Bewertung des sensibilisierenden Potenzials von Stoffen in Kosmetika und Bedarfsgegenständen

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1 Bundesgesundheitsbl : DOI /s Online publiziert: 25. Februar 2012 Springer-Verlag 2012 M. Peiser T. Platzek A. Luch Abteilung Sicherheit von verbrauchernahen Produkten, Bundesinstitut für Risikobewertung (BfR), Berlin Bewertung des sensibilisierenden Potenzials von Stoffen in Kosmetika und Bedarfsgegenständen Wie werden Inhaltsstoffe von Kosmetika und Bedarfsgegenständen heute und morgen in Europa getestet? Im vorliegenden Beitrag wird dargestellt, wie die Bewertung eines sensibilisierenden Potenzials von Stoffen heute in der EU erfolgt. Es werden die Produktgruppen Kosmetika und Bedarfsgegenstände und die Regulation über entsprechende Richtlinien und Verordnungen kurz vorgestellt. Neue Erkenntnisse aus der immunologischen Grundlagenforschung wie die Beschreibung der Rolle von Toll-Rezeptoren, Inflammasomen und T-Helfer-17- Zellen geben ein immer deutlicheres Bild über die Mechanismen der Kontaktallergie. Es wird gezeigt, welche OECD-Testmethoden über Tierversuche in der Vergangenheit für eine Risikobewertung verbindlich waren und welche neuen Entwicklungen es bei den Alternativmethoden gibt. Schließlich wird anhand des Beispiels Nickel in Spielzeug der Ablauf einer Risikobewertung für Substanzen mit sensibilisierendem Potenzial in Verbraucherprodukten erläutert. Kosmetika und Bedarfsgegenstände Neben saisonal auftretenden Beschwerden bei Allergien auf Blütenpollen und Einschränkungen bei der Wahl von Lebensmitteln aufgrund von Nahrungsmittelallergien zählen Allergien auf chemische Bestandteile von kosmetischen Mitteln und verbrauchernahen Produk ten zu den gesamtgesellschaftlich relevanten gesundheitlichen Problemen. Um einen deklarierten Effekt, wie zum Beispiel Sonnenschutz, zu erzielen, werden Kosmetika direkt auf die Haut aufgetragen (direkte Hautexposition). Insbesondere bei sogenannten Leave-on-Produkten verbleibt die Formulierung inklusive möglicher allergener Inhaltsstoffe danach für längere Zeit auf der Haut. Über einen möglichen Kontakt der Inhaltsstoffe mit epidermalen Immunzellen ergibt sich damit immer auch das potenzielle Risiko einer allergischen Reaktion. Im Lebensmittel-, Bedarfsgegenstände- und Futtermittelgesetzbuch (LFGB) werden Kosmetika und Bedarfsgegenstände als Produktgruppen definiert. Demnach sind Kosmetische Mittel ( ) Stoffe oder Zubereitungen aus Stoffen, die ausschließlich oder überwiegend dazu bestimmt sind, äußerlich am Körper des Menschen oder in seiner Mundhöhle zur Reinigung, zum Schutz, zur Erhaltung eines guten Zustandes, zur Parfümierung, zur Veränderung des Aussehens oder dazu angewendet zu werden, den Körpergeruch zu beeinflussen [1]. Dazu zählen unter anderem Sonnenschutzmittel, Hautcremes, Parfüms, Haarfärbemittel und Zahnpflegemittel. Die hinsichtlich des Auftretens von allergischen Hautreaktionen in der Bevölkerung nicht minder bedeutsamen Tätowiermittel wurden kürzlich den kosmetischen Mitteln gleichgestellt [1]. Duftstoffe werden in kosmetischen Mitteln, aber auch in Spielzeug für Kinder und in anderen verbrauchernahen Produkten zunehmend verbreitet eingesetzt. Darunter können sich auch Substanzen beziehungsweise Substanzgemische befinden, die auf der Haut sensibilisierend wirken. In kosmetischen Mitteln müssen 26 allergene Duftstoffe wie Eichenmoos, Isoeugenol, Hydroxycitronellal und andere laut Kosmetikverordnung auf dem Produkt deklariert sein, wenn sie in Leave on-produkten die Konzentration von 0,001% und in Rinse-off-Produkten die Konzentration von 0,01% überschreiten. Andererseits wird über die Spielzeug- Richtlinie 2009/48/EC geregelt, dass im Spielzeug nur technisch unvermeidbare Spuren von 55 potenziell allergenen Duftstoffen enthalten sein dürfen; hierbei liegt der Grenzwert bei 100 mg/kg (100 ppm) [2]. Weitere elf Duftstoffe sind als Zusatz im Spielzeug zugelassen, müssen aber bei Überschreitung dieses Grenzwerts deklariert werden. In. Tab. 1 sind wichtige allergene Substanzen, die in Kosmetika und Bedarfsgegenständen vorkommen können, zusammengefasst. In der Kosmetik-Verordnung ist auch geregelt, welche Inhaltsstoffe nicht (Negativliste, Anhang II) oder nur bis zu bestimmten Höchstkonzentrationen (Anhang III) in kosmetischen Produkten enthalten sein dürfen, die innerhalb der Europäischen Mitgliedsstaaten vermarktet werden [3]. Jeweils einzeln zur Verwendung in Kosmetika zugelassen und damit auch hinsichtlich eines möglichen sensibilisierenden Potenzials als akzep 373

