Merkmale und Eigenschaften biotechnisch bedeutsamer Mikroorganismen

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1 Merkmale und Eigenschaften biotechnisch bedeutsamer Mikroorganismen Escherichia coli - Das Haustier der Mikrobiologie Escherichia coli ist ein von Theodor Escherich Ende des 19. Jahrhunderts aus dem menschlichen Darm isoliertes Bakterium. Seinerzeit wurde es von ihm als bacterium coli commune bezeichnet. Mittlerweile ist E. coli zum Haustier der Mikro- und Molekularbiologen avanciert. Phylogenetisch gehört das Gram-negative Bakterium in die Klasse der Gamma-Proteobakterien und zur Familie der Enterobacteriaceae. Zu den Enterobakterien (abgeleitet vom griechischen enteron = Systematik von E. coli: Domäne: Bakterien Reich: Proteobakterien Klasse: Gamma-Proteobacteria Ordnung: Enterobacteriales Familie: Enterobacteriaceae Gattung: Escherichia Art: coli Darm) gehören viele Darmbakterien und auch Krankheitserreger (Salmonella thyphimurium, Vibrio cholerae). E. coli, obwohl selber nicht pathogen, ist daher ein wichtiges Markerbakterium, wenn es darum geht, bakterielle Verunreinigungen im Trinkwasser nachzuweisen. Die Anwesenheit von E. coli, das sich auf speziellen Nährmedien sehr schnell nachweisen lässt, dient also als indirekter Nachweis auf andere, mit verunreinigende Darmbakterien, von denen ein hohes Krankheitspotential ausgehen kann. Der E.-coli-Wildtypstamm und die im Labor verwendeten Stämme (vor allem E. coli K12) sind für den gesunden Menschen ungefährlich. Vor einigen Jahren sind allerdings E.-coli-Varianten, Enterohämorrhagische E. coli (EHEC), aufgetaucht, die für Kleinkinder und ältere Menschen gefährlich werden können und einen schweren, blutigen Durchfall auslösen können. E. coli verfügt über einen vielseitigen Stoffwechsel und kann sowohl in Anwesenheit von Sauerstoff (aerob) als auch unter Sauerstoffabschluss (anaerob) wachsen, ist also ein fakultativer Anaerobier. Unter anaeroben Bedingungen vergärt E. coli Glucose zu einer Vielzahl von Produkten (Ethanol, Milchsäure, Essigsäure, Ameisensäure, Wasserstoff und CO 2 ). Lange Zeit war E. coli molekularbiologisch und genetisch der am besten untersuchte Organismus. Das Genom wurde 1997 vollständig sequenziert und die meisten der 4288 Gene sind in ihrer Funktion charakterisiert. Gentechnisch veränderte E.-coli-Stämme werden eingesetzt, um biotechnologische Proteine, wie beispielsweise Insulin und Enzyme zu produzieren. Die Grundlagen der modernen Molekularbiologie wurden mit E. coli entwickelt. Das Bakterium ist im Labor einfach zu kultivieren und hat eine kurze Generationszeit, die unter optimalen Bedingungen nur rund 20 Minuten beträgt. Als Gram-negativer Mikroorganismus gelingt die Transformation, also das Einschleusen von Plasmiden, relativ problemlos. Hinzu kommt, dass die im Labor verwendeten E.-coli-Stämme alle in die niedrigste Sicherheitsstufe eingruppiert sind (SI-Organismen) und daher die baulichen und sicherheitstechnischen Auflagen gering sind. Auch im Produktionsmaßstab (oft mehrere Kubikmeter) haben sich rekombinante E. coli - also solche, die fremde genetische Information tragen, bewährt. So stellt beispielsweise die Firma Sanofi- Aventis (früher Höchst) Insulin im großen Maßstab in E. coli her. Nachteil bei der Produktion rekombinanter Proteine in E. coli ist häufig das Auftreten von inclusion bodies. Darunter versteht man fehlgefaltete und damit unlösliche rekombinante Proteine. Die Bildung von inclusion bodies kann aber durch verschiedene Maßnahmen (niedrige Fermentationstemperatur, geringe Induktorkonzentration) in einigen Fällen deutlich reduziert werden. In manchen Fällen ist die Bildung von inclusion bodies sogar erwünscht, da sich diese durch Zentrifugation und nachgeschaltete Waschschritte leicht von den anderen Zellproteinen abtrennen und so in reiner Form gewinnen lassen. Durch Denaturierung und anschließende Renaturierung unter definierten Bedingungen lassen sich katalytisch aktive und korrekt gefaltete rekombinante Proteine aus den inaktiven inclusion bodies gewinnen. 1

