keine Rolle mehr spielen Polyene Aus der Wirkstoffklasse der Polyene wird derzeit nur Amphotericin B systemisch eingesetzt. Andere Vertreter der Substanzklasse wie Nystatin oder Natamycin weisen eine für den systemischen Gebrauch zu hohe Toxizität auf und werden nur topisch angewandt. Die Ursache der intolerablen Toxizität liegt darin, dass Polyene neben ihrer Affinität zu Ergosterol auch mit dem strukturverwandten Cholesterol interagieren. Diese Substanz erfüllt wiederum in der tierischen Zelle wesentliche Aufgaben, u.a. für die Stabilität der Zytoplasmamembran. Der Wirkmechanismus der Polyene besteht in einer Interaktion mit dem essentiellen und strukturgebenden Pilzzellmembran-Bestandteil Ergosterol, die zu Porenbildung, zum Verlust der Integrität und letztlich zur Lyse der Pilzzelle führt [43] (Abbildung 9). Abbildung 9: Wirkmechanismen verschiedener Antimykotika-Klassen (aus [43]).

23 Einleitung Amphotericin B Abbildung 10: Strukturformel Amphotericin B. Über mehrere Jahrzehnte war Amphotericin B (Abbildung 10), ein Produkt aus Stämmen von Streptomyces nodosus, neben Griseofulvin und Flucytosin die einzig verfügbare Substanz zum Einsatz in der systemischen antimykotischen Therapie. Entsprechend umfangreich sind die Erfahrungen mit der Anwendung dieses seit den 1950er Jahren eingesetzten Arzneistoffs, allerdings auch mit der hohen Rate unerwünschter Arzneimittelwirkungen bei systemischer Gabe. So wird die Anwendung der konventionellen galenischen Formulierung (Amphotericin B - Desoxycholat) vor allem durch nephrotoxische Effekte und Unverträglichkeitsreaktionen während der Infusion (Schüttelfrost, Fieber) eingeschränkt [44,45]. Nicht zuletzt aus diesem Grund wurden Lipidformulierungen des Wirkstoffs entwickelt, wobei besonders mit dem liposomal verkapselten Amphotericin B sowie dem Amphotericin B - Lipidkomplex ein deutlich verbessertes Toxizitätsprofil bei gleicher Wirksamkeit erreicht wurde. So konnte gezeigt werden, dass die Rate nephrotoxischer Effekte durch Einsatz von liposomalem Amphotericin B gegenüber der konventionellen Formulierung mehr als halbiert wird [36,45]. Trotz der verbesserten Verträglichkeit neuer galenischer Formulierungen hat das Auftreten nephrotoxischer Effekte noch immer relevanten Einfluss auf Mortalität und Dauer des Klinikaufenthalts behandelter Patienten. Zudem führt der Einsatz dieser Präparate zu deutlich höheren Behandlungskosten als bei Verwendung der konventionellen Formulierung [36,45-48]. Amphotericin B interagiert mit einer Vielzahl von Arzneistoffen, wobei diese Interaktionen überwiegend pharmakodynamisch und daher meist gut vorhersagbar sind. Zu nennen sind verstärkende nephrotoxische Effekte mit Zytostatika (z.b. Cisplatin) oder anderen Antiinfektiva (z.b. Vancomycin, Aminoglykoside) und verstärkte Hypokaliämien bei Gabe mit Glucocorticoiden oder nicht-kaliumsparenden Diuretika [49].

24 Einleitung 14 Das Wirkungsspektrum von Amphotericin B ist sehr breit (neben Candida spp. und Aspergillus spp. auch Cryptococcus, Mucor und Fusarium umfassend), weswegen sich der Arzneistoff gut für die empirische antimykotische Therapie eignet [36]. Keine Wirksamkeit besteht gegenüber A. terreus. Der Arzneistoff wird oral zu weniger als 5% resorbiert und muss daher intravenös appliziert werden. Die terminale Halbwertszeit beträgt bis zu mehrere Wochen, therapeutisch relevante Liquorspiegel werden bei schlechter ZNS- Penetration (<10%) nicht erreicht [43]. Zugelassen ist liposomales Amphotericin B in Deutschland zum Einsatz in der empirischen Therapie sowie zur Behandlung schwerer systemischer oder tiefer Mykosen. Neben der systemischen Anwendung steht der Wirkstoff auch in Form von Tabletten, Lutschtabletten oder einer Suspension zur topischen Behandlung des Mundsoor, der Soorösophagitis oder gastrointestinaler Mykosen zur Verfügung Azole Nachdem Amphotericin B, Griseofulvin und Flucytosin über mehrere Jahrzehnte die einzigen verfügbaren Substanzen in der systemischen Therapie invasiver Mykosen darstellten, gelang mit der Entwicklung der Azol-Antimykotika und der Markteinführung von Ketoconazol als deren erstem Vertreter 1979 ein wichtiger Fortschritt auf diesem Gebiet. Erstmals konnte bei Nichtansprechen auf eine Alternativtherapie zurückgegriffen werden und auch die Bedeutung antimykotischer Kombinationstherapien nahm zu. Mit Fluconazol, Itraconazol, Voriconazol und Posaconazol sind heute vier Vertreter der Substanzklasse auf dem europäischen Markt zur systemischen Therapie invasiver Mykosen zugelassen. Ketoconazol wird heute aufgrund der hohen Rate unerwünschter Arzneimittelwirkungen (u.a. Testosteron-antagonisierende Effekte) nur noch topisch, z.b. zur Behandlung von Dermatomykosen oder als Bestandteil von Schuppen-Shampoos, angewandt. Des weiteren wurde in diesem Rahmen auf die Beschreibung von Itraconazol verzichtet, da der Wirkstoff am Universitätsklinikum Freiburg aufgrund großer intra- und interindividueller Variabilität der Bioverfügbarkeit sowie des komplexen Interaktionsprofils kaum mehr eingesetzt wird. Azol-Antimykotika hemmen die Ergosterol-Biosynthese über eine Inhibition des Enzyms Lanosterol-14α-Demethylase (Abbildung 9). Dieses gehört zur Familie der Cytochrom P450 (CYP)-Enzyme, welche eine wichtige Rolle beim oxidativen Abbau zahlreicher körpereigener und körperfremder Stoffe spielen. Unter anderem sind diese Enzyme an der

25 Einleitung 15 Verstoffwechselung zahlreicher Arzneistoffe beteiligt, wodurch sich auch das hohe Potential der Azol-Antimykotika für pharmakokinetische Arzneimittelinteraktionen erklärt [43,49] Fluconazol N N N H F O N N N F Abbildung 11: Strukturformel Fluconazol. Mit Fluconazol (Abbildung 11) wurde 1989 das zweite Azol-Antimykotikum zur systemischen Therapie zugelassen. Hauptvorteile der Substanz im Vergleich zu Ketoconazol waren die bessere Verträglichkeit (u.a. niedrige Rate hepatotoxischer Effekte) und eine hohe orale Bioverfügbarkeit (>90%), aber auch gute Gewebegängigkeit inklusive effektiver ZNS- Penetration (>70%) sowie die eine tägliche Einmalgabe ermöglichende Halbwertszeit von etwa 30 h [43]. Klinisch relevante Interaktionen aufgrund CYP 3A4-, 2C9- und 2C19- Inhibition treten erst bei Dosierungen oberhalb 200 mg auf. Hier werden z.b. die Blutspiegel von Vitamin-K-Antagonisten (z.b. Phenprocoumon) oder Sulfonylharnstoffen (z.b. Glibenclamid) erhöht, während die parallele Gabe von Rifampicin zu einem Wirkungsverlust des Azols führen kann [49]. Fluconazol zeigt bei üblicher Dosierung ( mg/d) eine hohe Effektivität gegen die meisten Spezies der Gattung Candida, weswegen es zur Behandlung der invasiven Candidiasis und der Candidämie eingesetzt wird [50,51]. Auch gegen Cryptococcus spp. ist Fluconazol effektiv, wohingegen eine Wirksamkeit gegenüber C. glabrata (Torulopsis glabrata) nur bei höherer Dosierung (800 mg/d) vorliegt. Gegen C. krusei ist die Substanz ineffektiv. Weitaus schwerwiegender für den Einsatz in der Hämatologie und internistischen Onkologie wiegt die Unwirksamkeit gegenüber Schimmelpilzen wie Aspergillus spp., Fusarium oder Mucor, wodurch die Verwendung eingeschränkt wird. Zudem kommt es durch den

26 Einleitung 16 langfristigen prophylaktischen Gebrauch immer häufiger zur Resistenz-Entwicklung gegen den Arzneistoff [52-54]. Zugelassen ist Fluconazol in Deutschland zur Prophylaxe invasiver Mykosen sowie zur Therapie systemischer Candidosen (einschließlich Candidämie), oberflächlicher Candidosen (einschließlich oropharyngealer und ösophagealer Candidose) und der Kryptokokken-Meningitis. Fluconazol steht sowohl zur peroralen Applikation in Form von Hartkapseln als auch als Infusionslösung zur Verfügung. Dies ist gerade bei Entlassung aus der stationären Behandlung von großem Nutzen, da intravenöse Medikationen ambulant häufig nicht weitergeführt werden können und bei fehlender Verfügbarkeit einer peroralen Formulierung ein Wechsel des Wirkstoffs nötig wird Voriconazol N N H F H O F N N N F Abbildung 12: Strukturformel Voriconazol. Nach zwischenzeitlicher Markteinführung von Itraconazol stellte das im Jahr 2002 zugelassene Voriconazol (Abbildung 12) das vierte systemisch einsetzbare Azol- Antimykotikum dar. Die Substanz weist ein sehr breites Wirkspektrum auf, welches neben Candida spp. (einschließlich C. glabrata und C. krusei) sowie Cryptococcus neoformans auch Schimmelpilze wie Aspergillus spp. umfasst. Die Wirksamkeit gegen Zygomyzeten ist dagegen schwach [55]. Die orale Bioverfügbarkeit von Voriconazol liegt mit etwa 95% sehr hoch, dazu penetrieren etwa 90% des Arzneistoffs ins ZNS. Aufgrund der niedrigen Halbwertszeit von etwa 6 h muss die Tagesdosis auf zwei Gaben verteilt werden. Im Bereich der unerwünschten Arzneimittelwirkungen sind vor allem die zumeist reversiblen hepatotoxischen Effekte,

27 Einleitung 17 Hautausschläge sowie visuelle Beeinträchtigungen (verschwommenes Sehen, Veränderung des Farbsehens) relevant [56,57]. Durch die Eigenschaft von Voriconazol als Inhibitor und Substrat der CYP-Enzyme 2C19, 2C9 und 3A4 bestehen pharmakokinetische Arzneimittelinteraktionen mit zahlreichen Arzneistoffen [49]. Nicht zuletzt deshalb wird die Durchführung regelmäßiger Blutspiegelbestimmungen des Arzneistoffs empfohlen [58-60]. Aufgrund der derzeitigen Studien- und Zulassungslage ist Voriconazol Mittel der Wahl bei der Therapie invasiver Aspergillosen [61]. Insbesondere bei cerebralen Aspergillus- Infektionen ist die Substanz anderen Therapieoptionen überlegen [62,63]. Neben diesen Indikationen ist Voriconazol auch zur Behandlung Fluconazol-resistenter invasiver Candida- Infektionen, schwerer Infektionen mit Scedosporium spp. und Fusarium spp. sowie der Candidämie bei nicht-neutropenischen Patienten zugelassen. Darüber hinaus zeigen Studien günstige Ergebnisse zum empirischen und präemptiven Einsatz der Substanz, wohingegen ein Nutzen der prophylaktischen Anwendung nicht eindeutig belegt ist [64-66]. Wie bei Fluconazol stellt die Verfügbarkeit in peroralen und parenteralen Arzneiformen einen Vorteil für die klinische Anwendung von Voriconazol gegenüber ausschließlich parenteral (Amphotericin B, Caspofungin) oder peroral (Posaconazol) applizierbaren Antimykotika dar Posaconazol O O H N N N N N O N N N O F F Abbildung 13: Strukturformel Posaconazol. Posaconazol (Abbildung 13) wurde 2005 als neuster Vertreter der Substanzklasse zur Therapie und Prophylaxe invasiver Mykosen zugelassen. Das Wirkspektrum ist gegenüber

28 Einleitung 18 Voriconazol noch breiter und schließt alle aus therapeutischer Sicht relevanten Hefen und Schimmelpilze inklusive der Zygomyzeten ein [67-69]. Die Resorption der Substanz aus dem Gastrointestinaltrakt wird durch Einnahme mit fettreicher Nahrung verstärkt und kann weiterhin durch Vorliegen einer Mucositis, einer GvHD oder durch Arzneimittelinteraktionen beeinflusst werden [70, siehe auch Kapitel 3.1]. Aufgrund hieraus resultierender starker intra- und interindividueller Schwankungen in der Bioverfügbarkeit sollte wie bei Voriconazol die Durchführung regelmäßiger Bestimmungen der Blutspiegel erwogen werden [60]. Die mittlere Halbwertszeit von Posaconazol liegt bei etwa 35 h, als potenter Inhibitor von CYP 3A4 beeinflusst der Arzneistoff die Blutspiegel aller hierüber metabolisierter Substanzen [49]. Bei den unerwünschten Arzneimittelwirkungen sind in erster Linie Übelkeit und Erbrechen beschrieben, wohingegen hepatotoxische Effekte in klinischen Studien nur in geringem Umfang beobachtet wurden [70,71]. Im Rahmen des prophylaktischen Einsatzes von Posaconazol (600 mg täglich) bei Patienten mit GvHD nach allogener SZT sowie bei Patienten mit AML oder MDS unter Induktions-Chemotherapie konnte eine hohe Effektivität bei geringer Toxizität gezeigt werden [14,15]. Als ebenfalls effizient erwies sich der Einsatz in der Zweitlinientherapie invasiver Mykosen (u.a. Aspergillosen) und der empirischen antimykotischen Therapie. In keiner der genannten Studien wurde ein Auftreten signifikanter Toxizität unter Posaconazol beschrieben [70-73]. Zugelassen ist Posaconazol in Deutschland derzeit zur Behandlung therapieresistenter invasiver Aspergillosen und Fusariosen, zur Erstlinientherapie der oropharyngealen Candidose sowie zur Prophylaxe invasiver Mykosen bei Patienten mit AML oder MDS unter Induktions-Chemotherapie und Empfängern allogener SZT, die eine Hochdosis- Immunsuppression aufgrund einer GvHD erhalten. Posaconazol ist bisher nur in Form einer oralen Suspension auf dem Markt, was die Anwendbarkeit - z.b. bei Patienten mit starker Mucositits oder schwerer Übelkeit - einschränkt. Eine parenterale Formulierung befindet sich derzeit in Entwicklung Echinocandine Die Echinocandine, deren erster Vertreter Caspofungin im Jahr 2001 zugelassen wurde, stellen die neueste Wirkstoffklasse zur systemischen Therapie invasiver Mykosen dar. Mit Anidulafungin und Micafungin sind mittlerweile zwei weitere Substanzen auf dem Markt, die