2 Tab. 1 Wichtige allergene Substanzen in kosmetischen Produkten und Bedarfsgegenständen. Nicht aufgeführt sind starke Allergene, die nicht mehr in Produkten auf dem deutschen Markt eingesetzt werden Allergene in Kosmetika und Bedarfsgegenständen, Beispiele relevanter Substanzen Allergenquelle Produkte Substanzklasse Allergene Substanz Zulässige Konzentration Kosmetika Diverse Duftstoffe Eichenmoos 0,001% in Leave-on- Produkten Duftstoffe Isoeugenol 0,01% in Rinse-off- Produkten Duftstoffe Zimtaldehyd Deklarationspflichtig Haarfärbemittel Bleichmittel Kaltwellpräparate Nicht reguliert, bis 60% im Produkt Nicht reguliert Tätowiermittel Tätowierfarben Farbstoffe p-phenylendiamin Nicht zugelassen Black Henna Farbstoffe p-phenylendiamin Nicht zugelassen Schmuck Lederwaren Diverse Friseurchemikalien Farbstoffe p-phenylendiamin 2% Farbstoffe p-toluylendiamin 4% Konservierungsstoffe MCI/MI a 0,01 Ammoniumpersulfat Glycerylmonothioglykolat Ohrstecker, Piercings Arbeitshandschuhe Textilfarben Diverse Dispersionsfarbstoffe Dispersionsfarbstoffe Gummiwaren Luftballons, Spielzeug Metallionen Nickel 0,5 µg/cm 2 /Woche Freisetzung Gerbstoffe Chrom (VI) Nicht nachweisbar b Blue 106 Blue 124 Vulkanisationsbeschleuniger 2-Mercaptobenzothiazol a Methylchloroisothiazolinon (und) Methylisothiazolinon. b Mit Analyseverfahren 64 (1) LFGB. Nicht anmelde-/zulassungspflichtig Nicht anmelde-/zulassungspflichtig Technisch möglich zu minimieren tabel eingestuft sind bestimmte Farbstoffe, Konservierungsstoffe und UV-Filter (Positivlisten der Anhänge IV VI). Diese Anhangslisten der Kosmetik-Verordnung reflektieren den Sachstand aus entsprechenden regulatorischen Bewertungen und damit den jeweiligen Wissensstand aus der toxikologischen und allergologischen Fachliteratur. Im Unterschied zu den klinischen Studien bei der Zulassung von neuen Arzneimitteln sind für die Erstellung sogenannter Dossiers zu einzelnen Inhaltsstoffen kosmetischer Mittel Tests am Menschen aus ethischen Gründen in der EU allerdings nicht zulässig. Bei neuen, gesicherten Erkenntnissen und gut dokumentierten Daten können sich auch neue Bewertungen einzelner Substanzen ergeben. Solche Bewertungen werden in Stellungnahmen (Opin ions) des Europäischen Wissenschaftlichen Kommitees Verbrauchersicherheit (SCCS) erarbeitet und der EU-Kommission zur Verfügung gestellt. In Deutschland wird die zuständige Behörde, das Bundesinstitut für Risikobewertung (BfR), deren nationale Experten in diesen Gremien mitarbeiten, durch die Mitglieder der Kosmetik-Kommission aus Universitäten, dermatologischen Kliniken, Verbänden und Industrie beraten. Bedarfsgegenstände sind als Produktgruppe sehr heterogen. Nach dem LFGB zählen dazu Gegenstände, die mit Lebensmitteln in Kontakt kommen (Teller, Tassen, Besteck, Verpackungsmaterial etc.), Verpackungen, die bei der Herstellung von kosmetischen Mitteln mit diesen in Berührung kommen, Bekleidungstextilien, Spielwaren, Haushaltsreiniger, Raumbedufter und vieles andere mehr. Um den gesundheitlichen Schutz der Verbraucher zu gewährleisten, müssen diese Produkte bestimmten Anforderungen entsprechen. Bei bestimmungsgemäßem Gebrauch darf von ihnen keine Gefahr für die Gesundheit des Verbrauchers ausgehen. In der Bedarfsgegenständeverordnung werden Beschränkungen, zugelassene Höchstkonzentrationen und Untersuchungsverfahren explizit geregelt [4]. Bei Produkten liegt generell die Nachweispflicht der Unbedenklichkeit auch hinsichtlich eines allergenen Potenzials beim Hersteller. Mechanismen der Kontaktallergie Die allergische Kontaktdermatitis äußert sich klinisch als Ekzem mit Rötung (Erythem), Schwellung (Ödem), Knötchen- (Papeln) und Bläschenbildung (Vesikel). Auslöser hierfür ist eine sogenannte Hypersensibilitätsreaktion vom verzögerten Typ (Typ IV). Im Unterschied zum irritativen Kontaktekzem liegen hier entzündliche Reaktionen von Zellen des adaptiven Immunsystems vor, die von Zytokinbotenstoffen unterstützt und vermittelt werden. Anders als bei sogenannten Soforttypreaktionen (Typ I) kommt es nach wiederholtem Hautkontakt mit einem Kontaktallergen bei der allergischen Kontaktdermatitis zur T-Zell-getriggerten Initiation entzündlicher Prozesse ohne wesentliche Beteiligung von Mast- und B- Zellen [5]. Chemikalien allein induzieren selten eine solche Allergieform und müssen in der Haut in der Regel zunächst an Proteine gebunden werden, um als Vollantigen wirken zu können. Entsprechend werden sie auch als Haptene (inkomplette Antigene) bezeichnet. So binden beispielsweise Nickel und Bestandteile von Haarfärbemitteln wie para-phenylendiamin (PPD) an humanes Serumalbumin in der Haut und induzieren erst danach die typischen, spezifischen T-Zell-Antworten [6, 7]. Andere chemische Allergene, zum Beispiel Duftstoffe wie D-Limonen, liegen im Produkt als sogenannte Prähaptene vor und werden erst durch Spontanoxidation an der Luft (Autoxidation) in eine aktivierte und allergene Form überführt [8]. Während der Penetration der oberen Epidermisschichten der Haut treffen Kontaktallergene auf Keratinozyten unterschiedlicher Differenzierungsstufen. Von einigen Kontaktallergenen ist bekannt, dass sie vermittelt über das sogenannte Inflammasom (einem zytoplasmatischen Multienzymkomplex in Keratinozyten, Makrophagen und neutrophilen 374 Bundesgesundheitsblatt - Gesundheitsforschung - Gesundheitsschutz

