Identifizierung von Markersubstanzen zur Charakterisierung von Sortenhonigen

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1 GDL-Symposium onig und onigtechnologie Identifizierung von Markersubstanzen zur Charakterisierung von Sortenhonigen Stuttgart, Tobias Wiezorek ÓQSI

2 Pollen Pollenanalyse viel Erfahrung, über + unterrepräsent. Pollen Tracht Nektar Biene onig onigv Analytik von Proteinen (Enzymatik) Aminosäuren GDL-Symposium onig und onigtechnologie ÓQSI

3 Probenorganisation 35xThymian 21xTanne 5xZuckerfütterung 9xWeißtanne 5xUlmo 27xWald 40xAkazie 1x Amorfa 1x Avocado 9xBuchweizen 4xCalluna 1x Erbeerbaum 8xErica 39xEucalyptus 1xSalbei 20xRosmarin 1xRhododendron 1xRewarewa 41xSonnenblume 10xPinie 1xregano 15xrange 2xMinze GDL-Symposium onig und onigtechnologie 42xRaps me Σ > 500 8xMesquite 7xManuka 52xLinde 19xKastanie 27xKlee 6xLitchie 3xLöwenzahn 1ximbeer 4xKaffee 2xKoriander 3xKornblume 23xLavendel 2xLeatherwood à breite statistische Basis ÓQSI

4 Σ > 500 GDL-Symposium onig und onigtechnologie ÓQSI

5 Enzymatik I saure Phosphatase N 2 Phosphatase 40 C, p = 4,4 N 2 Sistierlösung p = 9,5 N 2 P - l = 405 nm Methodik orientiert sich an: erkunft und Charakterisierung der onig-phosphatasen, Jürgen Siegler, Dissertation an der Universität Stuttgart, 1985 GDL-Symposium onig und onigtechnologie ÓQSI

6 Enzymatik I saure Phosphatase 3,5 3 N 2 Extinktionsänderung [405 nm] 2,5 2 1,5 1 P Phosphatase 40 C, p = 4,4 N 2 Sistierlösung p = 9,5 N 2 - l = 405 nm 0,5 Methodik orientiert sich an: 0 erkunft und Charakterisierung der onig-phosphatasen, Jürgen Siegler, Dissertation 0 30an der Universität Stuttgart, Reaktionszeit [min] Zuckerfütterungshonig Akazienhonig 04/12 Akazienhonig 04/08 Callunahonig 09/04 GDL-Symposium onig und onigtechnologie ÓQSI

7 Enzymatik II Glucose-xidase vs. Katalase Glucose-xidase 40 C, p = 6,1 C 2 C 2 FAD FAD N 2 C 3 N C Peroxidase 2 2 Katalase 40 C, p = 6, N 2 C 3 N C 3 l = 405 nm GDL-Symposium onig und onigtechnologie ÓQSI

8 Enzymatik II Analytik von Glucose-xidase Glucose-xidase 40 C, p = 6,1 C 2 C 2 FAD FAD N 2 C 3 N C Peroxidase 2 2 Katalase 40 C, p = 6, N 2 C 3 N C 3 l = 405 nm GDL-Symposium onig und onigtechnologie ÓQSI

9 Enzymatik II Analytik von Glucose-xidase Glucose-xidase 40 C, p = 6,1 C 2 C 2 FAD FAD N 2 C 3 N C Peroxidase 2 2 Katalase 40 C, p = 6, N 2 C 3 N C 3 l = 405 nm GDL-Symposium onig und onigtechnologie ÓQSI

10 Enzymatik II Analytik von Katalase Glucose-xidase 40 C, p = 6,1 C 2 C 2 FAD FAD N N 2 C 3 C Katalase 40 C, p = 6, à Keine Aktivität der Glucose-xidase N 2 C 3 Peroxidase C 3 N l = 405 nm GDL-Symposium onig und onigtechnologie ÓQSI