2 Bacillus subtilis - Ein wichtiger industrieller Produktionsstamm Der Gattungsname Bacillus (Plural: Bacilli) leitet sich von dem lateinischen Begriff für Stäbchen ab. Vertreter dieser Gattung sind stäbchenförmige, in der Mehrzahl bewegliche Bakterien, die unter aeroben Bedingungen wachsen und in der Lage sind, Sporen zu bilden. Bacillus subtilis gehört zu den Gram-positiven Bakterien (Firmicutes) und wird der Familie Bacillaceae zugeordnet. B. subtilis ist in der Natur weit verbreitet und kann aus Wasser-, Luft- und Bodenproben isoliert werden. Da sich B. subtilis im Heuaufguss anreichern lässt, wird er häufig auch Heubazillus genannt. Die stäbchenförmigen Zellen sind peritrich, also rund um die gesamte Zelle begeißelt und sind 2 µm lang. Die Ernährungsweise von B. subtilis ist chemoorganoheterotroph, d. h. er nutzt organische Substrate zur Energiegewinnung. In seinem natürlichen Lebensraum, dem Boden, spielt dieser Mikroorganismus eine wichtige Rolle bei der Mobilisierung und Mineralisierung organischer Stoffe und deren Rückführung in die Nahrungskreisläufe. B. subtilis verfügt über eine große Anzahl sekretierter Enzyme, wie beispielsweise Proteasen, Amylasen und Pectinasen, die ihn in die Lage versetzen, abgestorbenes organisches Material zu verwerten. Unter optimalen Bedingungen, in Gegenwart von Sauerstoff und Glucose, hat B. subtilis eine Generationszeit von rund 45 Minuten. Wie bei anderen Mikroorganismen auch reprimiert Glucose die Expression sämtlicher Gene, deren Produkte für die Nutzung alternativer C-Quellen verantwortlich sind. Obwohl Sauerstoff der bevorzugte Elektronenakzeptor ist, kann B. subtilis auch unter anaeroben Bedingungen langsam wachsen, wenn Nitrat als alternativer Elektronenakzeptor zur Verfügung steht. Ohne alternative Elektronenakzeptoren schaltet der Mikroorganismus auf einen Gärungsstoffwechsel um, wobei verwertbare Zucker zu Milchsäure, Ethanol, Acetoin und 2,3-Butandiol umgesetzt werden. Für B. subtilis sind zahlreiche Anwendungen beschrieben. Auf Grund ihrer hohen Hitzeresistenz werden B.-subtilis-Sporen als Indikator bei Sterilisationsprozessen in der Mikrobiologie, Pharmazie und Medizin sowie in der Lebensmittelindustrie eingesetzt. Erst wenn die korrekten Sterilisationsbedingungen (vor allem genügend hohe Temperatur) erreicht sind, wird ein Auskeimen der Sporen verhindert. In der Landwirtschaft dient das Bakterium als biologisches Fungizid für Samen von beispielsweise Baumwolle, Gemüse, Nüssen und Hülsenfrüchten. B. subtilis besiedelt während der Keimung das Wurzelsystem der Nutzpflanzen und beugt durch Verdrängung dem Wachstum von Pilzen vor. In der japanischen Küche ist Natto sehr beliebt. Zur Herstellung von Natto werden Sojabohnen mit dem Stamm Bacillus subtilis subspecies natto fermentiert. Hierbei entstehen Vitamine, Aminosäuren und andere wertvolle Nährstoffe. Charakteristisch ist die Bildung von Polyglutaminsäure, die dem Natto seine fädenziehende Struktur verleiht. In der Industrie nutzt man die Fähigkeit von B. subtilis, extrazelluläre