3 Zusammenfassung Abstract Bundesgesundheitsbl : Springer-Verlag 2012 DOI /s M. Peiser T. Platzek A. Luch Bewertung des sensibilisierenden Potenzials von Stoffen in Kosmetika und Bedarfsgegenständen. Wie werden Inhaltsstoffe von Kosmetika und Bedarfsgegenständen heute und morgen in Europa getestet? Zusammenfassung Kosmetika und bestimmte Bedarfsgegenstände werden vom Verbraucher direkt auf die Haut aufgetragen beziehungsweise unter direktem Hautkontakt benutzt. Cremes verbleiben auf der Haut, die Haare werden mehrfach im Jahr gefärbt, Nickelionen können aus Ohrsteckern und Piercings an Arealen von Hautverletzungen oder aus Spielzeug auf der empfindlichen Haut von Kindern freigesetzt werden. Entsprechend hoch ist das Risiko, eine Kontaktallergie zu entwickeln. Darüber hinaus können durch täglichen Umgang und wiederholten Kontakt mit bestimmten Kosmetika und Bedarfsgegenständen bei bestehender Sensibilisierung Kontaktekzeme immer wieder neu ausgelöst werden. Eine Kontaktallergie ist nicht heilbar. Für die Bewertung des allergenen Potenzials einer Substanz standen in der Vergangenheit ausschließlich tierexperimentelle Methoden zur Verfügung. Allerdings schreibt die Kosmetik-Richtlinie 76/768/EWG mit der 7. Änderung von 2003 für Bestandteile von Kosmetika ein Testverbot und ab 2013 auch ein generelles Vermarktungsverbot vor. Damit stehen de facto zurzeit weder Tierversuche noch validierte Alternativmethoden für die präventive Testung des Endpunkts Sensibilisierung zur Verfügung. Dieser Zustand könnte ein Hindernis bei der Entwicklung innovativer Kosmetikprodukte mit neuen, möglicherweise für den Verbraucher verträglicheren Inhaltsstoffen darstellen. Daher wird die Entwicklung und Validierung von Alternativmethoden für den Endpunkt Sensibilisierung/ Al lergenität von Chemikalien für die Industrie und regulatorische Behörden gleichermaßen als eine der großen Herausforderungen der kommenden Jahre angesehen. Schlüsselwörter Kosmetika Bedarfsgegenstände Allergische Kontaktdermatitis Lokaler Lymphknotentest Alternativmethoden zur Sensibilisierung Assessment of the sensitizing potency of cosmetic ingredients and commodities. How will the ingredients of cosmetics and commodities be tested in Europe today and tomorrow? Abstract Cosmetics and certain commodities are applied or used by consumers directly on the skin. Creams may remain on the skin for longer periods, hair is dyed multiple times per year, nickel ions can be released from studs and piercings in areas of skin damage or migrate from toy materials into the skin of children. Accordingly, using or handling such products always entails a risk for developing a contact allergy. Moreover, daily usage and repeated contacts to certain cosmetics and commodities might lead to repeated elicitation of contact eczema in people already sensitized against allergenic ingredients. Unfortunately, contact allergy is not curable. For the assessment of the allergenic potential of chemicals, only testing based on animal experiments was available in the past. In 2003, the 7 th amendment of the Cosmetics Directive 76/768/EWG laid down a ban on animal testing of cosmetic ingredients and from 2013 a general marketing ban of such products as well. Therefore, the development and validation of non-animal methods for assessing the toxicological endpoint sensitization/ allergenic potency of chemicals is a major task for the years ahead and remains equally a challenge for industry and regulatory agencies. Keywords Cosmetics Commodities Allergic contact dermatitis Local lymph node assay Alternative methods for sensitization Granulozyten) durch Freisetzung von IL-1β und IL-18 bereits entscheidend zur allergischen Antwort beitragen [9]. Diese Kontaktallergene bilden damit neben ihrem eigentlichen antigenen Signal auch noch ein intrinsisches Gefahrensignal. Diesen neuen Erkenntnissen zufolge wurde postuliert, dass bei einer voll ausgeprägten allergischen Reaktion zwei voneinander unabhängige Signalwege induziert werden müssen: die Beladung des Haupt- Histokompatibilitätskomplexes (Major Histocompatibility Complex, MHC) von dendritischen Zellen mit allergenen Peptidfragmenten und dessen anschließende Präsentation an der Zelloberfläche sowie die Aktivierung membranständiger, sogenannter Pathogen-Erkennungsrezeptoren (Pathogen Recognition Receptors, PRRs). Allerdings sind bisher nur für wenige Kontaktallergene, wie zum Beispiel Nickel, das zusätzlich den PRR Toll-like- Rezeptor (TLR) 4 beim Menschen, aber nicht bei der Maus aktiviert, solche parallelen Signaltransduktionswege nachgewiesen [10]. Oft uneindeutig benutzt werden bei Beschreibung der beiden Phasen einer Kontaktallergie die Begriffe Sensibilisierung und Auslösung. Sukzessive werden bei einer