11 Enzymatik II Analytik von Katalase Glucose-xidase G 40 C, p = 6,1 C 2 C 2 FAD FAD N 2 C 3 N C Peroxidase Katalase 40 C, p = 6, C 3 N 2 C 3 N l = 405 nm GDL-Symposium onig und onigtechnologie ÓQSI

12 Enzymatik II Analytik von Katalase Glucose-xidase 40 C, p = 6,1 C 2 C 2 FAD FAD N 2 C 3 N C Peroxidase 2 2 Katalase 40 C, p = 6, N 2 C 3 N C 3 l = 405 nm GDL-Symposium onig und onigtechnologie ÓQSI

13 Enzymatik II Analytik von Katalase Glucose-xidase 40 C, p = 6,1 C 2 C 2 FAD FAD N N 2 C 3 C Katalase 40 C, p = 6,1 honigeigene Glucose in Messlösung à Keine Aktivität der Glucose-xidase N 2 C 3 Peroxidase C 3 N l = 405 nm GDL-Symposium onig und onigtechnologie ÓQSI

14 Weitere Parameter im Enzymscreening C 2 N 2 N 2 Saccharase 40 C, p = 6,0 Sistierlösung p = 9,5 N 2 - Saccharase (Invertase) l = 405 nm S 3 - C 3 N + 3 C 3 C C 3 C 3 N N S 3 Na Diastase (α-amylase) Proteingehalt nach Bradford GDL-Symposium onig und onigtechnologie ÓQSI

15 Methodenentwicklung à Bestimmung aller Parameter erfolgt photometrisch à Messung aus einer verdünnten oniglösung à Messung mit ARAA (Automatic random access analyzer) à erfolgreiche Methodenvalidierung à Messung aller Proben (n > 500) (theoretische Gesamtinkubationszeit von 286 Arbeitstagen) GDL-Symposium onig und onigtechnologie ÓQSI

16 Ergebnisse Enzymatik I n = 507 Median Diastase DZ 20 Saccharase U/kg 74 saure Phosphatase U/kg 4,9 Katalase U/kg 1,55 Glucose- xidase U/kg 1 Protein mg/kg 518 GDL-Symposium onig und onigtechnologie ÓQSI

17 Ergebnisse Enzymatik II GDL-Symposium onig und onigtechnologie ÓQSI

18 Cluster von Buchweizenhonig à Dimensionsreduktion mittels auptkomponentenanalyse Ergebnisse Enzymatik II GDL-Symposium onig und onigtechnologie ÓQSI

19 GDL-Symposium onig und onigtechnologie ÓQSI

20 Analytik von Aminosäuren vielfältige Methoden publiziert Aminosäureanalysator PLC / LC-MS (diverse Derivatisierungsmittel) GC-MS (diverse Derivatisierungsmittel) Literatur zu Sortendifferenzierung 7 eng begrenzter Sortenumfang 7 geringer Probenumfang 7 wenig vergleichbar, da verschiedene Parameter GDL-Symposium onig und onigtechnologie ÓQSI

21 Aminosäure-Derivatisierung 2 N R Cl RT, 3-Picolin - 2 Cl, -C 2 N R 1 - Cl - C 2 R 1 R 1 N - Cl N Reaktion mit n-propylchloroformiat* * Nozal, Ma.J., Bernal, J.L., Toribio, M.L., Diego, J.C., Ruiz, A., Journal of Chrom. A, 1047 (2004), S GDL-Symposium onig und onigtechnologie ÓQSI

22 Aminosäure-Derivatisierung 50 µl Probe +interner Std. 100 µl Reagenz Schütteln 100 µl Reagenz + Schütteln +2 min bei U/min zentrifugieren 1 min Derivatisierungszeit Phasentrennung GC-MS in 100 µl Lsg.-mittel aufnehmen obere Phase abnehmen und bis zur Trockne abblasen GDL-Symposium onig und onigtechnologie ÓQSI