Enzyme zu sekretieren. Viele Waschmittelenzyme (Proteasen) werden von B. subtilis in großem Maßstab produziert. Der Vorteil der Sekretion liegt darin, dass die Enzyme aus dem Kulturüberstand leicht zu reinigen sind, da sie nur mit wenigen anderen Proteinen kontaminiert sind. Mittlerweile haben die großen Enzymhersteller Systeme zur rekombinanten Produktion von bakteriellen Enzymen in Hochleistungsstämmen von B. subtilis etabliert. Dabei werden Enzymausbeuten von mehreren 10 Gramm pro Liter Kulturüberstand erreicht. Weitere Bacillus-Stämme wie z. B. B. megaterium und B. licheniformis werden ebenfalls industriell eingesetzt. Im Jahr 1997 wurde die Sequenz des Genoms von B. subtilis vorgestellt. Der zirkuläre DNS- Doppelstrang umfasst insgesamt Basenpaare bei einem GC-Gehalt von 43,5%. Die codierende Sequenz beträgt rund 87% der Gesamtsequenz und umfasst ca proteinkodierende Gene. Die Analyse der gesamten Genomsequenz hat für die industrielle Nutzung von B. subtilis als Enzymproduzent wichtige Erkenntnisse gebracht und ermöglicht die weitere Optimierung dieses effizienten Produktionsstammes. 2

3 Gattung Clostridium - Stoffwechselvielfalt unter anaeroben Bedingungen Auch die Gattung Clostridium gehört zur Familie der Bacillaceae und damit zu den Gram-positiven, sporenbildenden Bakterien. Im Gegensatz zu den fakultativen Vertretern der Gattung Bacillus wachsen Clostridien mit wenigen Ausnahmen (C. histolyticum, C. acetobutylicum sind aerotolerant) unter strikt anaeroben Bedingungen. Clostridien verfügen nicht über ein Cytochromsystem und können Energie daher nicht über Atmungskettenphosphorylierung gewinnen. Stattdessen verfügen sie über einen vielfältigen Gärungsstoffwechsel, der sie für eine industrielle Anwendung interessant macht. So wird beispielsweise bis heute die Herstellung von Butanol und Aceton durch Clostridium acetobutylicum kommerziell durchgeführt. Noch bis in die 50er Jahre des 20. Jahrhunderts hinein war die biotechnologische Produktion der beiden Lösungsmittel ein wirtschaftlich sehr bedeutendes Verfahren. Von allen Fermentationsprozessen hatte nur die alkoholische Gärung eine größere Bedeutung. Allerdings befinden sich biotechnologische Verfahren immer auch in Konkurrenz zu (petro-)chemischen Verfahren. In Zeiten verringerter Erdölreserven werden aber in Zukunft nachwachsende Rohstoffe eine wichtige Rolle als Erdölersatz spielen. Clostridien könnten dann zu neuer Bedeutung kommen, da sie eine große Zahl von Naturstoffen als Substrate nutzen können. Das breite Substratspektrum umfasst Polysaccharide (Stärke, Glykogen, Cellulose, Hemicellulosen, Pectine), Nukleinsäuren, Aminosäuren und Fette. Die bei der Gattung Clostridium beschriebenen Gärungsprodukte umfassen so wichtige Grundchemikalien wie Buttersäure, Butanol, Propionsäure, Capronsäure, Aceton, Isopropanol und Ethanol. Beispiele von Gärungsprodukten von Clostridien Clostridium-Art Substrate Produkte Bildung von Säuren C. butyricum Glucose, Stärke, Dextrin Butyrat, Acetat, CO 2, H 2 C. pasteurianum Glucose, Stärke, Mannit, Inulin Butyrat, Acetat, CO 2 C. tyrobutyricum Glucose, Lactat Butyrat, Acetat, CO 2, H 2 C. pectinovorum Pectin, Stärke, Glykogen, Dextrin Butyrat, Acetat C. propionicum Alanin, Threonin Acetat, Propionat, CO 2 C. kluyveri Ethanol + Acetat + CO 2 (Apronat, Butyrat, H 2 Bildung von Säuren und Lösungsmitteln C. acetobutylicum Glucose Butyrat, Acetat, Butanol, Isopropanol, CO 2, H 2 Glucose, Glycerin, Pyruvat Butyrat, Acetat, Butanol, Aceton, Acetoin, E- thanol, CO 2, H 2 Milchsäurebakterien - Seit Jahrtausenden von Menschen genutzt Die Milchsäurebakterien gehören zur Familie der Lactobacteriaceae und sind systematisch im Reich II bei den nicht-sporulierenden Gram-positiven Bakterien mit niedrigem GC-Gehalt angesiedelt. Sie stellen eine physiologische Gruppe von Bakterien dar, die als gemeinsames Merkmal einen fermentativen Stoffwechsel mit Milchsäure als charakteristischem, wenn auch nicht immer als einzigem, Produkt haben. Sie sind anaerob, können aber auch in Gegenwart von Sauerstoff wachsen (aerotolerant). Milchsäurebakterien sind stäbchen- oder kokkenförmige, unbewegliche, nicht-sporenbildende (Ausnahme: Sporolactobacillus), säuretolerante Bakterien mit komplexen Nährstoffansprüchen. Der Bedarf an 3

4 Supplinen (Vitamine, Aminosäuren) rührt wahrscheinlich daher, dass die Milchsäurebakterien auf Grund ihrer Spezialisierung auf das Wachstum in Milch die Fähigkeit zur Synthese von Vitaminen und anderen Metaboliten verloren haben. Bedingt durch die hohen Nährstoffansprüche findet man Milchsäurebakterien fast nie im Boden oder im Wasser. Häufig sind sie dagegen in Milch und Milcherzeugnissen zu finden (z. B. Lactobacillus lactis, L. bulgaricus, L. casei, L. brevis). Auch intakte oder sich zersetzende Pflanzen (z. B. Lactobacillus plantarum, L. delbrückii, Leuconostoc mesenteroides) sowie der Darm und die Schleimhäute von Menschen und Tieren (z. B. Lactobacillus acidophilus, Bifidobacterium, Enterococcus faecalis) sind ein bevorzugter Lebensraum. Milchsäurebakterien unterscheiden sich in ihrer Eigenschaft, Glucose entweder ausschließlich zu Milchsäure (Lactat) oder zu Milchsäure und weiteren Gärprodukten zu vergären. Homofermentative Milchsäurebakterien bilden nahezu reines Lactat (> 90% Milchsäure). Heterofermentative Milchsäurebakterien bilden neben dem Lactat auch Ethanol und CO 2 und andere Säuren (Acetat). Milchsäurebakterien werden schon seit Jahrtausenden zur Konservierung von Lebensmitteln eingesetzt. Durch die Vergärung von Zucker zu Milchsäure werden die Lebensmittel angesäuert (ph < 5) und unterdrücken dadurch das Wachstum anderer, schädlicher Bakterien. Zu den wichtigsten milchsauren Lebensmitteln zählen Sauerkraut, Sauerteig, Rohwürste (Salami) und natürlich Milchprodukte wie Sauermilch, Buttermilch, Joghurt und Kefir. In der milchverarbeitenden Industrie werden Milchsäurebakterien nicht nur zur Ansäuerung eingesetzt, sondern auch als Geschmackstoffbildner (Buttergeschmack durch Diacetylbildung). Einen wichtigen Markt haben die Milchsäurebakterien bei den probiotischen Lebensmitteln erobert. Probiotische Lebensmittel (Yoghurt, Yoghurt-Drinks) enthalten magensäuretolerante Milchsäurebakterien, die in den Darm gelangen und dabei aktiv bleiben, um so das Verhältnis von schädlichen und nützlichen Bakterien im Darm positiv zu beeinflussen. Die gesundheitlichen Wirkungen, die durch probiotische Milchsäurebakterien vermittelt werden, sind noch nicht vollständig aufgeklärt und umfassen die Verbesserung der Immunabwehr sowie die Vorbeugung von Infektionen im Magen- Darm-Trakt. Bei Milchzuckerunverträglichkeit können diese milchsauren Produkte häufig toleriert werden. Beispiele für homo- und heterofermentative Milchsäurebakterien Fermentationstyp Stäbchen Kokken Homofermentativ Glucose -> Lactat Lactobacillus delbrückii subsp. lactis Lavtococcus lactis Lactobacillus delbrückii subsp. bulgaricus Enterococcus faecalis Lactobacillus helveticus Streptococcus salivarius Lactobacillus acidophilus Streptococcus pyogenes Lactobacillus casei Lactobacillus plantarum Heterofermentativ Lactobacillus bifermentans Leucanostoc mesenteroides Glucose -> Lactat, Acetat, Ethanol + C0 Lactobacillus brevis Leuconoctoc lactis 2 Lactobacillus fermentum 4