Kontaktallergie Entzündungsmediatoren aus Keratinozyten freigesetzt, dendritische Zellen reifen aus und migrieren zu lokalen Lymphknoten, wo sie allergenspezifische T-Zellen, sogenannte Killerzellen (zytotoxische T-Zellen) vom Typ Tc1 oder Tc17 beziehungsweise Helferzellen vom Typ Th1 oder Th17, zur Differenzierung und Zellteilung anregen [11]. Alle diese Prozesse laufen in der menschlichen Haut nach Erstkontakt mit einem Kontaktallergen innerhalb der ersten 10 bis 15 Tage ab. Klassischerweise verläuft diese sogenannte Sensibilisierungsphase klinisch symptomfrei. Wichtig in diesem Zusammenhang sind auch Erkenntnisse über bestimmte Botenstoffe (Zytokine), die bei kontaktallergischen Reaktionen in spezifischen Mustern aus T-Zellen freigesetzt werden. Ähnlich wie bei der Psoriasis und dem atopischen Ekzem wurden die Zytokine IFN-γ, IL-17, IL-22 und auch IL-4 in T-Zellen in Patienten nachgewiesen, die unter einer allergischen Kontaktdermatitis leiden [12]. Dieses Grundlagenwissen zur Markerexpression und Zytokinfreisetzung schafft die Voraussetzung für die Entwicklung entsprechender In-vitro-Testsysteme, die sich der Messung solcher Mediatoren bedienen und sie als relevante Endpunkte einer Sensibilisierungsreaktion einsetzen. Bei wiederholtem Kontakt mit dem gleichen Kontaktallergen erscheinen in 375

4 Tab. 2 In Deutschland verbindliche OECD-Testmethoden mit Versuchstieraufwand pro Testsubstanz und Zeitangabe der Gültigkeit (GPMT und Buehler, OECD TG406; LLNA, OECD TG429). Bis 2011 war keine Alternativmethode validiert und als OECD-Richtlinie akzeptiert. Viele Methoden sind in der Entwicklungsphase, einige Methoden in Prävalidierung OECD-Testverfahren zum Endpunkt Sensibilisierung Testmethode Testsystem Für Industrie verbindlich LLNA a Maus Zurzeit (15 Tiere) GPMT b Meerschweinchen (Zurzeit) (10 20 Tiere) Bühler Meerschweinchen (Zurzeit) (20 Tiere) Alternativmethoden In-vitro In-silico In-chemico Ab 2013 a Lokaler Lymphknotentest. b Meerschweinchen-Maximisierungstest. der auf die Sensibilisierungsphase folgenden, sogenannten Auslösephase (Elizitationsphase) nach 24 bis 72 Stunden die oben genannten klinischen Symptome. Dabei wird heute angenommen, dass die Hautläsionen durch allergenspezifische zytotoxische T-Zellen verursacht werden, die in der Haut residieren und Membranporen-bildende und zelllysierende Proteine (Perforin, Granzym B etc.) freisetzen können [13]. Nach einigen Tagen einer mehr oder weniger ausgeprägten Entzündungsreaktion wirken schließlich sogenannte regulatorische T-Zellen den genannten Prozessen entgegen und limitieren im günstigsten Fall die Ausprägung des Kontaktekzems [5]. OECD-Testsysteme zum Nachweis eines allergenen Potenzials: Buehler und GPMT Seit nun über 40 Jahren werden in der Testung von Chemikalien auf den Endpunkt Sensibilisierung die Meerschweinchentests nach Magnusson-Kligman (Guinea Pig Maximization Test, GPMT) [14] und der Test nach Buehler [15] in der Risikobewertung eingesetzt (. Tab. 2). Beim Buehler-Test wird wiederholt unter einem Pflaster (okklusiv) eine Substanz auf die rasierte Haut des Tieres aufgetragen und nach vier Wochen mit der gleichen Substanz ausgelöst. Im Unterschied dazu wird die Testsubstanz beim GPMT zusammen mit komplettem Freundschen Adjuvans intradermal injiziert, nach einer Woche okklusiv induziert und nach drei weiteren Wochen ebenfalls okklusiv ausgelöst. Lokale Hautreaktionen werden optisch abgelesen und mit einem Score von 0 bis 3 entsprechend der Schwere der Rötung und Schwellung bewertet. Nach Sensibilisierungsraten werden die Grade I bis V den Klassifizierungen schwach bis extrem zugeordnet. Bei einer Sensibilisierungsrate 15% im Buehler-Test und 30% im GPMT erfolgt gemäß der Verordnung (EG) Nr. 1272/2008 (über die Einstufung, Kennzeichnung und Verpackung von Stoffen und Gemischen) eine Klassifizierung als hautsensibilisierend, und der Gefahrenhinweis R43: Sensibilisierung durch Hautkontakt möglich wird für die Testsubstanz verbindlich [16]. Diese Tests geben damit eine wichtige Information über die Stärke der Sensibilisierung und Auslösung, nicht aber über die Dosis-Wirkungsbeziehung zwischen Chemikalie und pathologischer Hautreaktion. Mit beiden Testmethoden existiert darüber hinaus eine lange Erfahrung und damit eine große historische Datenbasis, auf die bei Bedarf zurückgegriffen werden kann. Allerdings sind beide Verfahren als sehr belastende Tierversuche einzustufen; die Durchführung ist sehr zeitintensiv, und es ergeben sich keine objektiven Messparameter für die Quantifizierung der allergischen Reaktion. OECD-Testsysteme zum Nachweis eines allergenen Potenzials: LLNA Primärer und regulatorisch verbindlicher Test für den Endpunkt Sensibilisierung in den Mitgliedsstaaten der OECD ist seit 2002 der Lokale Lymphknotentest (Local Lymph Node Assay, LLNA) [17]. Bei diesem Versuch in der Maus handelt sich um eine alternative