23 Analyten nach Derivatisierung (GC-MS) Aminosäuren Metaboliten Alanin β-alanin Asparagin Anthranilsäure Asparaginsäure Benzoesäure Glutamin α-aminobuttersäure Glutaminsäure β-aminobuttersäure Glycin γ-aminobuttersäure istidin para-coumarsäure Leucin Ferulasäure Iso-Leucin 3,4-Dihydroxybenzoesäure Lysin 3-ydroxybenzoesäure rnithin 4-ydroxybenzoesäure Phenylalanin Kaffeesäure Prolin Mandelsäure Benzoesäure Phenylessigsäure Phenylpropionsäure Alanin Sarcosin Glycin Aminobuttersäure-alpha Sarcosin Phenylessigsäure Tryptophan Phenylmilchsäure Tyrosin Phenylpropionsäure Aminobuttersäure-gamma Methionin Valin Aminobuttersäure-beta Leucin trans-zimtsäure Leucin-Iso Anthranilsäure Asparaginsäure Asparagin 1-ydroxy-keto-2-ionon Mandelsäure 3-ydroxybenzoesäure 4-ydroxybenzoesäure Phenylmilchsäure Prolin Glutaminsäure Phenylalanin Vanillinsäure Glutamin 4-Quinolinol para-coumarsäure Abscisinsäure rnithin 3,4-Dihydroxybenzoesäure Ferulasäure Lysin 4--Kynurensäure istidin Tyrosin Kaffeesäure Tryptophan Abundance Valin Vanillinsäure trans-zimtsäure Retentionszeit [min] Akazienhonig Standard GDL-Symposium onig und onigtechnologie ÓQSI

24 Gesamtvarianz Ergebnisse Aminosäureanalytik I - auptkomponentenanalytik 100% 90% 80% 70% 60% 50% 40% 30% 20% à mind. 6 auptkomponenten à breite Differenzierung möglich 10% 0% Anzahl der auptkomponenten GDL-Symposium onig und onigtechnologie ÓQSI

25 Ergebnisse Aminosäureanalytik II GDL-Symposium onig und onigtechnologie ÓQSI

26 Ergebnisse Aminosäureanalytik III Phenylpropanoid-Stoffwechsel 4-ydroxyphenylpyruvat 2 N Tyrosin Prephenylsäure 2 N Phenylpyruvat Phenylalanin trans-zimtsäure Phenylacetaldeyhd para-coumarsäure Phenylmilchsäure Phenylpropionsäure Phenylessigsäure Phenylethanol Ferulasäure Kaffeesäure GDL-Symposium onig und onigtechnologie ÓQSI

27 GDL-Symposium onig und onigtechnologie ÓQSI

28 Phenylalanin-Gehalt [mg/kg] Median aller anderen e onige Lavendelhonige GDL-Symposium onig und onigtechnologie ÓQSI

29 Charakterisierung von Sortenhonigen mittels Markern onigenzyme Analytik einfach und schnell durchführbar Aminosäuren Analytik in Kombination mit Metaboliten durchführbar Kombination mit weiteren Analysen (Flavonoide ) Problem Bezugspunkt: reiner Sortenhonig à Festlegung von Grenzkriterien GDL-Symposium onig und onigtechnologie ÓQSI

30 Danksagung Dr. Cord Lüllmann, Gudrun Beckh Dr. Klaus Beckmann a Nguyen, Vu Raudonis, Steffen Riethmüller Mitarbeiter von QSI Prof. Karl Speer Forschungskreis der Ernährungsindustrie e.v. GDL-Symposium onig und onigtechnologie ÓQSI

31 Danke für Ihre Aufmerksamkeit! Tobias Wiezorek Quality Services International Gmb Am Flughafendamm 9a D Bremen Fon: Mail: Das Forschungsvorhaben (AiF BG) wurde im Programm zur Förderung der Industriellen Gemeinschaft (IGF) vom Bundesministerium für Wirtschaft und Technologie (via AiF) über den Forschungskreis der Ernährungsindustrie e.v. (FEI) gefördert. GDL-Symposium onig und onigtechnologie ÓQSI