5 Methanogene Mikroorganismen - Das letzte Glied einer anaeroben Nahrungskette Methanbildner sind streng anaerobe Archaeen, die sich ihrer Form nach in stäbchenförmige (Methanobacterium), kokkoide (Methanococcus), Sarcina-ähnliche (Methanosarcina) und Spirillum-förmige (Methanospirillum) unterscheiden lassen. Die methanbildenden Archaeen sind das letzte Glied einer anaeroben Nahrungskette. Komplexe polysaccharide (Stärke, Cellulose) und Fette werden durch Mikroorganismen unter Sauerstoffabschluss fermentativ zu Säuren, Alkoholen, Wasserstoff und CO 2 umgesetzt. Die Methanogenen wiederum bilden aus Acetat bzw. aus H 2 + CO 2 Methan (CH 4 ). Methan ist ein atmosphärisches Treibhausgas, dessen Konzentration sich in der Atmosphäre seit der letzten Eiszeit mehr als verfünffacht (auf derzeit ca. 1,7 ppm) hat und jährlich um 0,5% zunimmt. Der hierdurch verursachte zusätzliche Treibhauseffekt entspricht etwa einem Drittel von dem des CO 2. Die Quellen des atmosphärischen CH 4 sind überwiegend biogen. Die wichtigsten anoxischen Standorte und Quellen für atmosphärisches CH 4 sind natürliche Feuchtgebiete und Reisfelder, außerdem Wiederkäuer (Pansen), Termiten (Enddarm), Mülldeponien und Faulgas aus Klärwerken. Diese Quellen machen nahezu zwei Drittel des gesamten Methanhaushalts von etwa 600 Mio. Tonnen pro Jahr aus. Methanogene Mikroorganismen spielen in Klär- und Biogasanlagen eine wichtige Rolle. Neben der technischen Anwendung dieser Mikroorganismen ist aber auch ihre Stoffwechselaktivität von besonderer Bedeutung für den Kohlenstoffkreislauf der Natur und wird daher intensiv untersucht. Anaerober Biomasseabbau durch Methanogene Extremophile Mikroorganismen leben unter extremen Bedingungen Unter dem Begriff "Extremophile" werden Mikroorganismen zusammengefasst, die unter extremen Bedingungen hinsichtlich Temperatur, ph, Druck oder Salzkonzentration optimal wachsen. Als Bezugsgröße für die Definition des Begriffes "extrem" gelten natürlich Bedingungen, die der Mensch für "normal" hält. Vor diesem Hintergrund können als "normal" angenommen werden: Temperaturen um die 20 C, neutraler ph-wert, atmosphärischer Druck und eine Salzkonzentration von rund 1%. Extremophile Mikroorganismen dagegen leben in den unwirtlichsten und ursprünglichsten Milieus der Erde. Wo andere Organismen nicht existieren können, sind sie zu finden (Tabelle 1.5): in der Tiefsee bei Drücken von mehreren 100 bar, in heißen vulkanischen Quellen bei über 100 C, in kalten Regionen bei Temperaturen um den Gefrierpunkt; in Salzseen (bis zu 30% Salzkonzentration) ebenso wie in Umgebungen mit extremen ph-werten (ph<2, ph > 9). Definition (Wachstumsgrenzen) von extremophilen Mikroorganismen Psychrophile: Temp. Bereich -5 bis 200 C (kein Wachstum oberhalb von 25 C) Psychrotolerante: Temp. Bereich 10 bis 30 C (Optimum oberhalb von 15 C) Thermophile: Temp. opt. 50 bis 70 C Extrem Thermophile: Temp. opt. 70 bis 85 C 5

6 Hyperthermophile: Temp. opt. 85 bis 113 C Halophile: 10 bis 35% Salz Acidophile: ph 0,7 bis 4 Alkaliphile: ph 8 bis 11 Die Zellkomponenten (Enzyme, Membranen) von Extremophilen (Bacteria und Archaea) sind optimal an die extremen Umweltbedingungen angepasst und haben Eigenschaften (Stabilität, Spezifität und Aktivität), die sie für eine biotechnologische Anwendung interessant machen. Für zahlreiche industrielle Verfahren werden spezielle Biokatalysatoren benötigt, die sich neben einer hohen Spezifität auch durch eine ausgeprägte Stabilität unter extremen Bedingungen auszeichnen. Die Rekordhalter unter den extremophilen Organismen Kälte: -15 C Mikroalgen (Eukarya) Hitze: 113 C Pyrolobus fumarii (Archaea) Säure: ph 0,7 Picrophilus torridus (Archaea) Base: ph >10 Natronobacterium pharaonis (Archaea) Strahlung: > 3 Mrad Deinococcus radiodurans (Bacteria) Salz: >5 M Halobacteriaceae (Archaea) Druck: > 100 MPa Seegurken (Eukarya) Ein Paradebeispiel dafür, wie Enzyme aus extremophilen Mikroorganismen erfolgreich kommerziell eingesetzt werden und dabei auch noch einen ganzen Wissenschaftszweig revolutionieren, ist sicherlich die DNS-Polymerase aus dem thermophilen Bakterium Thermus aquaticus. Dieses thermophile und chemoorganotrophe Bakterium gehört zur Gruppe der Deinococci (Reich IX) und wächst optimal bei 70 C (Wachstumsbereich: 50 bis 80 C). Die DNS-Polymerase aus Thermus aquaticus, Taq-Polymerase genannt, hat eine Technologie ermöglicht, die heutzutage aus der medizinischen, biologischen und biotechnologischen Forschung nicht mehr wegzudenken ist: die Polymerase- Kettenreaktion (engl: polymerase chain reaction, kurz: PCR). Die PCR ist ein Verfahren, das DNS durch wiederholte Verdoppelung in mehreren Zyklen mit Hilfe einer DNS-Polymerase künstlich vervielfältigt (amplifiziert). DNS-Polymerasen kommen in allen Lebewesen vor und haben in vivo die Aufgabe, die DNS vor der Zellteilung zu verdoppeln. Das Enzym bindet an einen einzelnen DNS-Strang und erzeugt einen dazu komplementären Strang. Bei der PCR wird in vitro die doppelsträngige DNS durch Erhitzen auf über 90 C in zwei Einzelstränge aufgeschmolzen. Bei diesen hohen Temperaturen wurde die anfangs eingesetzte hitzelabile DNS- Polymerase zerstört und musste daher nach jedem Zyklus erneut zugegeben werden. Erst durch den Einsatz der thermostabilen Taq-polymerase wurde der PCR-Prozess erheblich verbessert und vereinfacht, da diese Polymerase durch das Erhitzen nicht zerstört wird. Bis heute wird die Taq-Polymerase erfolgreich in der PCR eingesetzt. Ein Nachteil der Taq-Polymerase liegt allerdings darin, dass sie manchmal Fehler beim Kopieren der DNS macht, was zu Mutationen in der DNS-Sequenz führt. Neuere DNS-Polymerasen aus thermophilen Archaeen wie Pyrococcus oder Thermococcus haben einen Korrekturmechanismus (proofreading), der die Fehlerrate in der kopierten DNS erheblich senkt. Vertreter der Archaeen-Gattung Pyrococcus gehören zur Gruppe der Euryarchaeota und wachsen optimal unter anaeroben Bedingungen zwischen 90 und 100 C. Ein großes Potenzial wird den Biokatalysatoren aus extremophilen Mikroorganismen in vielen häuslichen und industriellen Anwendungsbereichen zugeschrieben. So können beispielsweise thermoalkaliphile Enzyme (Amylasen, Proteasen) in Wasch- und Geschirrspülmitteln eingesetzt werden, um stärke- bzw. proteinhaltige Verschmutzungen effektiver zu reinigen. In der chemischen Industrie 6

7 werden Enzyme aus extremophilen Mikroorganismen (Extremozyme) für einen Einsatz in der Produktion von Feinchemikalien und Wirkstoffvorstufen (building blocks) getestet. Neben Enzymen spielen aber auch andere Zellinhaltsstoffe aus Extremophilen eine wichtige Rolle. In der Medizin, Diagnostik und Kosmetik werden seit neuerem kompatible Solute eingesetzt, die aus halophilen (salzliebenden) Bakterien gewonnen werden können. Besonders gut untersucht ist die Gewinnung von Ectoin, einem der wichtigsten kompatiblen Solute, aus Halomonas elogata. Das kompatible Solut aus diesem halophilen Bakterium wird in einer ganzen Reihe von Kosmetika eingesetzt und entfaltet auf der Haut eine UV-schützende Wirkung. Die Erforschung und Nutzung von extremophilen Mikroorganismen und ihren Zellkomponenten steht gerade erst am Anfang. Experten gehen davon aus, dass die Nutzung von Extremozymen in den nächsten Jahren weiter zunehmen wird. Saccharomyces, Penicillium und Aspergillum - Pilze in der Biotechnologie Hefen und Pilze spielen von alters her eine wichtige Rolle in biotechnologischen Prozessen. Die Hefen der Gattung Saccharomyces sind die am häufigsten industriell eingesetzten Mikroorganismen überhaupt und werden weltweit jährlich im Maßstab von mehreren Millionen Tonnen produziert. Saccharomyces cerevisiae (die Bäckerhefe) gehört zur Abteilung der Schlauchpilze (Ascomycota). Typisch sind eine asexuelle Vermehrung durch Sprossung und das Fehlen eines Myzels. Unter anaeroben Bedingungen wird Glucose zu Ethanol und CO 2 umgesetzt. Diese Eigenschaft der Bäckerhefe wird genutzt, um sie als Triebmittel für Brot und andere Backwaren einzusetzen bzw. für die Herstellung von Alkohol zu nutzen. Neben diesen Haupteinsatzgebieten werden S. cerevisiae und verwandte Stämme wie S. carlsbergensis auch für die Herstellung verschiedener Enzyme, Vitamine und Lebensmittelzusätze genutzt. Industrielle Nutzung von Hefen und Hefeprodukten Hefezellen Bäckerhefe Brauhefe Trockenhefe Single Cell Protein Hefeprodukte Hefeextrakt Vitamine Enzyme Fermentationsprodukte aus Hefe Ethanol Glycerin alkoholische Getränke Wein Bier S. cerevisiae ist ein gut untersuchter eukaryotischer Modellorganismus. Dank ihrer kurzen Generationszeit von rund 90 Minuten und ihres für Eukaryoten relativ kleinen Genoms, das nur etwa dreimal so groß ist wie das von E. coli, wurden viele molekulargenetische Untersuchungen an S. cerevisiae durchgeführt. Seit 1996 liegt die Sequenz des gesamten Genoms vor. Auch andere Hefen haben mittlerweile den Weg in die industrielle Anwendung gefunden. Trotzdem gilt: Auch wenn zahlreiche Hefen interessante Merkmale aufweisen, werden nur wenige auserwählte Stämme wie Saccharomyces cerevisiae, Pichia pastoris, Hansenula polymorpha, Schizosaccharomyces pombe, Kluyveromyces lactis oder Yarrowia lipolitica industriell genutzt, da die Entwicklung eines Stamms und seiner Züchtungsbedingungen im industriellen Maßstab enorme Investitionen voraussetzt und jede Hefe ein ganz bestimmtes Know-how erfordert. Auch die ebenfalls zu den Schlauchpilzen gehörenden Gattungen Penicillium und Aspergillus haben die Medizin bzw. die Biotechnologie sehr bereichert. Im Jahr 1928 entdeckte Sir Alexander Flemming die antibiotische Wirkung des Schimmelpilzes Penicillium notatum (heute: P. chrysogenum) insbesondere auf Gram-positive Bakterien. 7

8 P. chrysogenum ist weit verbreitet und kann auf verschiedenen Lebensmitteln gefunden werden. Da der Pilz auch geringere Feuchtegehalte tolerieren kann, ist er ein typischer Vertreter der in der Raumluft vorkommenden Schimmelpilze. Eine besondere Rolle spielen Pilze bei der industriellen Produktion von organischen Säuren wie Zitronensäure, Gluconsäure, Äpfelsäure oder Weinsäure. Die Herstellung dieser Säuren mit Hilfe von Pilzen hat den Vorteil, dass sich die Produkte durch kostengünstige Filtrationsprozesse vom Pilzmyzel abtrennen lassen, während zur Separation von Bakterien ein viel höherer technischer Aufwand betrieben werden müsste (Zentrifugation/Separation). Organische Säuren, mit Ausnahme der Milchsäure, werden von den Pilzen nur unter aeroben Bedingungen ausgeschieden. An ihren natürlichen Standorten im Boden scheiden Pilze kaum Intermediärprodukte aus. Stattdessen versuchen sie durch vollständige Oxidation und Assimilation des Substrats möglichst viel Energie und Zellmasse zu gewinnen. Zur Überproduktion der Säuren unter industriellen Bedingungen bedarf es daher eines Ü- berangebots an Nährstoffen (Zucker) und weitere Maßnahmen, um die Produktausbeute zu erhöhen. Häufig werden Spurenelemente wie Eisen, Zink, Mangan, Kupfer oder Magnesium limitiert und stimulieren somit die Überproduktion der gewünschten organischen Säure. Das reguläre Stoffwechselsystem wird also künstlich so beeinflusst, dass es zu einem starken Anstau von Intermediärprodukten kommt. Von großer industrieller Bedeutung ist die Produktion von Zitronensäure durch Aspergillus niger. Der zu den Ascomycota zählende A. niger wird auf Grund seiner dunklen Sporen auch Schwarzschimmel genannt. A. niger ist ein ubiquitär verbreiteter Pilz und kommt weltweit im Erdboden vor. Sein Wachstumsoptimum liegt zwischen 35 und 37 C, das Minimum bei 6 bis 8 C, das Maximum zwischen 45 und 47 C. Interessant ist der außergewöhnlich große ph-bereich (ph 1,5 bis 9,8), den A. niger tolerieren kann. Die mit A. niger produzierte Zitronensäure ist mit einem jährlichen Produktionsvolumen von über Tonnen die mit Abstand wichtigste fermentativ gewonnene Säure. Sie findet als Bestandteil vieler Nahrungs- und Genussmittel breite Anwendung in der Lebensmittelindustrie. Daneben kommt Zitronensäure auch in Medikamenten zu Einsatz, um die Aufnahme von Calcium und Eisen zu verbessern. Im Haushalt ist Zitronensäure als Entkalker sehr verbreitet. Die großtechnische Produktion von Zitronensäure erfolgt durch Fermentation zuckerhaltiger Stoffe (meist Melasse), die dem Pilz im Überschuss angeboten werden. Neben dem so genannten Oberflächenverfahren, bei dem die Fermentation in großen Schalen abläuft, werden verstärkt Submersverfahren (Fermentation in gerührten Fermentern) zur Zitronensäureproduktion eingesetzt Die Ausbeuten in den modernen technischen Verfahren liegen meist zwischen 65 und 90% der theoretisch erreichbaren Menge an Zitronensäuremonohydrat bezogen auf die eingesetzte Zuckermenge. Da die Spurenelemente Eisen und Mangan stark hemmend auf die Zitronensäureproduktion wirken, werden sie durch spezielle Verfahren aus den eingesetzten Rohstoffen entfernt. Wichtig ist ferner die genaue ph-regelung, da A. niger nur im stark sauren Milieu Zitronensäure bildet. Unter schwach sauren Bedingungen hingegen wird Gluconsäure und im neutralen Bereich Oxalsäure gebildet. Zur Entwicklung von genügend Myzel wird die Fermentation dennoch häufig im schwach sauren Bereich begonnen und in späteren Phasen durch Selbstsäuerung in den für die Zitronensäurebildung optimalen Bereich (ph 1,5 bis 2,5) abgesenkt. Der Mensch hat es schon immer verstanden, die vielfältigen Stoffwechselleistungen der Mikroorganismen nutzbringend anzuwenden. Durch die Entwicklung der modernen Mikrobiologie und Biotechnologie als naturwissenschaftliche Disziplin ist es in den vergangenen 200 Jahren gelungen, wichtige Grundlagen zum Verständnis der zellulären Vorgänge zu erforschen. Die so gewonnenen Erkenntnisse über die Diversität, Physiologie und Enzymatik der Mikroorganismen versetzen uns heute in die Lage, Bakterien, Archaeen und Pilze in innovativen bio-technologischen Verfahren einzusetzen. Mit dem Siegeszug der Biotechnologie als Megatechnologie des 21. Jahrhunderts wird auch der angewandten Mikrobiologie in Zukunft eine tragende Rolle zukommen. 8