Methode im Sinn des sogenannten 3R-Prinzips von Russel und Burch (Replacement, Reduction and Refinement) [18], da die Anzahl der Versuchstiere reduziert (reduction) und der Test im Vergleich zu den Meerschweinchentests mit einer geringeren Belastung (refinement) der Tiere verbunden ist. Beim LLNA wird Mäusen, vorzugsweise vom Stamm CBA/J, an drei Tagen auf dem Hinterohr eine potenziell sensibilisierende Substanz appliziert, nach sechs Tagen ein radioaktiver Marker in die Schwanzvene injiziert und der Einbau von 3 H-Thymidin in Lymphknotenzellen im Szintillationszähler gemessen. Mit dem LLNA-DA und dem LLNA- BrdU-ELISA stehen für die Bewertung seit Kurzem auch zwei nicht-radioaktive Varianten des Tests zur Verfügung. Anders als bei den Meerschweinchentests liefert der LLNA Informationen zur Dosis-Wirkungsbeziehung, da das sensibilisierende Potenzial als Lymphozytenproliferation über verschiedene Konzentrationsstufen der entsprechenden Chemikalie bestimmt werden kann. Dies ist für die Risikobewertung der Substanz und die Ableitung von Schwellenwerten von großer Bedeutung. Minimalanforderung im LLNA ist die Testung von drei Konzentrationsstufen mit je fünf Versuchstieren. Die Absolutwerte der gemessenen radioaktiven Zerfälle (counts) werden in einen Stimulationsindex umgerechnet. Nach Auftragung dieses Stimulationsindex gegen die Testsubstanzkonzentrationen ist ein EC3-Wert ermittelbar, der die Konzentration (Angabe in Prozent) repräsentiert, die benötigt wird, um eine dreifache Zunahme des Stimulationsindex gegenüber einer Vehikelkontrolle zu induzieren. Auf dieser Basis lassen sich individuelle EC3- Werte für verschiedene Substanzen objektiv ermitteln, miteinander vergleichen und die Chemikalien klassifizieren. Eine Klassifizierung des Testentwicklers ordnet den EC3-Werten von < 0,1% bis > 100% die Kategorien extrem, stark, moderat, schwach und kein Kontaktallergen zu [19]. In der Folge wurde für regulatorische Zwecke ein Klassifizierungssystem in die Kategorien extrem (EC3 < 0,2%), stark 376 Bundesgesundheitsblatt - Gesundheitsforschung - Gesundheitsschutz

5 (EC3 0,2 2%) und mäßig (> 2%) vorgeschlagen [20, 21]. Eine solche Klassifizierung im LLNA dient zusammen mit klinischen Humandaten aus der allergologischen Testung vielfach als Grundlage für die Risikobewertung einer Substanz hinsichtlich ihres allergenen Potenzials. In den letzten Jahren wurde in einigen Fällen über falsch-positive Ergebnisse für Substanzen wie ungesättigte Fettsäuren [22] und Tenside (unveröffentlichte Industriedaten) berichtet. Im LLNA waren diese Substanzen positiv, im Buehler, GPMT und humanen Epikutantest dagegen negativ. Bemerkenswert ist darüber hinaus, dass der LLNA wegen der Speziesunterschiede zwischen Maus und Mensch (siehe oben) das stärkste Kontaktallergen Nickel nicht korrekt als positiv detektieren kann [23]. Epidemiologische, klinische Studien zur Prävalenz von Kontaktallergien In klinischen Studien werden Entwicklungen der Prävalenzen von einzelnen Kontaktallergien in bestimmten Berufsund Altersgruppen untersucht. Dafür werden Epikutantests an Patienten, selten auch an Personengruppen ohne positive Allergieanamnese beziehungsweise ärztliche Indikation durchgeführt. Die Auswahl der Testallergene aus Standardreihen erfolgt nach ausführlicher Anam nese und bei einem bestimmten Verdacht auf kontaktallergische Reaktionen und Berufsdermatosen. Der Epikutantest weist eine bereits vorhandene Sensibilisierung durch Provokation einer Auslösungsreaktion nach, das Ablesen der Ergebnisse erfolgt an den Tagen 2, 3 oder 4. Er wird in den Kliniken entsprechend den Leitlinien der Deutschen Kontaktallergiegruppe (DKG) durchgeführt. Das Ergebnis wird als negativ, fraglich, (+) bis (+ + +) = allergisch und irritativ dokumentiert. In Österreich, der Schweiz und in Deutschland ist für die zentrale Erfassung der Epikutantestdaten der Informationsverbund dermatologischer Kliniken (IVDK) in Göttingen zuständig. Die Ergebnisse werden als sogenannte Hitlisten für Kontaktallergene insgesamt oder für einzelne Substanzklassen wie Duftstoffe publiziert und mit den Daten aus anderen Studien auf internationaler Ebene verglichen. Angemerkt wird an dieser Stelle, dass in der EU die Erfassung von schweren, unerwünschten Nebenwirkungen durch Kosmetika in Artikel 23 der Neufassung der Kosmetikverordnung vorgesehen ist. So wird zurzeit das Meldesystem SUE aufgebaut, das den Informationsaustausch über Fälle solcher Reaktionen einschließlich kontaktallergischer Reaktionen zwischen verantwortlichen Personen, Herstellern, nationalen und EU-Behörden gewährleistet. Auch wäre eine epidemiologische, präventiv wirkende Überwachung der Entwicklung von Sensibilisierungsraten bei Kontaktallergien, möglichst flächendeckend in den EU-Ländern, im Sinne des Verbraucherschutzes äußerst wünschenswert. Nicht unerwähnt bleiben sollte, dass in Deutschland eine