29 Einleitung 19 in der Abteilung Hämatologie & Onkologie des Universitätsklinikums Freiburg derzeit jedoch nicht in relevantem Umfang eingesetzt werden. Chemisch gesehen sind Echinocandine semisynthetische Lipopeptide, die aufgrund ihrer Molekülgröße bei oraler Gabe nicht resorbiert werden und daher parenteral appliziert werden müssen. Mit einer nicht-kompetitiven Hemmung der β-(1,3)-d-glucan-synthese unterscheidet sich der Wirkmechanismus grundlegend von dem der Azole und Polyene, bei denen Ergosterol den pharmakologischen Angriffspunkt darstellt. Das Polysaccharid β-(1,3)- D-Glucan ist essentieller Bestandteil der Zellwand der meisten pathogenen Pilze, weswegen ein Mangel zum Verlust der Integrität der Zelle führt. Da die Zellwand von Cryptococcus neoformans kein β-(1,3)-d-glucan enthält, weisen Echinocandine keine Aktivität gegen diese Spezies auf. Das Fehlen einer Zellwand bei tierischen Zellen ist ein Grund für die gute Verträglichkeit der Substanzklasse. Auch hinsichtlich der Rate potentieller Arzneimittelinteraktionen weisen die Echinocandine ein günstiges Profil auf, wobei insbesondere auf der Beeinflussung von CYP-Enzymen beruhende Wechselwirkungen keine relevante Rolle spielen [43,49,74,75] Caspofungin Abbildung 14: Strukturformel Caspofungin. Wie für die gesamte Substanzklasse gilt auch für Caspofungin (Abbildung 14), dass es nur wenige unerwünschte Arzneimittelwirkungen (u.a. transiente Erhöhungen von Parametern der Leberfunktion) aufweist. Klinisch relevante potentielle Arzneimittelinteraktionen umfassen die reduzierte Bioverfügbarkeit von Caspofungin bei paralleler Gabe starker

30 Einleitung 20 Enzyminduktoren wie Dexamethason oder Phenytoin sowie eine Erhöhung der Caspofungin-Spiegel bei gleichzeitige Applikation von Cyclosporin A [49]. Caspofungin weist eine hohe Proteinbindung (>95%) und eine Eliminationshalbwertszeit von etwa 11 h auf. Die ZNS-Penetrationsrate liegt bei etwa 10%, weswegen sich der Arzneistoff nicht zum Einsatz bei cerebralen Mykosen eignet. Der Metabolismus von Caspofungin basiert auf einer nichtenzymatischen Hydrolyse unter Ringöffnung des Moleküls. Insbesondere CYP-Enzyme sind nicht am Abbau des Wirkstoffs beteiligt [76]. Caspofungin weist eine sehr gute Wirksamkeit gegen Candida spp. und Aspergillus spp. auf, wohingegen keine Aktivität gegenüber Cryptococcus spp., Fusarium spp. und Zygomyzeten besteht. In randomisierten klinischen Studien zum Einsatz bei invasiver Candidiasis, invasiver Aspergillose und im Rahmen der empirischen antimykotischen Therapie zeigte die Substanz überzeugende Ergebnisse. So war Caspofungin im Bereich der empirischen Therapie bei gleicher Effektivität besser verträglich als liposomales Amphotericin B und zeigte insbesondere seltener nephrotoxische Effekte [77]. Als Therapieoption bei Patienten mit invasiver Aspergillose, die auf eine Standardtherapie (Amphotericin B, Azole) nicht genügend ansprachen oder diese nicht vertrugen, zeigte Caspofungin ein gutes Ansprechen bei 45% der Patienten [78]. Ähnlich dem Einsatz in der empirischen Therapie zeigte Caspofungin auch in der Therapie der invasiven Candidiasis bei gleicher Wirksamkeit eine signifikant niedrigere Rate unerwünschter Arzneimittelwirkungen als Amphotericin B [79]. Eine weitere klinische Studie konnte zeigen, dass auch ältere Patienten mit eingeschränkter renaler oder hepatischer Funktion sehr gut von einer Behandlung mit Caspofungin profitieren [80]. In Deutschland zugelassen ist Caspofungin derzeit zur Behandlung therapieresistenter invasiver Aspergillosen, zur Erstlinientherapie der invasiven Candidiasis sowie zur empirischen antimykotischen Therapie. Nicht zugelassen ist Caspofungin zur Prophylaxe invasiver Mykosen, wobei Untersuchungen an hämato-onkologischen Patienten unter Induktions-Chemotherapie durchgeführt wurden, welche eine vergleichbare Effektivität mit dem für diese Indikation zugelassenen Itraconazol ergaben [81]. Wie alle Echinocandine ist auch Caspofungin ausschließlich in Form einer parenteralen Formulierung verfügbar. Die Dosierung ist mit 70 mg Caspofungin am ersten Tag der antimykotischen Therapie und 50 mg an den Folgetagen für alle zugelassenen Indikationen gleich. Bei Patienten mit einem Körpergewicht von über 80 kg wird die initiale Dosierung von 70 mg auch an den Folgetagen beibehalten.

31 Einleitung Antimykotische Kombinationstherapien Mit Einführung der Azole und Echinocandine entstand die Option der Behandlung invasiver Mykosen mittels antimykotischer Kombinationstherapien. Der Nutzen derartiger Therapien wird kontrovers diskutiert, wobei den Pro-Argumenten einer verbesserten Wirksamkeit und der Vermeidung von Resistenzentwicklungen insbesondere pharmakoökonomische und toxikologische Überlegungen (unerwünschte Arzneimittelwirkungen, potentielle Arzneimittelinteraktionen) gegenüberstehen. Gerade im Bereich der invasiven Aspergillosen liegen zahlreiche Untersuchungen zum erfolgreichen Einsatz von Kombinationstherapien vor. So zeigte die parallele Gabe von Caspofungin und liposomalem Amphotericin B in der Salvage-Therapie eine Ansprechrate von 42% [82]. Auch die Kombination von Caspofungin und Voriconazol in der Primärtherapie der invasiven Aspergillose zeigte gute Ergebnisse und hinsichtlich der Mortalität eine signifikante Überlegenheit gegenüber der Voriconazol-Monotherapie [83] (Abbildung 15). Abbildung 15: Mortalität unter Voriconazol (n=31 Patienten) und Voriconazol / Caspofungin- Kombination (n=16) nach Diagnose einer invasiven Aspergillose (IA) (aus [83]). In vitro wurde auch die Dreifachkombination aus Caspofungin, Voriconazol und Amphotericin B getestet. Diese zeigte synergistische Effekte und wurde in der Wirksamkeit gegen Aspergillus spp. positiv bewertet [84]. Die klinische Relevanz dieser Kombinations-

32 Einleitung 22 Studien ist allerdings nicht geklärt, zumal bei den Ergebnissen aller Studien auf die Notwendigkeit weiterer Untersuchungen hingewiesen wurde. Insbesondere der Stellenwert eines kombinierten Einsatzes aus Azol und Amphotericin B ist derzeit noch unklar. Während die Kombination verschiedener Wirkmechanismem aus pharmakologische Überlegungen einen synergistischen Effekt nahelegt, wird auch ein Antagonismus diskutiert, da durch den Einsatz des Azols die Produktion von Ergosterol als Zielstruktur von Amphotericin B gehemmt wird [85]. In vitro- und in vivo-untersuchungen zeigen hierzu bislang heterogene Ergebnisse [86-88]. Seitens der Fachgesellschaften wird als Erstlinientherapie derzeit nur die Kombination aus konventionellem Amphotericin B und Flucytosin zur Behandlung der Kryptokokken- Meningitis empfohlen [89].

33 Einleitung Therapeutisches Drug Monitoring Der Begriff Therapeutisches Drug Monitoring (TDM) bezeichnet die wiederholte Messung der Plasmakonzentration eines Arzneistoffs mit dem Zweck, den Wirkstoffspiegel mittels einer individuellen Dosierung in einen angestrebten Bereich zu bringen bzw. im Rahmen der Therapiekontrolle dort zu halten. Dies ist insbesondere bei Arzneistoffen mit enger therapeutischer Breite indiziert, zu denen beispielsweise herzwirksame Glykoside, Lithiumsalze und einige Antikonvulsiva zählen [90]. Abgesehen von den Aminoglykosiden erfüllen die meisten Antiinfektiva dieses Kriterium nicht. Dennoch sind Spiegelmessungen auch in diesem Bereich sinnvoll, um ausreichend hohe Plasma-Konzentrationen für eine effektive Infektbehandlung oder -prophylaxe zu gewährleisten. Zudem weisen Antiinfektiva häufig schwere unerwünschte Arzneimittelwirkungen auf, wobei ein Zusammenhang mit hohen Plasmaspiegeln der Wirkstoffe in vielen Fällen nachgewiesen ist oder diskutiert wird [91]. Auch Arzneimittelinteraktionen werden bei verschiedenen Wirkstoffklassen (z.b. Azol- Antimykotika, Makrolid-Antibiotika) häufig detektiert, wobei deren endgültiger Nachweis meist nur über Bestimmungen der Plasmaspiegel gelingt. Dies erhöht die Bedeutung des TDM gerade für multimorbide Patienten unter multipler Begleitmedikation beträchtlich. Zuletzt kann mittels der Durchführung von Spiegelmessungen sogar eine Kostenreduktion erreicht werden, in dem unnötige Wirkstoffdosen vermieden und die Häufigkeit von Arzneistoff-Toxizitäten verringert werden [92]. Vorraussetzung für ein erfolgreiches TDM und damit notwendiges Kriterium für die angewandte analytische Methode ist der schnelle Erhalt von Messergebnissen, um beispielsweise Dosismodifikationen zeitnah initiieren zu können [90]. Hierbei ist eine weitgehende Automatisierung der Verfahren wünschenswert, um die Messzeit zu verkürzen und manuelle Bedienfehler zu vermeiden. Da gerade im Bereich der antiinfektiven Therapien Arzneistoffkonzentrationen am Wirkort häufig relevanter als im Blutplasma sind, können auch Messungen in anderen biologischen Matrizes wie Liquor, Peritonealflüssigkeit oder Trachealaspirat (s. Abschnitt 4) von besonderem therapeutischen Interesse sein Hochdruckflüssigkeitschromatographie Die Hochdruckflüssigkeitschromatographie (HPLC) stellt ein Trennverfahren der Säulen- Flüssigkeits-Chromatographie dar, welches sehr häufig im Rahmen eines TDM verwendet

34 Einleitung 24 wird. Hierbei wird die Probenflüssigkeit mittels eines Eluenten (mobile Phase) unter hohem Druck über die stationäre Phase einer Trennsäule transportiert [93,94]. Im Gegensatz zur Gaschromatographie können im Rahmen der HPLC auch nicht-flüchtige Substanzen analysiert werden. Innerhalb der HPLC-Trennmechanismen unterscheidet man je nach Art der Wechselwirkungen zwischen Probe, stationärer und mobiler Phase in Adsorptions-, Affinitäts-, Ausschluss-, Ionenaustausch- und Verteilungschromatographie. Bei letzterer wird noch einmal in Normalphasen- und Umkehrphasen-Verteilungschromatographie differenziert. Im ersten Fall ist die stationäre Phase (z.b. Kieselgel) polarer als die mobile Phase, bei der in etwa 70% aller analytischen Trennungen verwendeten Umkehrphasen- Verteilungschromatographie verhält es sich umgekehrt, wobei als stationäre Phase silanisierte Silicagel-Partikel eingesetzt werden [93,94]. Bei HPLC-basierten analytischen Verfahren wird weiterhin zwischen isokratischer und Gradienten-Elution unterschieden. Bei ersterer bleiben Zusammensetzung und Flussrate des Eluenten während des Trennvorgangs konstant, während bei der Gradienten-Elution Variationen eines oder beider Parameter vorgenommen werden. Essentielle Bestandteile einer HPLC-Anlage sind eine Pumpe zur Förderung der mobilen Phase, ein Einspritzsystem (Injektor) zur Applikation der Probe, eine mm langen Trennsäule und ein Detektor mit Auswertsystem. Meist werden analytischen Säulen noch sogenannte Vorsäulen vorgeschaltet, um sie vor Verunreinigungen aus dem Probenmaterial zu schützen. Der apparative Aufbau der im Rahmen dieser Arbeit entwickelten Methoden ist - u.a. aufgrund der vollautomatischen Probenaufarbeitung - bedeutend komplexer und wird in den jeweiligen methodischen Teilen detailliert beschrieben (s. Abschnitte 3.3 und 4.3). Gewöhnlich werden in analytischen Säulen Trennpartikel mit Korngrößen von 3-10 μm verwendet, wobei die Trennleistung (Trennstufenzahl) der Säulen mit abnehmendem Teilchendurchmesser zunimmt. Mit geringeren Teilchendurchmessern verbunden ist über eine Erhöhung der Packungsdichte aber auch eine Zunahme des Strömungswiderstands, wodurch immer höhere Drücke zum Transport der mobilen Phase durch die dünne Trennsäule (Durchmesser 2-6 mm) nötig werden. Derzeit wird in der analytischen Routine mit Drücken bis zu 300 bar gearbeitet. Die Verweildauer eines Stoffes im HPLC-System wird als Retentionszeit bezeichnet und hängt von der Stärke der Interaktion mit der stationären Phase und der Geschwindigkeit der gegenläufigen Desorption in die mobile Phase ab. Die Gesamtretentionszeit eines Stoffes setzt sich dabei aus der Nettoretentionszeit (Aufenthalt des Stoffes in der stationären Phase) und der reinen Durchflusszeit der mobilen Phase zusammen.