regulatorisch motivierte Substanztestung am Menschen aus ethischen Gründen nicht zulässig ist, da bei starken Allergenen eine iatrogene Sensibilisierung via Epikutantestung erfolgen könnte. Aus diesem Grund findet sich das para- Phenylendi amin (PPD) auch nicht mehr in der Standardreihe der DKG. In neueren Multicenterstudien konnten auch späte Reaktionen auf PPD unterhalb der für Haarfarben zulässigen Konzentration von 2% beobachtet werden [24]. Risikobewertung von Substanzen mit sensibilisierendem Potenzial: Nickel in Spielzeug Zur Bewertung eines allergenen Potenzials von Inhaltsstoffen aus Kosmetika und Bedarfsgegenständen werden Daten aus Tierversuchen und aus klinischen Studien herangezogen und berücksichtigt. Das sich für den Verbraucher ergebende Risiko hängt dabei einerseits von der sensibilisierenden Potenz der Substanz (Stärke des Allergens) ab, andererseits aber auch von der Verbreitung dieser Verbindung in den vermarkteten Produkten. So besitzen zwar einige Konservierungsstoffe eine hohe allergene Potenz, werden jedoch nicht mehr in den auf dem Markt verfügbaren Produkten eingesetzt. Ohne entsprechende Exposition ergibt sich für den Verbraucher folglich auch kein Risiko. Die gesundheitliche Bewertung von Nickel in Spielzeug liefert ein anschauliches Beispiel dafür, wie die Risikobewertung von Inhaltsstoffen aus Bedarfsgegenständen durchgeführt wird [25]. Aus aktuellen internationalen Studien lassen sich Sensibilisierungsraten nach Alter und Geschlecht aufgeschlüsselt ermitteln. Diese Daten zeigen, dass Nickel für den größten Teil der Kontaktallergien, die durch verbrauchernahe Produkte in der Allgemeinbevölkerung ausgelöst werden, verantwortlich ist. Die Sensibilisierungsraten aus Epikutantests sind Grundlage für die Ermittlung eines Gefährdungspotenzials. Bei der Darstellung der Exposition gegenüber Nickel ist die Vielzahl der Produkte zu berücksichtigen, mit denen der Verbraucher Kontakt haben kann. Als relevante Expositionsquellen für Nickel sind Modeschmuck, Ohrstecker und Piercings, Knöpfe, Münzen und Kinderspielzeug zu nennen. Bei Ohrsteckern und Piercings liegt wegen des möglichen Blutkontakts und offener Wunden eine andere Expositionsqualität vor als bei Hosenknöpfen, bei denen die Metallionen erst durch Körperschweiß gelöst werden und zunächst die obere, verhornte Hautbarriere überwinden müssen, um mit durchblutetem Gewebe in Kontakt zu treten. Andererseits fließen in die sogenannte Risikocharakterisierung Informationen über Klassifizierungen und Regelungen aus Verordnungen und Richtlinien mit ein. Grenzwerte und das Schutzniveau der Bevölkerung durch diese Grenzwerte werden diskutiert. Für die Nickelfreisetzung wurde in der REACH-Verordnung ein Grenzwert von 0,5 µg/cm 2 /Woche für Produkte mit direktem und längerem Hautkontakt festgelegt. Dadurch werden 70% bis 90% der bereits gegenüber Nickel sensibilisierten Personen vor einer klinisch manifesten kontaktallergischen Reaktion geschützt. Studien nach Einführung des Grenzwerts zeigen einen Rückgang der Prävalenz der Nickelallergie und demonstrieren damit die Wirksamkeit dieser regulativen Maßnahme. Anders als bei Schmuck wurde in der EU-Spielzeugrichtlinie bisher kein Grenzwert für die Nickelfreisetzung aus Kinderspielzeug festgelegt. Aus Sicht der Autoren ist es allerdings erforderlich, dass der für Schmuck gültige Grenzwert auch für Kinderspielzeug regulatorisch ver 377

6 Tab. 3 Aktuelle In-vitro-Testmethoden, die spezifische Mechanismen bei der Sensibilisierung in vivo reflektieren, und geschätzter Zeitrahmen bis zum Eintritt in die Prävalidierungsphase entsprechend der ECVAM (European Centre for the Validation of Alternative Methods)- Kriterien. (Nach [26]) Entwicklungen von In-vitro-Assays für den Endpunkt Sensibilisierung Mechanismus Testmethode Beginn Prävalidierung (geschätzt) Haptenisierung + dermale Entzündung KC-Kulturen 0 1 Jahr Dermale Entzündung + Aktivierung DC KC: DC-Kokulturen 0 1 Jahr Dermale Entzündung 3-D-Hautmodelle Aktuell Dermale Entzündung + Aktivierung DC 3-D-Hautmodelle + DC 1 4 Jahre DC Aktivierung Aktivierungsassay DC 0 1 Jahr DC Migration Migrationsassay DC 1 4 Jahre T-Zell-Teilung Proliferationsassay 4 6 Jahre KC Keratinozyten, DC dendritische Zellen. bindlich wird, um unnötige Sensibilisierungen gegenüber diesem Metall in frühen Lebensjahren zu vermeiden. In-vitro-Messung eines allergenen Potenzials von Produkten mit neuen Inhaltsstoffen Die Richtlinie 76/768/EWG über kosmetische Mittel schreibt in einem Testverbot vor, dass Tierversuche mit kosmetischen Mitteln und deren Bestandteile oder Kombinationen von Bestandteilen schrittweise abgeschafft werden müssen [3]. Verboten wird das Inverkehrbringen kosmetischer Mittel, die entweder als Fertigerzeugnisse oder als deren Bestandteile oder Kombinationen von Bestandteilen an Tieren getestet worden sind (Vermarktungsverbot). Für Bestandteile oder Kombinationen von Bestandteilen gilt das Testverbot im Hinblick auf potenzielle allergene Eigenschaften seit dem 11. März 2009, das Vermarktungsverbot ohne Ausnahmen dann ab 11. März Entsprechend dringlich ist die Verfügbarkeit von Alternativmethoden zu den oben genannten Tierversuchen (GPMT, Buehler, LLNA). An verschiedenen Einzel institutionen, aber vor allem auch in europäischen Verbänden beziehungsweise Verbundprojekten wie COLIPA (European Cosmetics Association) und Sens-it-iv (Novel Testing Strategies for In Vitro Assessment of Allergens, 6. EU-Rahmenprogramm) werden unterschiedliche tierversuchsfreie Testsysteme für sensibilisierende Substanzen entwickelt. Einige Testsysteme haben bereits die Entwicklungsphase durchlaufen und werden momentan oder in naher Zukunft prävalidiert (. Tab. 3). In einem aktuellen Statusreport werden diese Tests den immunologischen Allergiemechanismen zugeordnet, und es wird eine Pro gnose für den Eintritt in die Prävalidierung gegeben [26]. Diese Testsysteme adressieren die sukzessiven Abläufe bei der chemischen Sensibilisierung. Die Bioverfügbarkeit in der Haut wird über die metabolische Kompetenz menschlicher Hautmodelle nachgebildet, quantitative Struktur-Aktivitäts-Beziehungen (QSAR) dienen dazu, die Verteilung und Penetration in beziehungsweise durch die Haut vorherzusagen. Als In-silico-Systeme für Haptenisierungsprozesse wurden Toxtree, QSAR, das Statistikmodell CAE SAR, das Projekt UK Defra LINK und die Ansätze DEREK und TIMES-SS entwickelt. Bereits in der Prävalidierung befindet sich der direkte Peptid-Reaktivitäts- Assay (DPRA). Einzelne mechanistische Teilschritte der Sensibilisierung werden in spezifischen Modellsystemen nachgestellt und untersucht. So werden zum Beispiel Entzündungsmediatoren und Stressantworten in den Keratinozytenzelllinien HEL- 30, NCTC2455 und HaCaT gemessen. Hierzu werden auch dreidimensionale (organotypische) Hautmodelle und aus mehreren Keratinozytenschichten bestehende rekonstituierte Humanepidermis (RHE) eingesetzt. Um die Aktivierung von dendritischen Zellen zu messen, werden kostimulatorische Moleküle, Zytokine und Chemokine der Zelllinien THP-1, U-937, MUTZ-3 und KG- 1 mit verschiedenen Methoden quantifiziert. Der U937-Skin-Sensitisation-Test (MUSST) und der Human-Cell-Line-Activation-Test (h-clat) sind bereits standardisiert und für viele Chemikalien getestet. In einem Kokulturmodell aus Keratinozyten und dendritischen Zellen (Loo se-fit-coculture-based-sensitisation- Assay, LCSA) konnte eine Korrelation zu der beim LLNA eingeführten Klassifizierung erzielt werden (siehe oben). In Migrationsmodellen mit dendritischen Zellen wird die allergenabhängige Wanderung dieser Zellen als Antwort auf die Chemokinfreisetzung gemessen. In Kokulturen von allergenstimulierten dendritischen Zellen und T-Zellen werden schließlich T-Zell-Zytokine, Transkriptionsfaktoren und die T-Zell-Teilung als Endpunkte für Sensibilisierungsreaktionen gemessen. Insgesamt bleibt für die oben skizzierten In-silico- und In-vitro-Modelle der chemischen Sensibilisierung festzuhalten, dass ihre Entwicklung, verglichen mit anderen toxikologischen Endpunkten, technisch bereits weit fortgeschritten ist. Dennoch wird es voraussichtlich noch mehrere Jahre dauern, bis die Tierversuche mit Mäusen und Meerschweinchen komplett ersetzt werden können. Eher als mit einzelnen Assays/Verfahren wird es mit komplexen Test-Batterien, bestehend aus mehreren verschiedenen Assays und Methoden, gelingen, dieses wichtige Ziel in absehbarer Zeit zu verwirklichen. Fazit Die Risikobewertung von Inhaltsstoffen in Kosmetika und Bedarfsgegenständen mit Blick auf ihr Sensibilisierungspotenzial befindet sich in einer Umbruchphase und steht vor großen Herausforderungen. Die praktische Umsetzung der Kosmetikrichtlinie mit ihren Verbesserungen im Sinn des Ersatzes von Tierversuchen bedeutet auch, dass in der EU momentan keine Tierversuche mehr zur präventiven Testung des Endpunkts Sensibilisierung eingesetzt werden dürfen. Gleichzeitig fehlen aber bisher validierte und international anerkannte Alternativmethoden, das heißt, diese werden zurzeit erst entwickelt und prävalidiert. Die- 378 Bundesgesundheitsblatt - Gesundheitsforschung - Gesundheitsschutz