35 Einleitung 25 Häufig verwendete Detektionsverfahren im Anschluss an HPLC-basierte Trennprozesse sind UV/VIS-, Fluoreszenz- und Leitfähigkeits-Detektion sowie die Massenspektrometrie Massenspektrometrie Im Vergleich zu den spektrometrischen Verfahren (UV/VIS- und Fluoreszenz-Detektion) lassen sich chemische Verbindungen mit Hilfe der Massenspektrometrie (MS) anhand ihres Fragmentierungsmusters noch spezifischer identifizieren. Zudem ist eine Quantifizierung äußerst geringer Stoffmengen mit Nachweisgrenzen im Nano- (ng) bzw. Femtogramm- (fg) Bereich möglich. Die zu untersuchenden Substanzen werden hierbei zunächst verdampft und ionisiert, woraufhin die ionisierten Teilchen mittels elektrischer oder magnetischer Felder beschleunigt und gemäß ihres Masse-zu-Ladung-Verhältnisses m/z aufgetrennt werden [95,96]. Je nach Geräteeinstellung können Fragmentierungsgrad und -muster der Verbindungen variiert werden. Essentielle Bestandteile eines MS sind eine Ionenquelle, ein Analysator und ein Detektor. Die Ionenquelle dient dabei der Ionisation des Analyten, wobei verschiedene Methoden angewandt werden. Zu den wichtigsten zählen die Elektrospray-Ionisation (ESI), die chemische Ionisation unter Atmosphärendruck (APCI, engl. atmospheric pressure chemical ionization) und die Ionisierung durch gepulstes Laserlicht (MALDI, engl. matrix-assisted laser desorption / ionization). Die im Rahmen dieser Arbeit verwendete ESI basiert auf einer Überführung von in flüssiger Phase gebildeten Ionen in die Gasphase [97]. Dazu wird eine Lösung des Analyten mit Stickstoff-Gas vernebelt und in einem Hochspannungsfeld ionisiert. Es folgt ein Trocknungsprozess der entstandenen Tröpfchen, wobei nach vollständiger Verdampfung des Lösungsmittels Ionen des Analyten in der Gasphase zurückbleiben. In Quadrupol-Analysatoren werden Ionen durch ein statisches elektrisches Feld beschleunigt und durchfliegen zentral vier parallel liegende Stabelektroden, deren Schnittpunkte mit einer Ebene senkrecht zur Zylinderachse ein Quadrat bilden (daher der Name Quadrupol). Die jeweils gegenüberliegenden Elektroden befinden sich auf gleichem Potential, zwischen benachbarten Elektroden wird eine Spannung mit einem Gleich- und einem hochfrequenten Wechselspannungs-Anteil angelegt. Es findet eine m/z-selektion statt, so dass je nach Messbedingungen nur Teilchen einer definierten Masse das Feld durchlaufen und den Detektor erreichen. Die Flugbahn aller Ionen im Feld ist dabei sinusförmig, wobei vom selektierten m/z-verhältnis abweichende Ionen schrittweise aus

36 Einleitung 26 dem Feld herausbeschleunigt werden und letztlich dessen Einflussbereich verlassen (Abbildung 16). Abbildung 16: Schematische Darstellung eines Quadrupol-Analysators (aus [98]). Im Rahmen dieser Arbeit wurde ein Triple Quadrupol-MS verwendet. Dabei handelt es sich um drei linear gereihte Quadrupol-Analysatoren, wobei der erste und dritte als Massenfilter dienen und der mittlere als Kollisionszelle fungiert, in dem die Fragmentierung stattfindet.

37 Klinische Datenerfassung 27 3 Prospektive Analyse des Einsatzes systemischer Antimykotika auf drei hämato-onkologischen Stationen des Universitätsklinikums Freiburg 3.1 Hintergrund und Ziele Hämatologie und internistische Onkologie gehören hinsichtlich der Pharmakotherapie zu den komplexesten medizinischen Fachgebieten. Hierbei stehen dem therapeutischen Nutzen der Medikamente häufig unerwünschte Effekte gegenüber, wobei insbesondere Zytostatika aufgrund der meist engen therapeutischen Breite zahlreiche unerwünschte Arzneimittelwirkungen aufweisen. Auch das Risiko potentieller Arzneimittelinteraktionen ist durch die Vielzahl applizierter Arzneistoffe für den behandelnden Arzt häufig kaum mehr überschaubar. Risikofaktoren für das Auftreten potentieller Arzneimittelinteraktionen und unerwünschter Arzneimittelwirkungen sind die Länge des Klinikaufenthalts und die Anzahl der verordneten Medikamente [99]. Da hämato-onkologische Patienten neben der zytostatischen Therapie noch zahlreiche weitere Medikamente erhalten (u.a. zur Supportivtherapie und Behandlung von Komorbiditäten) und aufgrund umfangreicher und komplexer Behandlungsregime häufig längere und wiederholte Liegezeiten aufweisen, unterliegt diese Patientenpopulation einem besonders hohen Risiko [100,101]. Trotz der hohen Inzidenz und klinischen Relevanz ist die Datenlage zu potentiellen Arzneimittelinteraktionen bei Tumorpatienten sehr beschränkt. Im Rahmen einer Studie an 100 stationär behandelten Tumorpatienten, die keine zytostatische Chemotherapie erhalten hatten, wurde bei fast zwei Drittel der Patienten (63%) mindestens eine potentielle Interaktion festgestellt [99]. Schwerwiegende Arzneimittelinteraktionen wurden zudem als Ursache von 4% aller Todesfälle bei stationären hämato-onkologischen Patienten ausgemacht, was deutlich deren großen Einfluss auf Morbidität und Mortalität dieser Patientenpopulation reflektiert [102]. Eine weitere Studie an Tumorpatienten unter zytostatischer Chemotherapie konnte zeigen, dass Arzneimittelinteraktionen vorwiegend durch Medikamente zur Supportivtherapie und deutlich seltener durch Zytostatika verursacht werden [100]. Systemische Antimykotika stellen einen essentiellen Bestandteil der Supportivtherapie hämato-onkologischer Patienten dar, da invasive Mykosen die Morbidität dieser Patientenpopulation signifikant beeinflussen (Tabelle 2).

38 Klinische Datenerfassung 28 Tabelle 2: Infektiologische Einflussfaktoren auf die Mortalität von Tumorpatienten (aus [103]). Odds ratio: statistisches Assoziationsmaß zur Angabe der Stärke eines Zusammenhangs zwischen zwei Merkmalen. CI: Konfidenzintervall. Multivariate Logistic Regression Analysis: Inpatient Mortality * Category Odds Ratio (95% CI) P Infection Gram-negative bacteremia 4.92 ( ) <.0001 Gram-positive bacteremia 2.29 ( ) <.0001 Invasive candidiasis 2.55 ( ) <.0001 Invasive aspergillosis 3.48 ( ) <.0001 Other fungal infection 1.12 ( ) * Adjusted for gender, year, and institution. Insbesondere Empfänger allogener SZT und Patienten mit akuter Leukämie unter Induktions-Chemotherapie profitieren von effektiven Pharmaka für die Prophylaxe und Therapie invasiver Pilzinfektionen [2,104,105]. Dennoch stieg die Inzidenz invasiver Mykosen in den vergangenen 20 Jahren aufgrund deutlich intensiverer Therapieregime - auch bei älteren Patienten - trotz Einführung effektiver prophylaktischer Optionen kontinuierlich an [1,6,10,105], womit auch die Steigerungsraten vieler bakterieller Infektionen übertroffen werden (Abbildung 17). Abbildung 17: Häufigkeit von Sepsis in den USA ( ) nach Erregern (aus [4]). Die klinische Relevanz invasiver Mykosen wird auch durch den weltweit steigenden Verbrauch systemischer Antimykotika reflektiert, der zu enormen Kosten geführt hat und mittlerweile eine beträchtliche Belastung für die öffentlichen Gesundheitssysteme westlicher Industrienationen darstellt [103] (Tabelle 3).

39 Klinische Datenerfassung 29 Tabelle 3: Infektiologische Einflussfaktoren auf Dauer und Kosten des Klinikaufenthalts von Tumorpatienten (aus [103]). Length of Stay, d Total Cost per Hospitalization, $ Variable No. Mean (± 95% CI) Median Mean (± 95% CI) Median Infections Gram-negative bacteremia ± ,312 ± Gram-positive bacteremia ± ,167 ± ,188 Other bacterial infections ± ,582 ± ,741 Invasive candidiasis ± ,052 ± ,226 Invasive aspergillosis ± ,229 ± ,260 Other fungal infection ± ,063 ± ,352 Entsprechend wurden in den vergangenen Jahren vermehrt pharmakoökonomische Daten publiziert, wobei der Schwerpunkt auf der Nephrotoxizität von Amphotericin B und auf dem Vergleich zwischen Amphotericin B und Caspofungin lag. Die zu erstem Aspekt veröffentlichten Studien wiesen einen hochgradiger Einfluss des Polyens auf Kosten und Dauer des Klinikaufenthalts der behandelten Patienten sowie deren Mortalität nach [45,106]. Einzig in einer Studie von Harbarth et al. [107] konnte ausschließlich eine Beeinflussung der Mortalität, nicht aber von Kosten und Dauer des Klinikaufenthalts gesehen werden. Der pharmakoökonomische Vergleich zwischen liposomalem Amphotericin B und Caspofungin ergab durchweg vorteilhafte Ergebnisse für das Echinocandin, wobei entweder eine Kostenreduktion [108,109] oder ein im Median kürzerer Klinikaufenthalt bei gleichzeitiger Kostenäquivalenz [110] nachgewiesen wurde. Parallel zu den steigenden Kosten systemischer Antimykotika hat sich das Spektrum der für Prophylaxe und Therapie invasiver Mykosen zugelassenen Wirkstoffe in den vergangenen Jahren deutlich verbreitert. Hierdurch ergab sich zum einen eine größere Auswahl therapeutischer Optionen bei der Behandlung von Hochrisiko-Patienten, zum anderen wurden aber auch Wirksamkeit und Sicherheitsprofile der Substanzen verstärkt diskutiert und verglichen. Die in Europa derzeit für die Behandlung invasiver Mykosen zugelassenen systemischen Antimykotika weisen hochgradige Unterschiede hinsichtlich ihrer pharmakokinetischen, pharmakodynamischen und pharmakoökonomischen Eigenschaften sowie antifungalen Wirkspektren auf [43,45,55,70,75]. Insbesondere weichen die Sicherheitsprofile der Substanzen voneinander ab, wobei gerade Art und Häufigkeit potentieller Interaktionen und unerwünschter Arzneimittelwirkungen deutlich differieren [49].

40 Klinische Datenerfassung 30 Sicherheitsprofile systemischer Antimykotika wurden im Rahmen klinischer Studien evaluiert [56,71,78,111]. Diese spiegeln die klinische Realität allerdings aufgrund stringenter Ein- und Ausschlusskriterien nur unzureichend wider und reflektieren nur selektierte 1-5% der behandelten Patienten einer Kohorte. Die hierdurch gewonnenen Daten sind damit zwar als Orientierung essentiell, können aber nicht unkritisch auf alltägliche Patientenpopulationen übertragen werden. Insbesondere unerwünschte Arzneimittelwirkungen treten bei multimorbiden Patienten mit schlechtem Allgemeinzustand und eingeschränkten Organfunktionen deutlich häufiger auf und sind bei selektierten Studienpatienten erheblich unterrepräsentiert. Die Durchführung von Analysen an konsekutiven, unselektierten Patienten ist daher essentiell für den Erhalt valider Ergebnisse, die die klinische Realität adäquat widerspiegeln. Dies gilt insbesondere, da Interaktionen und unerwünschte Arzneimittelwirkungen systemischer Antimykotika einen hochgradigen Einfluss auf die Patientensicherheit haben. So konnte die klinische Relevanz zahlreicher pharmakokinetischer Interaktionen von Azol- Antimykotika u.a. in einer kürzlich publizierten Studie aus den Niederlanden und Frankreich gezeigt werden [112]. Hinsichtlich der Anwendung zytostatisch wirksamer Substanzen wurden in den vergangenen Jahren erfolgreiche Anstrengungen unternommen, um Verordnungs- und Applikationsfehler zu vermeiden. Beispielhaft sei hier die Arbeit der "Sektion für Klinische Studien, Good Clinical Practice und Qualitätsmanagement" der Abteilung Hämatologie & Onkologie des Universitätsklinikums Freiburg genannt, die zeigen konnte, dass 99,9% der auftretenden Verordnungs- und Anwendungsfehler durch die eingehende Prüfung aller Verordnungen in Kooperation mit der Klinikumsapotheke vor Applikation eines Zytostatikums erkannt und effektiv eliminiert werden können [113]. Im Gegensatz hierzu ist die Datenlage zu den Sicherheitsprofilen bei Anwendung systemischer Antimykotika bei Hochrisiko-Tumorpatienten bislang sehr limitiert. Ein Ziel dieser Arbeit war daher, mehr empirische Daten zu Inzidenz und klinischer Relevanz potentieller Arzneimittelinteraktionen und unerwünschter Arzneimittelwirkungen in diesem Bereich zu erhalten. Dies wiederum sollte zu einer Vermeidung von Verordnungsfehlern und damit letztlich zur Erhöhung der Patientensicherheit während des Klinikaufenthalts führen. Weiteres wichtiges Ziel der Arbeit war die interdisziplinäre Unterstützung der Ärzte bei der Aktualisierung einer abteilungsinternen Leitlinie zum Einsatz systemischer Antimykotika bei Tumorpatienten mittels der im Rahmen der Analysen gewonnenen Daten.

41 Klinische Datenerfassung Methodik Klinische Datenerfassung Der Einsatz systemischer Antimykotika wurde prospektiv auf drei Stationen der Abteilung Hämatologie & Onkologie des Universitätsklinikums Freiburg analysiert. Dabei handelt es sich um die Einheit für allogene SZT (n=181 Patienten), eine allgemeine hämatoonkologische Station (n=42) und eine Therapiestation für Patienten mit akuter Leukämie (n=27). Auf allen drei genannten Stationen werden zusätzlich auch autologe SZT durchgeführt. Alle konsekutiven Patienten, die zwischen Oktober 2006 und September 2009 mindestens drei Tage lang systemische Antimykotika aus prophylaktischer oder therapeutischer Indikation erhalten hatten, wurden in die Datenanalyse eingeschlossen. Patienten wurden nicht aufgrund ihres Alters, eingeschränkter Organfunktionen, eines schlechten Allgemeinzustands oder ähnlicher Faktoren, die häufig Ausschlusskriterien bei klinischen Studien darstellen, von der Analyse ausgeschlossen. Klinische Daten wurden mittels detaillierter Durchsicht aller Patientenakten sowie der regelmäßigen Teilnahme an Visiten und Kurvenvisiten der beteiligten Stationen in enger Kooperation mit dem behandelnden ärztlichen und pflegerischen Personal erfasst. Potentielle Arzneimittelinteraktionen wurden mittels des Standardwerks "Stockley's Drug Interactions" [114] und der elektronischen Datenbank "Scholz Online" [115] detektiert. Potentiell bedeutet hierbei, dass zwar Evidenz für das Vorliegen entsprechender Effekte vorliegt, nicht aber, dass diese Interaktionen im Rahmen der Untersuchungen tatsächlich nachgewiesen worden sind. Unerwünschte Arzneimittelwirkungen wurden erfasst und dokumentiert, wenn ein Zusammenhang mit dem betreffenden Antimykotikum von einem interdisziplinären Team (bestehend aus den behandelnden Ärzten und dem Apotheker) als sehr wahrscheinlich (bzw. sicher), wahrscheinlich oder möglich klassifiziert wurde. Zur Charakterisierung des Allgemeinzustands der Tumorpatienten wurde der im hämatoonkologischen Setting gebräuchliche Karnofsky-Index gewählt [116], dessen Definitionen in Tabelle 4 zusammengefasst sind.

42 Klinische Datenerfassung 32 Tabelle 4: Definitionen des Karnofsky-Index zur Charakterisierung des Allgemeinzustands von Tumorpatienten. Karnofsky Definition Index normale Aktivität, keine Beschwerden, keine Krankheitssymptome 100 % geringfügig verminderte Aktivität und Belastbarkeit, geringe Krankheitssymptome 90 % normale Aktivität nur mit Anstrengung, einige Krankheitssymptome 80 % selbständige Versorgung, normale Aktivität und Arbeit nicht möglich 70 % gelegentliche Unterstützung nötig, Versorgung weitestgehend selbständig 60 % erhebliche Unterstützung und Pflege, ärztliche Hilfe erforderlich 50 % überwiegende Bettlägerigkeit, besondere Hilfe und Unterstützung notwendig 40 % Schwerbehinderung, geschulte Pflegekraft notwendig, Patient nicht moribund 30 % schwerstkranker Patient, Hospitalisierung notwendig, aktive supportive Therapie erforderlich 20 % moribunder Patient, rasche Erkrankungsprogredienz 10 % Tod 0 % Zur Beschreibung der Komorbidität wurde der Satariano-Index gewählt, der sieben für das Gesamtüberleben relevante Begleiterkrankungen umfasst (Tabelle 5). Diese wurden initial für Patientinnen mit Brustkrebs identifiziert [117], in der Folge aber auch für andere Tumorentitäten nachgewiesen. Zur Ermittlung des Index werden die für einen Patienten zutreffenden Komorbiditäten aufaddiert. Tabelle 5: Für das Gesamtüberleben relevante Komorbiditäten nach Satariano und Ragland. Herzerkrankung (ohne Herzinfarkt) Herzinfarkt Diabetes mellitus (Weitere) Tumorerkrankung Erkrankung der Atemwege Erkrankung der Leber Erkrankung der Gallenblase Als Parameter für die Nierenfunktion wurde das Serum-Kreatinin, als Parameter für die Leberfunktion das Enzym Alanin-Transaminase (ALT) und das Gesamt-Bilirubin gewählt. Die Verläufe dieser drei Parameter wurden während des Antimykotika-Einsatzes dokumentiert und detailliert analysiert. Nephrotoxizität wurde hierbei vor Beginn der Analyse definiert als Verdoppelung des Serum-Kreatinins während des Antimykotika-Einsatzes oder

43 Klinische Datenerfassung 33 eine Erhöhung um mindestens 1 mg/dl bei initial bereits erhöhtem Serum-Kreatinin. Hepatotoxizität wurde definiert als Erhöhung des ALT- bzw. Bilirubin-Spiegels auf eine höhere Stufe gemäß der Common Toxicity Criteria (CTC) des US National Cancer Institute [118] während des Antimykotika-Einsatzes. Systemische Antimykotika wurden angelehnt an die Leitlinien der European Organization for Research and Treatment of Cancer / Invasive Fungal Infections Cooperative Group und dem National Institute of Allergy and Infectious Diseases Mycoses Study Group (EORTC/MSG) appliziert (vgl. Abschnitt 2.3.5). Um während der Datenanalyse eine methodische Beeinträchtigung des Auftretens potentieller Arzneimittelinteraktionen und unerwünschter Arzneimittelwirkungen zu vermeiden, wurden in diesem Zeitraum keine direkten Rückschlüsse aus den erhaltenen Daten gezogen. Dem Studiendesign wurde seitens der Ethikkommission der Universität Freiburg zugestimmt.

44 Klinische Datenerfassung Untersuchte Parameter Tabelle 6 fasst alle Parameter zusammen, die im Rahmen der klinischen Datenanalyse dokumentiert und analysiert wurden. Neben Aspekten der Anwendung systemischer Antimykotika wurden auch weitere, klinisch hochrelevante Daten wie detaillierte Patientencharakteristika, Begleitmedikation und Organfunktionen erfasst. Tabelle 6: Im Rahmen der klinischen Datenerfassung analysierte Parameter. Patientenspezifische Angaben Maligne Grunderkrankung Komorbiditäten Zytostatische Chemotherapie (incl. SZT) Komedikation Angewendete systemische Antimykotika Laborparameter Alter Geschlecht Ernährungszustand (Body-Mass-Index) Allgemeinzustand (Karnofsky-Index) Tumordiagnose Krankheitsverlauf Satariano-Index Art und Anzahl sonstiger Begleiterkrankungen Art und Anzahl der Vortherapien Aktuelle Chemotherapie Komplette Begleitmedikation Applikationsart Dosierung Dauer Indikation Antimykotische Vortherapien Nachgewiesene Pathogene mit Art des Nachweises Beurteilung des Therapieerfolgs Unerwünschte Arzneimittelwirkungen mit Schweregrad nach CTC Potentielle Arzneimittelinteraktionen (leicht, mittelschwer, schwer) Gründe für Wechsel des Antimykotikums Kosten des Antimykotika-Einsatzes Liegezeit des Patienten Follow-Up des Patienten (12 Monate) Serum-Kreatinin Alanin-Transaminase (ALT) Gesamt-Bilirubin Als Parameter für die renale und hepatische Funktion wurden Serum-Kreatinin, ALT und Gesamt-Bilirubin detailliert analysiert. Diese Parameter wurden ausgewählt, da sie routinemäßig für alle stationären Patienten der Abteilung Hämatologie & Onkologie des

45 Klinische Datenerfassung 35 Universitätsklinikums Freiburg bestimmt werden. Die in der Folge beschriebenen Messwerte sind in Abbildung 18 beispielhaft für einen Verlauf der ALT wiedergegeben. Abbildung 18: Beispielhafter Verlauf der Aktivität der Alanin-Transaminase (ALT). Zunächst wurden die medianen Initialwerte der jeweiligen Parameter zu Beginn des Antimykotika-Einsatzes ermittelt, um den Grad der Vorschädigung des betreffenden Organs feststellen zu können. Dies ist insbesondere im Hinblick auf die Vergleichbarkeit der Ergebnisse der Toxizitäts-Untersuchungen essentiell. Es folgte die Berechnung der medianen Quotienten aus dem während des jeweiligen Antimykotika-Einsatzes aufgetretenen Maximalwerts des untersuchten Parameters und dessen Initialwert, um den maximalen (schädigenden) Effekt der antifungalen Substanz auf die Organfunktion analysieren zu können. Abschließend wurde jeweils noch der Patientenanteil angegeben, bei dem ein nephro- bzw. hepatotoxischer Effekt nach den in Abschnitt genannten Definitionen gesehen wurde. Zur Prüfung auf statistische Signifikanz wurde der zweiseitige Fisher-Exakt-Test angewendet.

46 Klinische Datenerfassung Ergebnisse Kosten des Einsatzes systemischer Antimykotika In Übereinstimmung mit internationalen Daten stiegen auch im stationären Bereich der Abteilung Hämatologie & Onkologie des Universitätsklinikums Freiburg die Kosten für systemische Antimykotika zwischen 2004 und 2008 deutlich an (Abbildung 19). Die Steigerungsrate während dieser Zeit lag bei etwa 150%. Da absolute Kosten der Klinikumsapotheke nicht publiziert werden dürfen, wurde eine relative Darstellung zu den Kosten des Jahres 2004 gewählt. Abbildung 19: Relative Kostenentwicklung systemischer Antimykotika im stationären Bereich der Abteilung Hämatologie & Onkologie des Universitätsklinikums Freiburg ( ). Trotz eines erstmaligen leichten Rückgangs der Kosten im Jahr 2009, der überwiegend durch eine geringere Anzahl allogener SZT und damit weniger Höchstrisiko-Patienten erklärt ist, machen systemische Antimykotika immer noch fast 20% der gesamten Arzneimittelausgaben für den stationären Bereich der Abteilung aus (Abbildung 20). Dieser Wert liegt damit auch deutlich über denen der anderen Antiinfektiva wie Antibiotika (7,8%) und Virustatika (0,9%).

47 Klinische Datenerfassung 37 Abbildung 20: Zusammensetzung der Arzneimittelausgaben für den stationären Bereich der Abteilung Hämatologie & Onkologie des Universitätsklinikums Freiburg im Jahr 2009.

48 Klinische Datenerfassung Patientenpopulation Tabelle 7: Charakteristika der eingeschlossenen Tumorpatienten. Anzahl der Patienten 250 Geschlecht (n, %) männlich 153 (61%) weiblich 97 (39%) Medianes Alter (Jahre, Range) 56 (19-85) Allgemeinzustand Medianer Karnofsky-Index (%, Range) 80 (20-100) Ernährungszustand Medianer Body-Mass Index (Range) 24,7 (15,2-42,6) Maligne Grunderkrankung (n, %) Leukämie 174 (70%) AML 116 ALL 32 CML 4 Andere Leukämie 3 MDS 19 Lymphom 52 (21%) Multiples Myelom 19 Anderes B-NHL 25 Morbus Hodgkin 4 T-NHL 3 Solider Tumor 12 (5%) Sonstige Grunderkrankung 1 12 (5%) Chemotherapie (CTx)-Vorbehandlung Mediane Anzahl CTx-Linien (n, Range) 2 (0-9) Mediane Anzahl CTx-Zyklen (n, Range) 4 (0-26) Verlauf der Grunderkrankung (n, %) Responder (CR, PR) 89 (36%) Non-Responder (PD, SD, ED) 161 (64%) Komorbiditäten (n, Range) Medianer Satariano-Index 1 (0-4) Mediane Anzahl sonstige Komorbiditäten 2 (0-7) Stammzelltransplantation (SZT) (n, %) 2 Allogene SZT 176 (70%) Autologe SZT 23 (9%) Keine SZT 51 (20%) Anzahl Medikamente pro Patient (Median, Range) 14 (1-47) AML Akute myeloische Leukämie, ALL Akute lymphoblastische Leukämie, CML Chronisch myeloische Leukämie, MDS Myelodysplastisches Syndrom, NHL Non-Hodgkin-Lymphome, CR Komplette Remission der Grunderkrankung, PR Partielle Remission, PD Progressive Erkrankung, SD Stabile Erkrankung, ED Erstdiagnose, 1 systemische Sklerose, aplastische Anämie, Osteomyelofibrose, chronisch idiopathische Myelofibrose (n=2), variabler Immundefekt, akute Leukose, Diamond-Blackfan-Anämie, Morbus Crohn (n=1), 2 n=19 Patienten wurden autolog und nachfolgend allogen transplantiert und der allo-szt-kohorte zugeordnet

49 Klinische Datenerfassung 39 Relevante Patientencharakteristika der untersuchten konsekutiven Tumorpatienten sind in Tabelle 7 zusammengefasst. Es zeigte sich ein ausgeglichenes Geschlechterverhältnis und eine für Tumorerkrankungen typische Altersstruktur mit einem medianen Alter von 56 Jahren (Abbildung 21) Patienten (n) Alter in Jahren Abbildung 21: Altersstruktur der eingeschlossenen Tumorpatienten. Sowohl der Allgemeinzustand (Karnofsky-Index %, Abbildung 22) als auch der Ernährungszustand (Body Mass Index 15,2-42,6) der untersuchten Patienten wiesen große Schwankungen auf. Patienten (n) Karnofsky-Index (%) Abbildung 22: Allgemeinzustand der eingeschlossenen Tumorpatienten zu Beginn des Antimykotika-Einsatzes.

50 Klinische Datenerfassung 40 Bezüglich der malignen Grunderkrankungen dominierten Leukämien (n=174, 70%), mit AML als häufigster Erkrankung (n=116). Auch Lymphome waren in der untersuchten Kohorte frequent (n=52, 21%), wohingegen solide Tumoren und sonstige Grunderkrankungen eher selten vorkamen (jeweils n=12). Die analysierten Patienten waren zum Zeitpunkt des Antimykotika-Einsatzes meist intensiv chemotherapeutisch vorbehandelt (im Median zwei Therapie-Linien und vier Therapie- Zyklen), hatten aber auf diese Vortherapien in der Mehrzahl nur unzureichend angesprochen. So liegt der Anteil der Non-Responder (Patienten ohne komplette oder partielle Remission der Grunderkrankung) in der Gesamt-Kohorte bei 64% (n=161). Einen weiteren Risikofaktor für den Erwerb invasiver Mykosen stellt die große Anzahl der Begleiterkrankungen dar (medianer Satariano-Index 1, mediane Anzahl sonstiger Komorbiditäten 2), wobei auch hier große interindividuelle Unterschiede vorliegen. Die Häufigkeit einzelner Satariano-Komorbiditäten ist in Abbildung 23 dargestellt. Erkrankung der Atemw ege Herzerkrankung (ohne Herzinfarkt) Weitere Tumorerkrankung Erkrankung der Leber Erkrankung der Gallenblase Diabetes mellitus Herzinfarkt Patienten (n) Abbildung 23: Häufigkeit der Satariano-Komorbiditäten unter den eingeschlossenen Patienten. Mehr als zwei Drittel der Patienten hatten zum Zeitpunkt der Analyse eine allogene SZT erhalten (n=176, 70%), wohingegen der Anteil der Patienten mit autologer SZT niedriger lag (n=23, 9%). Pro Krankenhausaufenthalt wurden im Median 14 Arzneimittel verschrieben (Range 1-47), wodurch sich auch das hohe Risiko der Patientenkohorte für potentielle Arzneimittelinteraktionen erklärt. Zytostatika, reine Vitamin- und Elektrolyt-Präparate sind hierbei nicht eingeschlossen. Die Verteilung der Anzahl von im Verlauf der stationären Aufenthalte verordneten Medikamenten zeigt Abbildung 24.

51 Klinische Datenerfassung Patienten (n) Anzahl Medikamente pro Patient Abbildung 24: Anzahl verordneter Medikamente pro Patient und stationärem Aufenthalt.

52 Klinische Datenerfassung 42 Tabelle 8 zeigt Charakteristika der Patienten, die eines der vier am häufigsten aus therapeutischer Indikation eingesetzten Antimykotika (liposomales Amphotericin B, Voriconazol, Caspofungin, Posaconazol) erhalten haben. Tabelle 8: Charakteristika der mit liposomalem Amphotericin B, Voriconazol, Caspofungin und Posaconazol behandelten Patienten. Lip. Amphotericin B Voriconazol Caspofungin Posaconazol Anzahl der Patienten Geschlecht (n, %) männlich weiblich 66 (63%) 39 (37%) 40 (66%) 21 (34%) 19 (70%) 8 (30%) 13 (59%) 9 (41%) Medianes Alter (Jahre, Range) 57 (21-75) 61 (21-77) 58 (22-75) 55 (22-75) Allgemeinzustand (Range) Medianer Karnofsky-Index (%) 80 (20-90) 80 (20-100) 80 (40-90) 80 (40-100) Komorbiditäten (n, Range) Medianer Satariano-Index Mediane Anzahl sonstige Kom. Maligne Grunderkrankung (n, %) Leukämie Lymphom Solider Tumor Sonstige Grunderkrankung Verlauf Grunderkrankung (n, %) Responder (CR, PR) Non-Responder (PD, SD, ED) CTx-Vorbehandlung Mediane Anzahl CTx-Linien Mediane Anzahl CTx-Zyklen Stammzelltransplantation (n, %) Allogene SZT Autologe SZT Keine SZT 1 (0-4) 2 (0-7) 84 (80%) 15 (14%) 1 (1%) 5 (5%) 25 (24%) 80 (76%) 2 (1-8) 4 (1-26) 89 (85%) 6 (6%) 10 (10%) 1 1 (0-3) 2 (0-7) 50 (82%) 9 (15%) 1 (1%) 1 (2%) 13 (21%) 48 (79%) 2 (1-8) 4 (1-19) 50 (82%) 4 (7%) 7 (11%) 2 1 (0-3) 2 (0-6) 24 (89%) 3 (11%) (22%) 21 (78%) 2 (1-5) 4 (1-10) 25 (93%) 1 (4%) 1 (4%) 3 1 (0-2) 2 (0-6) 20 (91%) 2 (9%) (27%) 16 (73%) 2 (1-5) 3,5 (1-11) 14 (64%) 0 8 (36%) 1,2,3 Abkürzungen: siehe Tabelle 4, 1 p=0.003, 2 p=0.020, 3 p=0.007 Geschlechterverteilung, Altersstruktur, Allgemeinzustand, Anteil und Verlauf der zugrundeliegenden Erkrankungen wiesen in allen vier Kohorten keine signifikanten Unterschiede auf. Gleiches gilt auch für die Anzahl der Begleiterkrankungen und die Intensität der zytostatischen Vorbehandlung. Der einzige statistisch signifikante Unterschied zwischen den Kohorten ist der häufigere Einsatz von Posaconazol bei nicht-transplantierten Patienten (8/22, 36%) im Vergleich zu liposomalem Amphotericin B (10/105, 10%, p=0.003), Voriconazol (7/61, 11%, p=0.020) und Caspofungin (1/27, 4%, p=0.007).

53 Klinische Datenerfassung Einsatz systemischer Antimykotika bei Patienten nach allogener, autologer und ohne periphere Blutstammzelltransplantation Tabelle 9: Einsatz systemischer Antimykotika (SAM) bei Patienten nach allogener, autologer und ohne SZT. Total allo-szt auto-szt keine SZT Anzahl der Patienten Angewendete SAM Fluconazol Liposomales Amphotericin B Voriconazol Caspofungin Posaconazol Indikation des SAM-Einsatzes Prophylaxe Empirische Therapie Präemptive Therapie Therapie nach Erregernachweis Anzahl angewendete SAM / Patient Median (Range) Patienten mit > 1 SAM (%) Patienten mit > 2 SAM (%) 191 (76%) 105 (42%) 61 (24%) 27 (11%) 22 (9%) 193 (77%) 81 (32%) 53 (21%) 22 (9%) 1 (1-5) 112 (45%) 36 (14%) 133 (76%) 89 (51%) 50 (28%) 25 (14%) 14 (8%) 140 (80%) 66 (38%) 1,2 40 (23%) 15 (9%) 2 (1-5) 96 (55%) 3,4 31 (18%) 19 (83%) 6 (26%) 4 (17%) 1 (4%) 0 19 (83%) 4 (17%) 1 4 (17%) 1 (4%) 1 (1-3) 5 (22%) 3 2 (9%) 39 (76%) 10 (20%) 7 (14%) 1 (2%) 8 (16%) 34 (67%) 11 (22%) 2 9 (18%) 6 (12%) 1 (1-3) 11 (22%) 4 3 (6%) Dauer des SAM-Einsatzes (Tage) Median (Range) 31 (2-91) 33 (2-91) 21 (3-64) 14 (4-62) Kosten des SAM-Einsatzes ( ) Median < > (19%) 72 (29%) 112 (45%) 18 (7%) (6%) 58 (33%) 91 (52%) 5,6 16 (9%) (70%) 1 (4%) 6 (26%) (51%) 13 (25%) 15 (29%) 6 2 (4%) 1 n.s., 2 p=0.043, 3 p=0.004, 4 p=0.001, 5 p=0.003, 6 p=0.001 Tabelle 9 stellt den Einsatz systemischer Antimykotika bei Patienten nach allogener, autologer und ohne SZT gegenüber. Fluconazol ist das in der untersuchten Patientenpopulation am häufigsten eingesetzte Antimykotikum und wurde bei mehr als drei Viertel aller antimykotisch behandelten Patienten angewendet. Der Einsatz erfolgte hierbei zu vergleichbaren Anteilen bei Patienten nach allogener und autologer SZT sowie bei nicht-transplantierten Patienten. Fluconazol wurde zum überwiegenden Anteil aus prophylaktischer Indikation appliziert. Als zweithäufigstes Antimykotikum wurde liposomales Amphotericin B (42%) eingesetzt, gefolgt von Voriconazol (24%), Caspofungin (11%) und Posaconazol (9%). Liposomales Amphotericin B und Caspofungin wurden überwiegend bei Patienten nach allogener SZT appliziert, wohingegen sich der Einsatz der Azole zwischen den Kohorten nur geringfügig unterschied (Tabelle 9).

54 Klinische Datenerfassung 44 Systemische Antimykotika wurden bei Patienten nach allogener SZT häufig zur empirischen Therapie eingesetzt (66/176, 38%), wobei der Unterschied gegenüber nicht-transplantierten Patienten (11/51, 22%, p=0.043), nicht jedoch gegenüber Patienten nach autologer SZT (4/23, 17%, 0.065) signifikant war. Dies entspricht dem hohen Risiko dieser Patienten bezüglich des Erwerbs invasiver Mykosen während und nach der Phase der Neutropenie Hinsichtlich des prophylaktischen und präemptiven Einsatzes sowie den Therapien nach Erregernachweis unterschieden sich die Kohorten nicht signifikant. Bei Empfängern allogener SZT lag die mediane Anzahl aufeinanderfolgend applizierter Antimykotika bei n=2, bei den anderen Kohorten jeweils bei n=1. Dabei gab es hinsichtlich der Patientenanteile, die mit mehr als einem systemischen Antimykotikum behandelt worden waren, signifikante Unterschiede zwischen Empfängern allogener SZT (96/176, 55%) und Patienten nach autologer SZT (5/23, 22%, p=0.004) sowie nicht-transplantierten Patienten (11/51, 22%, p=0.001). Die mediane Dauer des Antimykotika-Einsatzes lag bei Patienten nach allogener SZT (33d) deutlich höher als bei den anderen Kohorten (21d bzw. 14d). Gründe hierfür sind die insgesamt frühere Initiierung einer antimykotischen Behandlung (höhere Rate empirischer Therapien) und die erhöhte Inzidenz invasiver Mykosen in dieser Kohorte. Gemeinsam mit dem häufigeren Gebrauch der teuren (da obligat intravenösen) Arzneistoffe liposomales Amphotericin B und Caspofungin führte dies zu deutlich höheren medianen Kosten bei Empfängern allogener SZT (2467 ) gegenüber den anderen Kohorten (84 bzw. 116 ). Die Patientenanteile mit Antimykotika-Kosten >1000 differierten hierbei signifikant zwischen den Patienten nach allogener SZT (107/176, 61%) und denen nach autologer SZT (6/23, 26%, p=0.003) bzw. den nicht-transplantierten Patienten (17/51, 33%, p=0.001).

55 Klinische Datenerfassung Vergleichende Darstellung der Daten für liposomales Amphotericin B, Voriconazol, Caspofungin und Posaconazol Tabelle 10: Einsatz der systemischen Antimykotika (SAM) liposomales Amphotericin B, Voriconazol, Caspofungin und Posaconazol: Indikation, potentielle Arzneimittelinteraktionen (PAI) und unerwünschte Arzneimittelwirkungen (UAW). Lip. Amphotericin B Voriconazol Caspofungin Posaconazol Anzahl der Patienten Indikation des SAM-Einsatzes Prophylaxe Empirische Therapie Präemptive Therapie Therapie nch Erregernachweis 12 (11%) 72 (69%) 17 (16%) 4 (4%) 8 (13%) 7 (11%) 37 (61%) 9 (15%) 0 9 (33%) 12 (44%) 6 (22%) 16 (73%) 2 (9%) 2 (9%) 2 (9%) Mediane Therapie-Linie (Range) 1 (1-2) 1 (1-4) 2 (1-3) 1 (1-2) Dauer des SAM-Einsatzes (Tage) Median (Range) 14 (1-42) 13 (2-51) 14 (1-57) 18,5 (2-38) PAI (n, %) Keine PAI 1-2 PAI 3-4 PAI > 4 PAI UAW (n, %) Keine UAW 1 UAW > 1 UAW Nephrotoxizität (Kreatinin) Median Kreatinin initial (mg/dl) Median Kreatinin maximal / initial Patienten mit Nephrotoxizität * Hepatotoxizität (ALT) Median ALT initial (U/l) Median ALT maximal / initial Patienten mit Hepatotoxizität ** Hepatotoxizität (Bilirubin, BIL) Median BIL initial (mg/dl) Median BIL maximal / initial Patienten mit Hepatotoxizität ** 24 (23%) 20 (19%) 28 (27%) 1,2,3 33 (31%) 43 (41%) 44 (42%) 4,5,6 18 (17%) 0,8 1,53 21 (20%) 7,8,9 25,5 1,07 26 (25%) 10 0,8 1,50 37 (35%) 13,14,15 19 (31%) 35 (57%) 6 (10%) 1 1 (2%) 35 (57%) 19 (31%) 4 7 (11%) 0,9 1,18 5 (8%) ,57 22 (36%) 11 0,8 1,46 21 (34%) 13 9 (33%) 18 (67%) (67%) 8 (30%) 5 1 (4%) 0,9 1,25 3 (11%) 8 21,5 1,80 9 (33%) 12 1,6 1,15 6 (22%) (45%) 8 (36%) 4 (18%) (50%) 11 (50%) 6 0 0,8 1,06 1 (5%) 9 24,5 1,84 12 (55%) 10,11,12 0,5 1,27 4 (18%) 15 SAM systemische Antimykotika, PAI potentielle Arzneimittelinteraktionen, UAW unerwünschte Arzneimittelwirkungen, ALT Alanin- Transaminase, BIL Gesamt-Bilirubin * definiert als Verdoppelung des Serum-Kreatinis während des Antimykotika-Einsatzes oder eine Erhöhung um mindestens 1 mg/dl bei initial bereits erhöhtem Serum-Kreatinin, ** definiert als Erhöhung des ALT- bzw. Gesamt-Bilirubin-Spiegels auf eine höhere Stufe gemäß den Common Toxicity Criteria (CTC) des US National Cancer Institute [101A] während des Antimykotika-Einsatzes 1 p=0.001, 2 p=0.001, 3 p=0.001, 4 n.s., 5 p=0.019, 6 n.s., 7 p=0.048, 8 n.s., 9 n.s., 10 p=0.009, 11 n.s., 12 n.s., 13 n.s., 14 n.s., 15 n.s. Tabelle 10 stellt den Einsatz von liposomalem Amphotericin B, Voriconazol, Caspofungin und Posaconazol gegenüber. Liposomales Amphotericin B wurde in der untersuchten Kohorte überwiegend zur empirischen Therapie eingesetzt (72/105, 69%), während der Einsatz von Voriconazol bei den meisten Patienten zur präemptiven Therapie erfolgte

56 Klinische Datenerfassung 46 (37/61, 61%). Caspofungin wurde in etwa gleich häufig aus diesen beiden Indikationen eingesetzt (33% bzw. 44%), Posaconazol in erster Linie zur Prophylaxe (16/22, 73%). Im Gegensatz zu den anderen Antimykotika wurde Caspofungin meist als Second-Line- Therapeutikum angewandt, wenn andere therapeutische Optionen bei einem Patienten ineffektiv waren oder intolerable Nebenwirkungen gezeigt hatten. Die mediane Dauer des Antimykotika-Einsatzes lag bis auf Posaconazol mit leicht höherem Wert (18,5 Tage) für alle Arzneistoffe in einem engen Bereich (13-14 Tage). Potentielle Arzneimittelinteraktionen wurden bei allen systemischen Antimykotika häufig detektiert, wobei liposomales Amphotericin B (81/105, 77%) eine signifikant höhere Rate gegenüber Posaconazol (12/22, 55%, p=0.037), nicht jedoch gegenüber Voriconazol (42/61, 69%, p=0.272) oder Caspofungin (18/27, 67%, p=0.319) aufwies. Dagegen war der Patientenanteil mit drei oder mehr Interaktionen bei Amphotericin B mit 58% signifikant höher als bei Voriconazol (12%, p=0.001), Caspofungin (0%, p=0.001) und Posaconazol (18%, p=0.001). Eine Darstellung der im Rahmen dieser Arbeit mehr als einmal detektierten potentiellen Arzneimittelinteraktionen zeigt Tabelle 11. Hierbei liegen im Fall von liposomalem Amphotericin B (n=9) potentielle Interaktionen mit mehr Arzneistoffen vor als bei Voriconazol (n=6), Posaconazol (n=4) und Caspofungin (n=2). Tabelle 11: Häufig detektierte potentielle Arzneimittelinteraktionen. Systemisches Antimykotikum Interagierender Arzneistoff Häufigkeit der Interaktion Effekt Liposomales Amphotericin B Vancomycin Furosemid Cyclosporin A Torasemid Prednison / Prednisolon Ceftazidim Dexamethason Budesonid Ceftriaxon n=51 n=47 n=40 n=38 n=38 n=37 n=27 n=8 n=4 Nephrotoxizität Nephrotoxizität Nephrotoxizität Nephrotoxizität Hypokaliämie Nephrotoxizität Hypokaliämie Hypokaliämie Nephrotoxizität Voriconazol (Vor) Pantoprazol Cyclosporin A Prednisolon Nitrendipin Glibenclamid Phenytoin n=31 n=16 n=7 n=3 n=2 n=2 AUC Pantoprazol AUC Cyclosporin A AUC Prednisolon AUC Nitrendipin AUC Glibenclamid AUC Vor, AUC Phenytoin Caspofungin Cyclosporin A Dexamethason n=16 n=10 AUC Caspofungin AUC Caspofungin Posaconazol Pantoprazol Cyclosporin A (CyA) Ranitidin Nitrendipin n=11 n=7 n=3 n=2 AUC Posaconazol AUC Posaconazol, AUC CyA AUC Posaconazol AUC Nitrendipin

57 Klinische Datenerfassung 47 Im Fall des liposomalen Amphotericin B wurden überwiegend pharmakodynamische Interaktionen, wie die sich gegenseitig verstärkende Nephrotoxizität bei gleichzeitiger Gabe mit Vancomycin (n=51) oder Furosemid (n=47) oder die verstärkte Hypokaliämie bei paralleler Applikation von Prednison/Prednisolon (n=38) oder Dexamethason (n=27), detektiert. Die Interaktionen der Azole waren überwiegend pharmakokinetischen Ursprungs und meist durch Inhibition eines oder mehrerer CYP-Enzyme bedingt. Jeweils am häufigsten wurden Interaktionen bei gleichzeitiger Gabe mit Pantoprazol (n=31 bzw. n=11) und Cyclosporin A (n=16 bzw. n=7) detektiert. Caspofungin wies potentielle Interaktionen mit Cyclosporin A (n=16) und Dexamethason (n=10) auf. Unerwünschte Arzneimittelwirkungen wurden bei allen Antimykotika häufig beobachtet, wobei die Rate bei liposomalem Amphotericin B (61/105, 59%) am höchsten und damit auch signifikant höher als die von Caspofungin (9/27, 33%, p=0.019) lag. Die Unterschiede gegenüber Voriconazol (26/61, 42%, p=0.053) und Posaconazol (11/22, 50%, p=0.482) waren dagegen nicht signifikant. Die Patientenanteile mit mehr als einer unerwünschten Arzneimittelwirkung unterschieden sich ebenfalls nicht signifikant zwischen dem Polyen (18/105, 17%) und sowohl Voriconazol (7/61, 11%, p=0.375) als auch Caspofungin (1/27, 4%, p=0.121). In der Posaconazol-Kohorte wies kein Patient mehr als eine unerwünschte Arzneimittelwirkung auf. In Übereinstimmung mit früheren Daten zeigte Amphotericin B (21/105, 20%) - trotz der liposomalen Formulierung - signifikant häufiger nephrotoxische Effekte als Voriconazol (5/61, 8%, p=0.048). Die Unterschiede gegenüber Caspofungin (3/27, 11%, p=0.404) und Posaconazol (1/22, 5%, p=0.120) waren jedoch - wahrscheinlich aufgrund der geringen Patientenzahlen - nicht signifikant. Während die medianen Kreatinin-Werte zu Beginn des Antimykotika-Einsatzes keine signifikanten Unterschiede zwischen den Kohorten aufwiesen (0,8-0,9 mg/dl), lag der Quotient aus Maximal- und Initialwert bei dem Polyen (1,53) im Median deutlich höher als bei Voriconazol (1,18), Caspofungin (1,25) und Posaconazol (1,06). Auch dies ist ein deutlicher Hinweis auf das gegenüber anderen Antimykotika erhöhte nephrotoxische Potential von liposomalem Amphotericin B. Hepatotoxische Effekte hinsichtlich der Transaminase ALT wurden bei Posaconazol (12/22, 55%) signifikant häufiger gesehen als bei liposomalem Amphotericin B (26/105, 25%, p=0.009), wohingegen die Unterschiede gegenüber Voriconazol (22/61, 36%, p=0.206) und Caspofungin (9/27, 33%, p=0.158) nicht signifikant waren. Von den n=12 Patienten mit erhöhten ALT-Werten unter Posaconazol lag bei acht Patienten eine um mehr als dreifache Erhöhung gegenüber dem Ausgangswert vor, hiervon bei zweien sogar eine mehr als fünffache Erhöhung. Dieser Effekt war eine der auffälligsten Beobachtungen der

58 Klinische Datenerfassung 48 durchgeführten Analyse, da ein derartiger Einfluss des Arzneistoffs auf die hepatische Funktion zuvor in keiner klinischen Studie beschrieben wurde. Die medianen ALT-Aktivitäten zu Beginn des Antimykotika-Einsatzes lagen in allen vier Kohorten im selben Bereich (21-25,5 U/l), wohingegen der Quotient aus Maximal- und Initialwert bei Posaconazol (1,84) und Caspofungin (1,80) im Median höher als bei Voriconazol (1,57) und liposomalem Amphotericin B (1,07) war. Hinsichtlich der Häufigkeit des Auftretens erhöhter Spiegel des Gesamt-Bilirubin fanden sich keine signifikanten Unterschiede zwischen liposomalem Amphotericin B (37/105, 35%) und Voriconazol (21/61, 34%, p=1.000), Caspofungin (6/27, 22%, p=0.253) oder Posaconazol (4/22, 18%, p=0.140). Der mediane Initialwert des Gesamt-Bilirubin in der Caspofungin- Kohorte (1,6 mg/dl) wies auf eine deutliche hepatische Vorschädigung hin, während er bei den anderen Kohorten nicht erhöht war (0,5-0,8 mg/dl). Die medianen Quotienten aus Maximal- und Initialwert des Gesamt-Bilirubin lagen bei liposomalem Amphotericin B (1,50) und Voriconazol (1,46) über denen von Posaconazol (1,27) und Caspofungin (1,15). Abgesehen von nephrotoxischen und hepatotoxischen Effekten wurden in drei der vier Antimykotika-Kohorten noch weitere unerwünschte Arzneimittelwirkungen detektiert (Tabelle 12). Tabelle 12: Weitere unerwünschte Arzneimittelwirkungen (UAW) der systemischen Antimykotika. Systemisches Antimykotikum UAW n Liposomales Amphotericin B Elektrolytverschiebungen Infusionsreaktionen Rückenschmerzen Exanthem Voriconazol Sehstörungen (incl. Halluzinationen) Verwirrtheit Übelkeit Caspofungin Elektrolytverschiebungen 1 Posaconazol - -

59 Klinische Datenerfassung Antimykotische Kombinationstherapien in der untersuchten Kohorte In der untersuchten Patientenkohorte wurden n=13 Patienten im Rahmen einer antimykotischen Kombinationstherapie behandelt (Tabelle 13). Tabelle 13: Antimykotische Kombinationstherapien im Rahmen der Datenerfassung. Patient Nr. Geschlecht Antimykotische Kombination Indikation Follow-Up (12 Monate) 1 M A + C PRÄ L 2 W A + C PRÄ L 3 M A + C PRÄ T 4 W A + F EMP L 5 M A + F EMP L 6 M A + F ERR T 7 W A + F EMP L 8 W A + P ERR L 9 W C + F ERR T * 10 M C + F ERR L 11 W C + P ERR T * 12 M C + V ERR T * 13 M F + V ERR T A liposomales Amphotericin B, C Caspofungin, EMP empirische Therapie, ERR Therapie nach Erregernachweis, F Fluconazol, L lebend, M männlich, PRÄ präemptive Therapie, T verstorben, T * vermutlich oder gesichert an invasivem Pilzinfekt verstorben, V Voriconazol, W weiblich Hierbei wurde die Kombination aus liposomalem Amphotericin B und Fluconazol am häufigsten eingesetzt (n=4), gefolgt von liposomalem Amphotericin B und Caspofungin (n=3) sowie Caspofungin und Fluconazol (n=2). Indikation des Einsatzes war in den meisten Fällen die sonst seltene Therapie nach Erregernachweis (n=7), wobei einer Kombinationstherapie in allen Fällen eine Monotherapie vorausging. Von den behandelten Patienten verstarben n=5 während des Follow-Up von 12 Monaten, wobei invasive Mykosen bei drei Patienten als vermutliche oder gesicherte Todesursache dokumentiert wurden. Aufgrund der geringen Patientenanzahl unter antimykotischer Kombinationstherapie konnte keine weitergehende statistische Auswertung erfolgen.

60 Klinische Datenerfassung Nachgewiesene Erreger in der untersuchten Kohorte Hinsichtlich der in Blutkultur, BAL, Liquor oder Gewebeproben nachgewiesenen fungalen Pathogene ergab sich aus der Datenanalyse das in Tabelle 14 demonstrierte Bild. Hierbei zeigte sich ein etwa gleichhäufiges Auftreten von Schimmelpilzen und Hefen, wobei Aspergillus fumigatus (n=8) und Candida albicans (n=5) die erwartet häufigsten Erreger darstellten. Im betreffenden Zeitraum wurden ausschließlich Spezies der Gattungen Aspergillus und Candida nachgewiesen. Insbesondere die fehlende Detektion der mit hohen Mortalitätsraten assoziierten Zygomyzeten in der untersuchten Kohorte stellte einen erfreulichen Befund der Analyse dar. Tabelle 14: Im Zeitraum der Datenanalyse nachgewiesene fungale Pathogene. Nachgewiesenes Pathogen n Schimmelpilze 10 Aspergillus fumigatus 8 Aspergillus flavus 1 Aspergillus terreus 1 Hefepilze 9 Candida albicans 5 Candida glabrata 3 Candida krusei 1

61 Klinische Datenerfassung Derzeitige interne Leitlinie der Abteilung Innere Medizin I des Universitätsklinikums Freiburg zum Einsatz systemischer Antimykotika Abbildung 25: Interne Leitlinie der Abteilung Innere Medizin I des Universitätsklinikums Freiburg zum Einsatz systemischer Antimykotika (Stand: 01/2010) in Adaptation an internationale Guidelines und Publikationen. KG Körpergewicht, * Patienten mit AML oder MDS unter Induktions-Chemotherapie, ** 2 x 4 mg/kg KG/d i.v. oder Oralisierung auf 2 x 200 mg/d

62 Klinische Datenerfassung 52 Abbildung 25 zeigt den derzeit gültigen Entscheidungsbaum zum Einsatz systemischer Antimykotika in der Abteilung Innere Medizin I des Universitätsklinikums Freiburg. Dieser ist eng an internationale Guidelines und Publikationen angelehnt und evidenzbasiert. Im Bereich der Primärprophylaxe wird Fluconazol 200 mg/d bei Patienten nach allogener SZT und Posaconazol 3 x 200 mg/d bei Patienten mit AML oder MDS unter Induktions- Chemotherapie oder im Rezidiv der Grunderkrankung angewandt. Die Einführung von Posaconazol in die Leitlinie erfolgte aufgrund der an eigenen Patienten häufig gesehenen hepatotoxischen Effekte mit deutlicher Verzögerung gegenüber anderen Zentren. Zur Sekundärprophylaxe nach stattgehabter Infektion mit Aspergillus spp. wird Voriconazol 2 x 200 mg/d, nach Infektion mit Zygomyzeten Posaconazol 3 x 200 mg/d eingesetzt. Im Bereich der empirischen Therapie wird liposomales Amphotericin B in einer Dosierung von 1 mg/kg Körpergewicht, bei Unverträglichkeit Caspofungin mit 70 kg an Tag 1 und 50 kg an den Folgetagen angewandt. Voriconazol in einer Dosierung von 2 x 400 mg an Tag 1 und 2 x 200 mg an den Folgetagen ist Mittel der ersten Wahl im Bereich der präemptiven Therapie, wobei im Fall einer Unverträglichkeit oder Unwirksamkeit liposomales Amphotericin B (Dosis: 3 mg/ kg Körpergewicht) und Caspofungin (Dosis wie bei empirischer Therapie) als Alternativen zur Verfügung stehen. Das gleiche Vorgehen wie bei der präemptiven Therapie wird auch bei Nachweis von Erregern der Gattung Aspergillus verfolgt, wohingegen eine nachgewiesene Zygomyzeten- Infektion mit Posaconazol 4 x 200 mg oder liposomalem Amphotericin B in einer Dosierung von 3 mg/ kg Körpergewicht behandelt wird. In Abbildung 18 aufgrund der im Bereich der Hämatologie und Onkologie niedrigen Frequenz nicht integriert ist der therapeutische Einsatz von Fluconazol bei systemischen Candidosen, wobei die Dosierung ( mg/d) von der nachgewiesenen Spezies abhängt.

63 Klinische Datenerfassung Diskussion Durch Fehlen stringenter Ein- und Ausschlusskriterien, wie sie üblicherweise bei klinischen Studien angewandt werden, bildet die vorliegende prospektive Analyse die klinische Realität des Einsatzes systemischer Antimykotika bei Tumorpatienten besser ab als vorausgegangene Untersuchungen. Die fehlende Vorselektion zeigt sich hierbei insbesondere an den Patientencharakteristika der untersuchten Gesamtkohorte. So liegen u.a. eine für Tumorerkrankungen typische Altersstruktur, ein eingeschränkter Allgemeinzustand der Patienten und eine hohe Anzahl von Begleiterkrankungen vor. Aus dem Fehlen derartiger Kriterien ergibt sich allerdings auch eine hinsichtlich der malignen Grunderkrankungen und des Antimykotika-Einsatzes heterogene Patientenpopulation, da nicht eine einzelne Indikationen, ein Arzneistoff oder Patienten einer Tumorentität, sondern jede Applikation systemischer Antimykotika im stationären Bereich der Abteilung dokumentiert und analysiert wurde. So ist beispielsweise bei der Beurteilung der Toxizitätsanalyse zu beachten, dass es sich bei der mit Caspofungin behandelten Kohorte überwiegend um Patienten handelt, bei denen im Rahmen vorausgegangener antimykotischer Therapien intolerable Toxizitäten oder eine insuffiziente Effektivität detektiert wurden. Aus diesem Grund lassen sich diese Ergebnisse nicht direkt mit denen vergleichen, die von Patienten ohne vorausgegangene antimykotische Therapie erhalten wurden. Besonders augenfällig wird dieser Unterschied bei Betrachtung der medianen Initialwerte des Gesamt-Bilirubin, die auf eine deutliche hepatische Vorschädigung bei Patienten der Caspofungin-Kohorte hindeuten. Hinsichtlich der Patientencharakteristika sind die einzelnen Kohorten jedoch wie beschrieben durchaus vergleichbar. Durch das heterogene Patientenkollektiv sind auch die zum Teil geringen Kohortengrößen erklärbar, wie die der Patienten nach autologer SZT oder der Patienten unter Posaconazolbzw. Caspofungin-Gabe. Der Einsatz des im Zeitraum der Untersuchung am häufigsten applizierten Antimykotikums Fluconazol wurde aus mehreren Gründen weniger detailliert analysiert als bei den anderen Arzneistoffen. Zum einen wird das Azol in der Abteilung Hämatologie & Onkologie des Universitätsklinikums Freiburg schon seit einigen Jahren fast ausschließlich aus prophylaktischer Indikation und ohne Auftreten relevanter unerwünschter Arzneimittelwirkungen eingesetzt. Zum anderen trägt es aufgrund der Verfügbarkeit von Generika kaum zur pharmakoökonomischen Bedeutung der Antimykotika insgesamt bei. Möglicher Kritikpunkt an der Analyse ist der Einschluss von Patienten aus nur einem Zentrum, wodurch die Repräsentativität der Daten eingeschränkt sein könnte. Andererseits

64 Klinische Datenerfassung 54 ergab sich hierdurch eine genaue Abbildung des stationären Patientenkollektivs der Abteilung, wie sie sonst nicht möglich gewesen wäre. Da sich jedes Zentrum sowohl hinsichtlich des behandelten Patientenkollektivs als auch des klinikspezifischen Erregerspektrums und der Resistenzsituation unterscheidet, sind ausschließlich an eigenen Patienten durchgeführte Untersuchungen durchaus gerechtfertigt und äußerst relevant. Die Auswahl von drei der fünf hämato-onkologischen Stationen des Klinikums erfolgte nach deren Relevanz aus infektiologischer Sicht, wobei auf allen drei Stationen eine hohe Dichte von Patienten mit hohem Risiko für den Erwerb invasiver Mykosen vorlag. Zudem hätte eine Datenanalyse auf allen fünf Stationen einen zu großen Arbeitsaufwand bedeutet, zumal neben den beschriebenen Untersuchungen noch weitere Aufgaben im interdisziplinären Team erfüllt wurden. Hierzu gehörte u.a. die Prüfung von Patientenmedikationen auf Arzneimittelinteraktionen, woraus in einigen Fällen Umstellungen der Medikation und Dosismodifikationen resultierten, sowie die Entwicklung und Durchführung eines TDM von Posaconazol wie in Abschnitt 3.5 beschrieben. Auf eine Klassifikation potentieller Arzneimittelinteraktionen und unerwünschter Arzneimittelwirkungen gemäß ihrer Schweregrade, wie in vorausgegangenen Publikationen zu anderen Arzneistoffklassen beschrieben [99,100], wurde bewusst verzichtet. Primäres Ziel der vorliegenden Arbeit war die Dokumentation und Gegenüberstellung der Häufigkeit der genannten Effekte bei systemisch eingesetzten Antimykotika, da Daten hierzu bislang nicht vorliegen. Eine weitergehende Unterteilung der Effekte, beispielsweise in leichte, mittelschwere und schwere Neben- bzw. Wechselwirkungen, hätte zu deutlich komplexeren und schwieriger zu interpretierenden Datensätzen geführt, was bei der Größe des vorliegenden Kollektivs von n=250 Patienten nicht zielführend gewesen wäre. Zudem erfolgt die Beurteilung der genannten Effekte hinsichtlich ihrer klinischen Relevanz je nach verwendeter Literatur äußerst unterschiedlich, weswegen eine uninterpretierte Darstellung der reinen Häufigkeiten in diesem Kontext als objektiverer und geeigneterer Weg erscheint. Die erhaltenen Ergebnisse müssen vor dem Hintergrund gesehen werden, dass sich die detektierten potentiellen Arzneimittelinteraktionen der Antimykotika qualitativ deutlich unterschieden. So lagen bei liposomalem Amphotericin B, bei dem zahlenmäßig die häufigsten Effekte detektiert wurden, überwiegend pharmakodynamische Interaktionen zugrunde, die meist gut vorhersagbar und behandelbar sind. Im Gegensatz dazu waren die meisten Interaktionen der Azole pharmakokinetischer Natur, weswegen sie - u.a. aufgrund der patientenindividuellen Unterschiede der CYP-Ausstattung - überwiegend schlecht vorhersagbar sind und damit eine größere klinische Relevanz aufweisen. Allen Literaturquellen zu potentiellen Arzneimittelinteraktionen ist gemeinsam, dass bei schon seit längerer Zeit auf dem Markt befindlichen Arzneistoffen grundsätzlich mehr Daten

65 Klinische Datenerfassung 55 hinterlegt sind, als bei gerade erst zugelassenen Substanzen. Dies hat den Hintergrund, dass Interaktionen häufig erst weit nach Zulassung eines Arzneistoffs entdeckt und dokumentiert werden, weswegen eine Datenbank auch immer nur eine Momentaufnahme darstellt und ständig aktualisiert werden muss. Vor diesem Hintergrund müssen auch die im Rahmen der vorliegenden Arbeit erhobenen Daten gesehen werden, in der ältere Arzneistoffe (z.b. Voriconazol, liposomales Amphotericin B) mit neueren (z.b. Posaconazol) verglichen wurden. Die Auswahl der im Rahmen dieser Arbeit zur Detektion und Analyse potentieller Arzneimittelinteraktionen verwendeten Quellen richtete sich nach deren Verfügbarkeit in der Apotheke des Universitätsklinikums Freiburg. Bei der Beurteilung der Wahrscheinlichkeit eines Zusammenhangs zwischen einer unerwünschten Arzneimittelwirkung und dem ursächlichen Medikament stellen die beurteilenden Personen einen wichtigen Einflussfaktor dar. Je nach klinischer Erfahrung und Grad der Sensibilisierung für die Problematik kann hier von großen Unterschieden in der Einschätzung beobachteter Effekte und der Häufigkeit der Erkennung derselben ausgegangen werden. Da die Beurteilung möglicher Zusammenhänge im Rahmen der vorliegenden Arbeit immer durch dieselben Personen erfolgte, konnte die Variabilität hinsichtlich des genannten Aspekts minimiert werden. Die Beurteilung des Zusammenhangs zwischen einem toxischen Effekt und dem ursächlichen Arzneistoff stellt bei hämato-onkologischen Patienten eine große Herausforderung dar, da es sich meist um eine komplexe Pharmakotherapie mit multipler Medikation handelt. Trotz einer Interpretation der Daten im interdisziplinären Team und in enger Kooperation mit klinisch erfahrenen Ärzten können derartige Korrelationen nur in den wenigsten Fällen eindeutig hergestellt bzw. bewiesen werden. Die Rate erhöhter ALT-Aktivitäten bei Gabe von Posaconazol liegt deutlich über den Daten früherer Studien. Mögliche Gründe hierfür werden in Abschnitt beim TDM von Posaconazol diskutiert. Die vorliegenden Ergebnisse stellen für den klinischen Alltag repräsentative und hochrelevante Daten dar. Insbesondere zu nennen sind dabei die hohe Frequenz potentieller Arzneimittelinteraktionen bei allen analysierten Arzneistoffen sowie die hohe Rate hepatotoxischer Effekte im Fall des als gut verträglich geltenden Posaconazol. Durch die Berücksichtigung der Ergebnisse dieser Arbeit bei der Aktualisierung der internen Leitlinie zum Einsatz systemischer Antimykotika der Abteilung Innere Medizin I des Universitätskliniums Freiburg hatten die Untersuchungen zudem direkten Einfluss auf klinische Entscheidungen.

66 Analytik Posaconazol 56 4 Bestimmung von Posaconazol aus humanem Serum mittels HPLC und fluorimetrischer Detektion 4.1 Hintergrund Aufgrund der noch ausstehenden Zulassung einer parenteralen Formulierung ist das systemische Antimykotikum Posaconazol bisher nur in Form einer oralen Suspension verfügbar. Vergleichbar mit Itraconazol kann die orale Bioverfügbarkeit des Arzneistoffs bei gleichzeitiger Nahrungsaufnahme erhöht werden (ca. +160%), wobei sich die Einnahme mit fettreicher Nahrung besonders deutlich auswirkt (ca. +300%) [ ]. Neben der Ernährung hat auch der ph-wert des Magens einen wichtigen Einfluss auf Posaconazol-Serumspiegel. So führt die parallele Gabe des H 2 -Rezeptor-Antagonisten Cimetidin bei Gesunden zu einer Verringerung der Posaconazol-Spiegel um 40% [122]. Auch die Gabe des Protonenpumpeninhibitors (PPI) Esomeprazol führt - ebenfalls bei Gesunden - zu einer um 32% verminderten AUC, während die Einnahme von Posaconazol mit säurehaltigen Getränken höhere Serumspiegel zur Folge hat [123]. In derselben Studie wurde des Weiteren festgestellt, dass die parallele Gabe des Prokinetikums Metoclopramid zu einer leichten Abnahme der oralen Bioverfügbarkeit führt (-19%), was wahrscheinlich auf eine geringere Kontaktzeit des Antimykotikums mit der Mucosa und damit einer geringeren Resorption zurückzuführen ist. Die Aufteilung der therapeutischen Tagesdosis (800 mg) auf vier Einzeldosen resultiert in einer maximalen AUC, wobei deutliche intra- und inter-individuelle Unterschiede vorliegen [124,125]. Die orale Bioverfügbarkeit ist besonders niedrig bei Patienten nach Knochenmarktransplantation oder SZT [126]. Mögliche Ursachen hierfür sind eine höhere Mucositis-Inzidenz und Interaktionen mit der umfangreichen Begleitmedikation. Darüber hinaus konnte gezeigt werden, dass auch das Auftreten einer GvHD Einfluss auf die Posaconazol-Serumspiegel hat [125,127]. Weiterhin konnte demonstriert werden, dass niedrige Posaconazol-Serumspiegel häufiger bei Patienten beobachtet werden, die unter Mucositis, Diarrhoe oder Erkrankungen des Verdauungstrakts leiden [128]. Die Datenlage zu einer möglichen Korrelation zwischen Posaconazol-Blutspiegeln und prophylaktischer bzw. therapeutischer Effektivität des Arzneistoffs ist bislang limitiert. Die amerikanische Produktinformation enthält den Hinweis auf einen Zusammenhang zwischen Höhe der Posaconazol-Serumspiegel und prophylaktischer Wirksamkeit

67 Analytik Posaconazol 57 [129]. Außerdem zeigte eine Untersuchung an Patienten mit GvHD nach SZT eine Korrelation zwischen dem erhöhten Risiko einer Durchbruchinfektion und niedrigen Posaconazol-Serumspiegeln [125]. Der mediane Posaconazol-Serumspiegel der Patienten mit Durchbruchinfektionen lag bei 611 μg/l, der von solchen ohne Durchbruchinfektion dagegen mit 922 μg/l deutlich höher. Aufgrund dieser Ergebnisse wird von der US Food and Drug Administration (FDA) ein Zielspiegel von mindestens 700 μg/l empfohlen [130]. In einer multizentrischen Studie wurde zudem ein Zusammenhang zwischen hohen Serum-Konzentrationen und einem verbesserten Ansprechen bei der Therapie der invasiven Aspergillose gesehen [131]. Ein TDM von Posaconazol wird derzeit für Patienten mit Verdacht auf ungenügende orale Resorption, Patienten mit progressiver Mykose unter Posaconazol-Therapie, Patienten unter Begleitmedikation mit hohem Interaktionspotential und Patienten mit erhöhtem Risiko für niedrige Posaconazol-Serumspiegel (z.b. Patienten nach SZT) empfohlen [60]. Dennoch werden regelmäßige Spiegelmessungen bislang nur in wenigen deutschen Zentren durchgeführt und auch in Freiburg war bis zu Beginn der vorliegenden Arbeit keine entsprechende analytische Methode verfügbar.

68 Analytik Posaconazol Bestehende Methoden Zum Zeitpunkt der Methodenentwicklung waren bereits mehrere HPLC-basierte analytische Verfahren zur Quantifizierung von Posaconazol aus humanem Serum etabliert worden. Alle diese Methoden haben jedoch den Nachteil, dass sie die Verwendung interner Standards beinhalten oder dass komplexe und zeitaufwändige Arbeitsschritte zur Probenvorbereitung nötig sind, wobei letztere die Wahrscheinlichkeit von Störungen (u.a. dem Verlust von Anteilen des Analyten) und individuellen Fehlern bei der Durchführung erhöhen. Beispielhaft sei eine Methode von Chhun et al. genannt, die die Zugabe einer Mischung aus Hexan und Methylenchlorid vorsieht, welche nachfolgend abgedampft werden muss. Zudem ist hier der Einsatz des internen Standards Diazepam notwendig [132]. Methoden von Müller et al. und Kim et al. schließen die Präzipitation von Serumproteinen mit Acetonitril oder Methanol ein, wobei im ersten Fall zudem Itraconazol als interner Standard eingesetzt wird [124,133]. Auch der Einsatz interner Standards ist mit analytischen Problemen verbunden, da nicht nur diese Substanzen, sondern auch andere Stoffe mit derselben Retentionszeit nicht in der Serumprobe vorhanden sein dürfen. Da Tumorpatienten und insbesondere Empfänger allogener und autologer SZT eine Vielzahl von Medikamenten erhalten, ist die Wahrscheinlichkeit derartiger Beeinträchtigungen hoch. Die bisher aufgeführten Methoden basieren entweder auf einer fluorimetrischen oder UV-Detektion. Daneben wurde von Shen et al. ein Verfahren zur Quantifizierung von Posaconazol aus humanem Serum mit massenspektrometrischer Detektion publiziert [134]. Diese Methode zeichnet sich durch eine schnelle und einfache Durchführung aus und weist dazu mit einer Bestimmungsgrenze von 5 μg/l eine äußerst hohe Sensitivität auf. Da jedoch nicht jede Klinik bzw. jedes Labor Zugang zu Massenspektrometern hat und die Kosten deutlich über denen anderer Verfahren liegen, stellen Methoden mit Fluoreszenz- oder UV-Detektion häufig geeignetere Alternativen für die klinische Routine dar. Ziel dieser Arbeit war die Entwicklung einer schnellen und einfachen Methode zur Bestimmung von Posaconazol aus humanem Serum. Durch die Anwendung paralleler Säulenschaltungstechnik sollte eine direkte Injektion der Serumproben ermöglicht und auf komplexe Schritte zur Probenvorbereitung und den Gebrauch eines internen Standards verzichtet werden.

69 Analytik Posaconazol Methodik Ausgangsstoffe und Lösungsmittel Posaconazol-Reinsubstanz wurde erhalten von der Chemical Research Division des Schering-Plough Research Institute (Kenilworth, NJ, USA). Acetonitril und Ameisensäure wurden in einem für HPLC- und MS-Messungen geeigneten Reinheitsgrad käuflich erworben und ohne weitere Reinigungsschritte eingesetzt. Deminarilisiertes Wasser wurde mittels eines Milli-Q-Wasseraufbereitungssystems der Firma Millipore hergestellt. Posaconazol-freies Leerserum wurde von stationären Patienten der Abteilung Hämatologie & Onkologie des Universitätsklinikums Freiburg erhalten Kalibration Die Posaconazol-Stammlösung wurde in einer Konzentration von 100 mg/l unter Verwendung einer wässrigen Ameisensäure-Lösung (1,5%) hergestellt. Posaconazol- Reinsubstanz zur Herstellung der Stammlösung wurde dabei auf einer Analysenwaage SBC 21 der Firma Scaltec Instruments abgewogen. Ein Auflösen der Posaconazol- Reinsubstanz in Wasser war aufgrund der gegenüber Fluconazol und Voriconazol erhöhten Lipophilie nicht möglich. Die Posaconazol-Standards (100, 250, 500, 1000, 2500 und 5000 μg/l) wurden bis zum Zeitpunkt der Analyse bei -20 C gelagert Patientenproben Die vermessenen Blutproben stammten von stationären Patienten der Abteilung Hämatologie & Onkologie des Universitätsklinikums Freiburg, die Posaconazol aus therapeutischer oder prophylaktischer Indikation erhielten. Aus diesem Grund konnten die Ergebnisse der Blutspiegel-Bestimmungen auch unmittelbar für Dosisanpassungen des Medikaments genutzt werden. Die Proben wurden zur Bestimmung der morgendlichen Talspiegel vor Einnahme der ersten Einzeldosis genommen. Zum Erhalt des reinen Blutserum wurden die Proben für 10 Minuten bei 5000 g mit einem Gerät des Typs Universal 32 R (Firma Hettich Zentrifugen) zentrifugiert. Dem

70 Analytik Posaconazol 60 Studiendesign wurde seitens der Ethikkommission der Universität Freiburg zugestimmt.

71 Analytik Posaconazol HPLC: Einfache Säulenschaltung Die Analysen wurden mit einem HPLC-System der Firma Shimadzu durchgeführt, welches aus vier Pumpen (LC-10AT), zwei Säulenschaltventilen (FCV-12AH), einem COM-Modul (CBM-10A), einem Autosampler (SIL-10ADVP) und einem Degaser (Uniflow Degasys DG 1310, VDS Optilab) besteht. Der Säulenofen (CTO-10AC) wurde auf eine konstante Temperatur von 40 C eingestellt. Abbildung 26A zeigt die Konfiguration des HPLC-Systems zu Beginn der Analyse. Abbildung 26: Apparativer Aufbau der HPLC-Anlage zur Posaconazol-Analytik. (A) Extraktionsschritt, (B) Transferschritt.

72 Analytik Posaconazol 62 Mittels des Autosamplers und Pumpe 1A wurden 50 μl der Serumproben auf die Extraktionssäule (LiChrospher RP8-ADS, Merck) gebracht, um den Analyten von den Serumproteinen abzutrennen. Mobile Phase von Pumpe 1A war eine wässrige Ameisensäurelösung (0,1%), die mit einer Flussrate von 1 ml/min zur Extraktionssäule transportiert wurde. Posaconazol wurde auf der Säule zurückgehalten, während die Matrixbestandteile mit dem Eluenten in den Abfall gespült wurden. Nach 5 Minuten war die Matrix quantitativ von der Extraktionssäule gewaschen. Parallel hierzu wurde die analytische RP18-Säule (125/4 Nucleodur C 18ec, Macherey & Nagel) mittels der Pumpen 2A (wässrige Ameisensäurelösung 0,1%) und 2B (reines Acetonitril) im Verhältnis 55:45 (V/V) bei einer Flussrate von 1 ml/min äquilibriert. Das Hochdruckventil 2 wurde nachfolgend automatisch in die Transferposition umgeschaltet, wodurch Extraktionssäule und analytische Säule verbunden wurden (Abbildung 26B). Die mobile Phase wurde hierbei weiterhin von den Pumpen 2A und 2B im Verhältnis 55:45 geliefert. Durch die höhere Elutionskraft des Acetonitril-Anteils wurde Posaconazol innerhalb von 5 Minuten desorbiert und mit geänderter Flussrichtung und einer Flussrate von 1 ml/min von der Extraktionssäule auf die analytische Säule gespült. Der eigentliche chromatographische Trennschritt wurde mittels der analytischen Säule (mit Vorsäule 8/4 Nucleodur C 18ec ) isokratisch (55:45) bei einer Flussrate von 1 ml/min erreicht. Die Identifikation des Analyten erfolgte mittels eines Fluoreszenzdetektors (RF-10A) bei einer Anregungswellenlänge von 261 nm und einer Emissionswellenlänge von 357 nm. Zeitgleich mit der chromatographischen Trennung wurde der Autosampler mit reinem Acetonitril von Pumpe 1B bei einer Flussrate von 2 ml/min gespült. Zehn Minuten nach Beginn der Analyse wurde das Hochdruck-Ventil 2 wieder in die initiale Position zurückgeschalten (Abbildung 26A). Daraufhin wurde die Extraktionssäule mit Acetonitril von Pumpe 1B gespült (Flussrate: 2 ml/min), während gleichzeitig die chromatographische Trennung auf der analytischen Säule und die Fluoreszenzdetektion erfolgte. Die initialen Bedingungen des Messsystems waren nach 14 Minuten wiederhergestellt, die Gesamtdauer einer Analyse belief sich auf 17 Minuten.

73 Analytik Posaconazol Ergebnisse und Diskussion Selektivität Es konnten weder Störungen durch andere Arzneistoffe an der Retentionszeit von Posaconazol (11,7 Minuten) detektiert werden, noch eluierten Bestandteile des Leerserum zu diesem Zeitpunkt in nennenswertem Umfang (Abbildung 27). Abbildung 27: HPLC-Chromatogramm von (A) reinem Humanserum und (B) Humanserum mit Zusatz von 0,1 mg/l Posaconazol (POS). Signale nach 6 und 7 Minuten durch Säulenschaltung. Zur Testung der Selektivität wurden n=22 Serumproben von 8 stationären Patienten der Abteilung Hämatologie & Onkologie des Universitätsklinikums Freiburg untersucht. Diese Patienten hatten kein Posaconazol, aber eine große Bandbreite anderer Arzneistoffe erhalten, die bei hämato-onkologischen Patienten häufig eingesetzt werden. Dabei handelte es sich um Aciclovir, Clarithromycin, Cyclosporin A, Ganciclovir, Meropenem, Metoclopramid, Phenytoin, Teicoplanin, Vancomycin und Voriconazol. Trotz dieser erfolgreichen Testungen können Störungen durch andere Arzneistoffe nicht ausgeschlossen werden. Das dem Posaconazol in chemischer Hinsicht sehr ähnliche Itraconazol wurde nicht gesondert analysiert, da es am Universitätsklinikum Freiburg kaum mehr eingesetzt wird. Insbesondere werden dort keine aus mehreren Azol-Antimykotika bestehenden Kombinationstherapien durchgeführt, weswegen eine Unterscheidung der beiden Arzneistoffe in keinem Fall nötig ist.

74 Analytik Posaconazol Linearität Die Linearität der Kalibrationskurve wurde von μg/l getestet. Dabei wurden sechs Datenpunkte jeweils zehnfach vermessen. Die Methode war über den gesamten getesteten Bereich mit einem Korrelationskoeffizienten von r 2 =0,999 linear (Abbildung 28) y = x - 639,8 R 2 = 0, Peakfläche Konzentration Posaconazol (μg/l) Abbildung 28: Kalibrationskurve HPLC von Posaconazol in humanem Serum Sensitivität Die Bestimmungsgrenze der Methode wurde als die Konzentration definiert, bei der die Richtigkeit im Bereich % und die relative Standardabweichung der Präzision innerhalb 20% lag. Für die beschriebene Methode ergab sich eine Bestimmungsgrenze von 100 μg/l mit einer relativen Standardabweichung der Präzision von 6,0% und einer Richtigkeit von 83,7%. Bei geringeren Konzentrationen stellte die Richtigkeit den limitierenden Faktor dar, da diese hierbei unter 80% abfiel. Die Nachweisgrenze der Methode liegt bei 50 μg/l und war definiert als niedrigste Konzentration des Analyten, die im Chromatogramm ein mindestens dreimal so hohes Signal gegenüber dem Grundrauschen einer Leerprobe ergab.

75 Analytik Posaconazol 65 Die Steigung der Kalibriergeraden der Methode ist für den klinischen Einsatz ausreichend, da bislang gemessene therapeutische Konzentrationen zwischen 400 und 2000 μg/l lagen [125] Wiederfindung Die Kalibrationskurve von Posaconazol in humanem Serum war bei einer durchschnittliche Wiederfindungsrate von über 97% nahezu identisch mit einer Kurve, die durch Auflösen definierter Mengen des Arzneistoffs in reinem Acetonitril erhalten wurde Richtigkeit und Präzision Standards mit vier Konzentrationen des Arzneistoffs (250, 500, 1000 und 2500 μg/l) wurden zehnfach bestimmt, um Richtigkeit und Präzision der Methode zu validieren. Die genannten Konzentrationen wurden jeweils fünffach an zwei aufeinanderfolgenden Tagen vermessen. Die Richtigkeit lag zwischen 88,8 und 114,8% innerhalb eines Tages und zwischen 89,2 und 109,9% an verschiedenen Tagen. Die höchste Standardabweichung der Präzision lag bei 9,4% innerhalb eines Tages bzw. bei 9,6% an verschiedenen Tagen (Tabelle 15). Tabelle 15: Validierungsdaten der entwickelten Methode zur Posaconazol-Analytik.

76 Analytik Posaconazol 66 Die meisten Validationsdaten (u.a. Bestimmungsgrenze, durchschnittliche Wiederfindung, Präzision innerhalb eines und an verschiedenen Tagen) sind vergleichbar mit denen der Methode von Chhun et al. [132], Diese ist zwar hinsichtlich der Richtigkeit und Nachweisgrenze leicht überlegen, durch den Gebrauch eines internen Standards und die nötige Probenvorbereitung aber deutlich komplexer in der Anwendung, weswegen die hier beschriebene Methode für die tägliche klinische Praxis insgesamt die besser geeignete darstellt. Die Validierungsdaten sind zudem für den Erhalt verlässlicher Ergebnisse absolut ausreichend Methodenentwicklung: Optimierung wichtiger Schritte Durch die Injektion großer Probenvolumina können Nachweis- und Bestimmungs- Grenze analytischer Methoden erniedrigt werden. Diesem Vorteil steht die verstärkte Kontamination von Extraktionssäulen und analytischen Säulen mit Matrixkomponenten gegenüber, wodurch deren Lebensdauer erheblich reduziert wird. Bei dem im Rahmen dieser Arbeit entwickelten analytischen Verfahren wurde das Injektionsvolumen daher von initial 100 μl auf 50 μl reduziert, um Akkumulationen von Matrixresten (im Fall von Blutserum sind dies überwiegend Proteine) zu vermeiden. Bezüglich der Extraktionssäule war die Verwendung von Säulenpackmaterialien mit ausreichend guter Fähigkeit zur Zurückhaltung des Analyten und damit der Trennung desselben von den Matrixbestandteilen nötig. Aus diesem Grunde wurde eine LiChrospher RP8-ADS-Säule verwendet, die die direkte und wiederholte Injektion unbehandelter Serumproben ermöglicht [135,136]. Durch die Abtrennung der Serumproteine mittels der Extraktionssäule war die Beeinträchtigung der analytischen Säule durch Matrixbestandteile gering. Im Rahmen dieser Arbeit wurde eine analytische Säule für mehr als 200 Messungen verwendet, ohne dass es zu Änderungen der Trennleistung oder der Peakhöhe kam. Die verwendete Extraktionssäule ist mit im Durchmesser 25 μm großen sphärischen Kieselgelpartikeln gefüllt, die zwei chemisch unterschiedliche Oberflächen besitzen. Die chemisch inerte äußere Oberfläche enthält hydrophile elektroneutrale Diolgruppen (ADS = alkyl diol silica) und schützt die Säule so vor unerwünschter Kontamination mit Proteinen und anderen makromolekularen Probenbestandteilen (z.b. Nukleinsäuren, Polysacchariden). Die innere Oberfläche der porösen Partikel ist mit einer hydrophoben Dispersionsphase (C 8 -Alkylketten) überzogen, die eine adsorptive

77 Analytik Posaconazol 67 stationäre Phase für die Extraktion apolarer Analyten darstellt. Aufgrund des Porendurchmessers von 6 nm ist die Dispersionsphase dem niedermolekularen Analyten, nicht jedoch Serumproteinen oder anderen Probenbestandteilen mit einem Molekulargewicht größer Dalton zugänglich (Abbildung 29, [137]). Es liegt hier also strenggenommen eine Kombination mehrerer chromatographischer Prinzipien vor, da neben der Umkehrphasen-Verteilungschromatographie auch Größenausschluss und Adsorption zur Trennung der Probenbestandteile beitragen. Abbildung 29: Packmaterial der Extraktionssäule. Im Inneren der porösen Partikel sind die Alkylketten, an die Posaconazol adsorbiert, schematisch widergegeben (aus [137]). Weiterer Vorteil der LiChrospher -Säule war eine erhöhte Retentionskapazität gegenüber anderen Extraktionssäulen (z.b. Eurospher ), wodurch Überladungen und Arzneistoffdurchbrüche erst bei sehr hohen Konzentrationen des Analyten auftraten. Zur Optimierung des Waschschritts der Extraktionssäule wurden verschiedene Lösungsmittel getestet. So wurden u.a. unterschiedlich stark konzentrierte wässrige Lösungen von Ameisensäure (0,05-0,5%) sowie Mischungen von wässriger Ameisensäurelösung 0,1% mit Acetonitril angewendet, wobei der Anteil des Acetonitrils von 0-50% variiert wurde. Außerdem wurden verschiedene Flussraten des Lösungsmittels (0,5-3 ml/min) getestet. Eine höhere Flussrate und die Zugabe von Acetonitril zum Lösungsmittel führten zu einer unvollständigen Retention des Analyten auf der Extraktionssäule, wohingegen eine Variation der Ameisensäure-Konzentration nur zu einem teilweisen Ausspülen der Serummatrix führte.