7 se EU-Vorgabe ist mit Blick auf den Verbraucherschutz sicherlich zunächst einmal kritisch zu sehen (siehe hierzu auch den Beitrag von A. Schnuch et al. in diesem Heft). So müsste mit Priorität ein Ersatzkonzept formuliert werden, um einerseits die Entwicklung neuer Kosmetikprodukte zu ermöglichen, andererseits die Risiken durch neue Inhaltsstoffe für den Verbraucher zu minimieren. Es ergeben sich aber auch neue Perspektiven, wenn zukünftige Risikobewertungen ausschließlich auf Basis epidemiologischer Humanstudien, historischer Daten aus den Tierversuchen LLNA, GPMT sowie Buehler-Test und der Daten aus neuen, prädiktiven Alternativmethoden durchgeführt werden können. Korrespondenzadresse PD Dr. Dr. A. Luch Abteilung Sicherheit von verbrauchernahen Produkten, Bundesinstitut für Risikobewertung (BfR) Max-Dohrn-Str. 8 10, Berlin Andreas.Luch@bfr.bund.de Interessenkonflikt. Der korrespondierende Autor gibt an, dass kein Interessenkonflikt besteht. Literatur 1. Lebensmittel- und Futtermittelgesetzbuch in der Fassung der Bekanntmachung vom 24. Juli 2009 (BGBl. I S. 2205), das zuletzt durch Artikel 5 des Gesetzes vom 9. Dezember 2010 (BGBl. I S. 1934) geändert worden ist. Stand: Neugefasst durch Bek. v I Zuletzt geändert durch Art. 5 G v I Richtlinie 2009/48/EG des Europäischen Parlaments und des Rates vom 18. Juni 2009 über die Sicherheit von Spielzeug 3. Kosmetik-Verordnung in der Fassung der Bekanntmachung vom 7. Oktober 1997 (BGBl. I S. 2410), die zuletzt durch Artikel 1 der Verordnung vom 20. Dezember 2010 (BGBl. I S. 2193) geändert worden ist. Stand: Neugefasst durch Bek. v I Zuletzt geändert durch Art. 1 V v I Bedarfsgegenständeverordnung in der Fassung der Bekanntmachung vom 23. Dezember 1997 (BGBl I S. 5), zuletzt geändert durch Artikel 1 der Verordnung vom 7. Februar 2011(BGBl. I S. 226) 5. Vocanson M, Hennino A, Rozieres A et al (2009) Effector and regulatory mechanisms in allergic contact dermatitis. Allergy 64: Thierse HJ, Moulon C, Allespach Y et al (2004) Metal-protein complex-mediated transport and delivery of Ni 2 + to TCR/MHC contact sites in nickel-specific human T cell activation. J Immunol 172: Jenkinson C, Jenkins RE, Aleksic M et al (2010) Characterization of p-phenylenediamine-albumin binding sites and T-cell responses to hapten-modified protein. J Invest Dermatol 130: Karlberg AT, Bergstrom MA, Borje A et al (2008) Allergic contact dermatitis formation, structural requirements, and reactivity of skin sensitizers. Chem Res Toxicol 21: Watanabe H, Gaide O, Petrilli V et al (2007) Activation of the IL-1β-processing inflammasome is involved in contact hypersensitivity. J Invest Dermatol 127: Schmidt M, Raghavan B, Muller V et al (2010) Crucial role for human Toll-like receptor 4 in the development of contact allergy to nickel. Nat Immunol 11: Martin SF, Esser PR, Weber FC et al (2011) Mechanisms of chemical-induced innate immunity in allergic contact dermatitis. Allergy 66: Eyerich S, Eyerich K, Pennino D et al (2009) Th22 cells represent a distinct human T cell subset involved in epidermal immunity and remodeling. J Clin Invest 119: Yawalkar N, Hunger RE, Buri C et al (2001) A comparative study of the expression of cytotoxic proteins in allergic contact dermatitis and psoriasis: spongiotic skin lesions in allergic contact dermatitis are highly infiltrated by T cells expressing perforin and granzyme B. Am J Pathol 158: Magnusson B, Kligman AM (1969) The identification of contact allergens by animal assay. The guinea pig maximization test. J Invest Dermatol 52: Buehler EV (1965) Delayed contact hypersensitivity in the guinea pig. Arch Dermatol 91: Verordnung (EG) Nr. 1272/2008 des Europäischen Parlaments und des Rates vom 16. Dezember 2008 über die Einstufung, Kennzeichnung und Verpackung von Stoffen und Gemischen 17. Kimber I, Weisenberger C (1989) A murine local lymph node assay for the identification of contact allergens. Assay development and results of an initial validation study. Arch Toxicol 63: Russell WMS, Burch RL (1959) The principles of humane experimental technique. Methuen & Co. Ltd., London 19. Kimber I, Basketter DA, Butler M et al (2003) Classification of contact allergens according to potency: proposals. Food Chem Toxicol 41: Basketter DA, Andersen KE, Liden C et al (2005) Evaluation of the skin sensitizing potency of chemicals by using the existing methods and considerations of relevance for elicitation. Contact Dermatitis 52: SCCP/0919/05 Memorandum on the classification and categorization of skin sensitisers and grading of test reactions. Adopted by the SCCP during the 5th plenary meeting of 20 September Kreiling R, Hollnagel HM, Hareng L et al (2008) Comparison of the skin sensitizing potential of unsaturated compounds as assessed by the murine local lymph node assay (LLNA) and the guinea pig maximization test (GPMT). Food Chem Toxicol 46: Schmidt M, Raghavan B, Muller V et al (2010) Crucial role for human Toll-like receptor 4 in the development of contact allergy to nickel. Nat Immunol 11: Hillen U, Dickel H, Loffler H et al (2011) Late reactions to patch test preparations with reduced concentrations of p-phenylenediamine: a multicentre investigation of the German Contact Dermatitis Research Group. Contact Dermatitis 64: BfR-Stellungnahme: cm/343/kontaktallergene_in_spielzeug_gesundheitliche_bewertung_von_nickel_und_duftstoffen.pdf 26. Adler S, Basketter D, Creton S et al (2011) Alternative (non-animal) methods for cosmetics testing: current status and future prospects Arch Toxicol 85: