Ziegenhals, Katja et al. (2005) Mitteilungsblatt der Fleischforschung Kulmbach 44, Nr. 170,

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1 , Entwicklung einer GC/MS-Methode zur Bestimmung der 15 von der EU als prioritär eingestuften Polycyclischen Aromatischen Kohlenwasserstoffe (PAK) in verschiedenen Lebensmittelgruppen Development of a GC/MS method for the determination of the 15 EU priority polycyclic aromatic hydrocarbons (PAH) in different food groups Katja ZIEGENHALS, W. JIRA und K. SPEER 1 1 Institut für Lebensmittelchemie, TU Dresden Zusammenfassung Um der Empfehlung der EU-Kommission nachzukommen, verschiedene Lebensmittelgruppen hinsichtlich ihrer Gehalte an den vom Wissenschaftlichen Ausschuss Lebensmittel (Scientific Committee on Food) als karzinogen eingestuften Polycyclischen Aromatischen Kohlenwasserstoffe (-PAK) zu untersuchen, wurde die an der BfEL Kulmbach etablierte GC/MS-Methode weiterentwickelt. Als Problem bei der Analytik der 15 -PAK erweist sich die gaschromatographische Trennung der einzelnen PAK-Isomere, insbesondere derjenigen mit einem Molekulargewicht von 302, da hier die Anzahl der möglichen Isomere besonders hoch ist. Durch Optimierung der gaschromatographischen Bedingungen konnte eine ausreichende Auftrennung der 15 PAK erreicht werden. Dabei konnte eine Auftrennung der Benzofluoranthene (Benzo[b]fluoranthen, Benzo[k]fluoranthen, Benzo[j]fluoranthen) und eine bessere chromatographische Auftrennung der PAK mit einem Molekulargewicht von 302 in geräucherten Fleischerzeugnissen erreicht werden. Summary In order to follow the recommendation of the European Commission to analyze different food groups concerning their contents of polycyclic aromatic hydrocarbons (PAH) which are believed to be carcinogenic by the Scientific Committee on Food (15 -PAH) the GC/MS method established at the BfEL Kulmbach was enhanced. The problem in the analysis of the 15 -PAH is the gas chromatographic separation of the single PAH isomers, in particular in the group of PAH compounds with a molecular weight of 302, because the number of possible isomers within this group is rather high. Improvement of the gas chromatographic conditions resulted in a sufficient separation of the 15 PAH compounds. Hereby a separation of benzofluoranthenes (benzo[b]fluoranthene, benzo[k]fluoranthene, benzo[j]fluoranthene) and a better chromatographic separation of PAH compounds with a molecular weight of 302 in smoked meat products were achieved. Schlüsselwörter Key Words -PAK GC/MS geräucherte Fleischerzeugnisse Verordnung (EG) Nr. 208/2005 -PAH GC/MS smoked meat products Commission Regulation (EC) No 208/2005 Einleitung Polycyclische Aromatische Kohlenwasserstoffe (PAK) sind eine Gruppe von organischen Verbindungen, die zwei oder mehr kondensierte aromatische Kohlenstoffringe enthalten. Sie werden hauptsächlich bei pyrolytischen Prozessen, insbesondere bei der unvollständigen Verbrennung organischen Materials gebildet. In Lebensmitteln können sich PAK durch Umweltbelastungen, aber auch bei Verfahren zum Erhitzen, Trocknen und Räuchern bilden, falls Verbrennungsrückstände direkt 311

2 mit dem Lebensmittel in Kontakt kommen. Die Gruppe der PAK umfasst bis zu 250 verschiedene Substanzen, von denen einige Krebs erregende Eigenschaften aufweisen. Die bekannteste karzinogene PAK-Verbindung ist das Benzo[a]pyren, welches bislang als Leitsubstanz verwendet wird. Bereits in den 70er-Jahren hat die amerikanische Umweltbehörde (US ) die am häufigsten in der Umwelt vorkommenden PAK-Verbindungen identifiziert, die als 16 -PAK bekannt wurden [1]. Bislang wurden falls neben Benzo[a]pyren überhaupt noch andere PAK-Verbindungen bestimmt wurden in den verschiedenen Lebensmitteln allenfalls diese 16 -PAK untersucht [2,3]. Seit dem 1. April 2005 ist die Verordnung 208/2005 der Kommission vom 4. Februar 2005 in Kraft [4], die Benzo[a]pyren- Höchstgehalte für verschiedene Lebensmittelgruppen vorsieht (siehe Tabelle 1). Ferner empfiehlt die Kommission [5] den einzelnen EU-Mitgliedsstaaten, die in Tabelle 1 aufgeführten Lebensmittelgruppen nicht nur auf Benzo[a]pyren, sondern auch hinsichtlich ihrer Gehalte an den vom Wissenschaftlichen Ausschuss Lebensmittel (Scientific Committee on Food) als karzinogen eingestuften PAK (-PAK) (siehe Abb. 1) zu untersuchen. Diese neue Liste des unterscheidet sich jedoch deutlich von der Liste der 16 -PAK: Einerseits fehlen die leichten PAK mit zwei (Naphthalin) und drei aromatischen Ringen (Acenaphthylen, Acenaphthen, Fluoren, Phenanthren und Anthracen) und die PAK-Verbindungen Fluoranthen und Pyren, für die bislang keine bzw. nur sehr geringe Hinweise auf kanzerogene Eigenschaften vorliegen. Andererseits kommen die Verbindungen Cyclopenta(c,d)pyren und 5-Methylchrysen und vier Dibenzpyrene (Dibenzo[a,e]pyren, Dibenzo[a,h]- pyren, Dibenzo[a,i]pyren und Dibenzo- [a,l]pyren) hinzu, wobei insbesondere das Dibenzo[a,l]pyren in jüngster Zeit im Fokus des Interesses steht, da toxikologische Untersuchungen darauf hinweisen, dass Dibenzo[a,l]pyren ein deutlich stärker ausgeprägtes kanzerogenes Potential aufweisen könnte als Benzo[a]pyren [6]. Tab.1: Benzo[a]pyren-Höchstgehalte in verschiedenen Lebensmittelgruppen [4] Erzeugnis Zum direkten Verzehr oder zur Verwendung als Lebensmittelzutat bestimmte Öle und Fette Benzo[a]pyren-Höchstgehalt (µg/kg Frischgewicht) 2,0 Nahrung für Säuglinge und Kleinkinder 1,0 Getreidebeikost und andere Beikost für Säuglinge und Kleinkinder Säuglingsanfangsnahrung und Folgenahrung, auch Säuglingsmilchnahrung und Folgemilch Diätetische Lebensmittel für besondere medizinische Zwecke, die eigens für Säuglinge bestimmt sind Geräuchertes Fleisch und geräucherte Fleischerzeugnisse 5,0 Muskelfleisch von geräuchertem Fisch und geräucherten Fischerzeugnissen, außer Schalentieren 5,0 Muskelfleisch von anderem als geräuchertem Fisch 2,0 Krebstiere und Kopffüßer, nicht geräuchert 5,0 Schalentiere 10,0 312

3 Acenaphthene Benzo[k]- fluoranthene Acenaphthylene Chrysene Anthracene Dibenzo(a,h)- anthracene Fluoranthene Indeno(1,2,3 -cd)pyrene Fluorene Benzo[j]- fluoranthene Naphthalene Cyclopenta- (c,d)pyrene Phenanthrene Dibenzo- [a,e]pyrene Pyrene Dibenzo- [a,h]pyrene Benzo[a]- anthracene Dibenzo- [a,i]pyrene Benzo[a]- pyrene Dibenzo- [a,l]pyrene Benzo[b]- fluoranthene 5-Methylchrysene CH 3 Benzo(g,h,i)- perylene Benzo[c]- fluorene JECFA Abb. 1: Strukturformeln der 16 -PAK, 15 -PAK und des JECFA-PAK Benzo[c]fluoren 313

4 Entwicklung einer GC/MS-Bestimmungsmethode für die 15 -PAK in Lebensmitteln An der BfEL Kulmbach konnten mit der bislang etablierten GC/MS-Methode [7] die Gehalte der 10 PAK-Verbindungen Fluoranthen, Pyren, Benzo[a]anthracen, Chrysen, Benzo[b]fluoranthen, Benzo[k]fluoranthen, Benzo[a]pyren, Indeno(1,2,3-cd)- pyren, Dibenzo(a,h)anthracen und Benzo- (g,h,i)perylen (siehe Abb. 1; grün markiert) in geräucherten Lebensmitteln (Fleisch/ Fleischerzeugnisse, Fisch und Käse) erfasst werden. Diese Methode wird derzeit zum einen auf die anderen in Tabelle 1 aufgeführten Lebensmittelgruppen, für die ein Höchstgehalt für Benzo[a]pyren existiert, ausgeweitet. Zum anderen sollen auch die bislang noch nicht erfassten -PAK (siehe Abb. 1; gelb markiert) und das vom Joint FAO/WHO Experts Committee on Food Additives (JECFA) [8] als besonders relevant eingeschätzte Benzo[c]fluoren ebenfalls analytisch mit erfasst werden. Nach ersten Untersuchungen konnte festgestellt werden, dass die bereits etablierte Probenvorbereitung [7] bestehend aus beschleunigter Lösungsmittelextraktion, Gelpermeationschromatographie und Fraktionierung an einer Minikieselgelsäule für die Aufarbeitung geeignet ist. Alle 15 PAK können mit diesem Verfahren aus dem Lebensmittel weitgehend extrahiert werden. Gaschromatographische Trennung, Identifizierung und Quantifizierung stellten größere Probleme dar. Es sollte daher eine Methode erarbeitet werden, bei der alle relevanten PAK entweder über ihre unterschiedlichen Retentionszeiten oder über ihre unterschiedlichen Massezahlen zuverlässig quantifiziert werden können. Für die gaschromatographische Trennung und Quantifizierung wurde ein Gaschromatograph GC series 7590 (Agilent Technologies) und ein Massenselektiver Detektor 5973 (Agilent Technologies) verwendet. Injiziert wurden im pulsedsplitless Modus jeweils 1,5 µl bei einer Injektortemperatur von 325 C. Der Säulenfluss der VF-17ms (60 m x 0,25 mm x 0,25 µm) von Varian (50 % Phenyl-) betrug 1 ml/min. Die Injektion startete bei einer Ofentemperatur von 50 C. Nach einer Minute wurde zunächst mit 30 C/min auf eine Temperatur von 280 C aufgeheizt, dann mit 1 C/min auf 340 C. Um eine ausreichende Auftrennung der Dibenzpyrene zu ermöglichen, wurde in der nächsten Phase mit 0,5 C/min auf 350 C geheizt. Diese Temperatur wurde weitere 2 min gehalten. Die beheizten Zonen des Massenselektiven Detektors betrugen für die Quelle 250 C und für den Quadrupol 150 C. In der Vergangenheit erwies es sich als besonders schwierig, die Benzofluoranthene zu quantifizieren, da deren gaschromatographische Trennung auf den bislang üblicherweise für die PAK-Analytik eingesetzten GC-Phasen mit einem Anteil von 5 % Phenylpolymethylsiloxan nicht möglich war. FERNANDEZ und BAYON gelang es im Jahre 1989, die Benzofluoranthene getrennt voneinander zu detektieren. Allerdings erwies sich die eingesetzte Trennphase als nicht temperaturstabil [9]. Aus diesem Grund wurden verschiedene Säulen getestet. Als besonders geeignet für die Analytik der 15 PAK erwies sich eine Säule mit einem Anteil von 50 % Phenylpolymethylsiloxan. Mit dieser Säule und einem optimierten Temperaturprogramm konnten alle 15 PAK gaschromatographisch getrennt bzw. über ihre unterschiedlichen Massenfragmentionen (Indeno[1,2,3-cd]pyren und Dibenzo[a,h]-anthracen) detektiert werden. Aus dem Chromatogramm (Abb. 2) eines nativen Standards, der alle 15 PAK in einer Konzentration von ca. 50 ng/ml enthielt, konnten die Retentionszeiten der Tabelle 2 ermittelt werden. Die Elutionsreihenfolge der Isomere Chrysen und Benzo[a]anthracen sowie der Benzofluoranthene wurde durch Injektion der entsprechenden Einzelstandardverbindungen abgesichert. 314

5 Tab. 2: Elutionszeiten der 15 PAK Abk Verbindung Rt [min] BaA Benzo[a]anthracen 21,27 CHR Chrysen 21,82 CPP Cyclopenta[c,d]pyren 21,95 5MC Methylchrysen 24,78 BbF Benzo[b]fluoranthen 30,19 BkF Benzo[k]fluoranthen 30,42 BjF Benzo[j]fluoranthen 30,76 BaP Benzo[a]pyren 34,54 DhA Dibenzo[a,h]anthracen 47,16 IcP Indeno[1,2,3-cd]pyren 47,20 BgP Benzo[ghi]perylen 51,57 DlP Dibenzo[a,l]pyren 66,25 DeP Dibenzo[a,e]pyren 70,32 DiP Dibenzo[a,i]pyren 72,47 DhP Dibenzo[a,h]pyren 73,72 DlP DeP DiP DhP BaA CHR CPP 5MC BbF BkF BjF BaP DhA+IcP BgP 75.00min Abb. 2: Standard-Chromatogramm der 15 -PAK (ca. 50 ng/ml) auf einer VF-17ms-Säule Anwendung der GC/MS-Methode auf geräucherte Fleischerzeugnisse Die Eignung dieser modifizierten GC/MS- Methode für geräucherte Fleischerzeugnisse wurde zunächst mit einer stark geräucherten Rohwurst (Kaminwurzn; siehe Abb. 3) mit hohen PAK- Gehalten überprüft. Die gaschromatographische Trennung des Cyclopenta[c,d]- pyren (CPP) von Benzo[a]anthracen (BaA) bzw. Chrysen (CHR) in Kaminwurzn ist auf einer VF-17ms-Säule im Gegensatz zu einer Säule mit einem Anteil von 5 % Phenyl- möglich (siehe Abb. 4). m/z= 228 m/z= 226 BaA CHR CPP 22.60mi Abb. 3: Kaminwurzn Abb. 4: Elution von BaA, CHR und CPP in Kaminwurzn auf einer VF-17ms 315

6 Obwohl CPP (M = 226) ein anderes Molekulargewicht besitzt als BaA und CHR (jeweils M = 228), ist eine gute chromatographische Trennung dennoch für eine zuverlässige Quantifizierung von CPP erforderlich, da BaA und CHR auch Fragmentionen der Masse m/z = 226 aufweisen und bei ungenügender gaschromatographischer Trennung eine Quantifizierung von CPP verfälschen würden. Der Ausschluss möglicher Koelutionen von Chrysen und Triphenylen sowie Dibenzo[a,h]- anthracen und Dibenzo[a,c]anthracen muss in nachfolgenden Untersuchungen mittels Einzelstandards oder certifiziertem Referenzmaterial abgesichert werden. Eine Koelution von Benzo[a]fluoranthen mit anderen PAK s kann indes nahezu ausgeschlossen werden. Die gaschromatographische Trennung der Benzofluoranthene in der Matrix Kaminwurzn auf einer VF-17ms-Säule ist in Abbildung 5 dargestellt: Es konnte also auch im geräucherten Fleischerzeugnis eine gaschromatographische Basislinientrennung und damit eine zuverlässige Quantifizierung der drei Benzofluoranthene erreicht werden. Auch bei der Quantifizierung der Dibenzpyrene ist die 50 % Phenyl-Phase einer 5 % Phenyl-Phase deutlich vorzuziehen, da auf dieser Phase die Elutionsabstände zwischen den einzelnen Dibenzpyrenen größer sind. Eine größere zeitliche Auftrennung der Dibenzpyrene ist notwendig, um die vier zu bestimmenden Dibenzpyrene von möglichst vielen Isomeren zu trennen (Abb. 6). Je mehr Isomere voneinander getrennt werden können, desto kleiner ist der Quantifizierungsfehler bei der Bestimmung der Gehalte. Ferner bietet die 50 % Phenyl-Phase den Vorteil, dass die vier Dibenzpyrene ein annähernd gleiches Responseverhalten zeigen, was bei einer Quantifizierung über Responsefaktoren von Vorteil ist. BbF BjF BkF m/z mi Abb. 5: Elution der Benzofluoranthene in Kaminwurzn auf einer VF-17ms native Standardverbindungen Dibenzo[a,l]pyren Dibenzo[a,e]pyren Dibenzo[a,i]pyren Dibenzo[a,h]pyren min Abb. 6: Trennleistung der PAK-Isomere mit MW = 302 in Kaminwurzn (VF-17ms) 316

7 Ausblick Die modifizierte GC/MS-Methode zur Bestimmung der von der EU-Kommission (Empfehlung vom 4. Februar 2005) als prioritär eingestuften 15 -PAK kann zu einer Bestimmung dieser PAK in geräucherten Fleischerzeugnissen eingesetzt werden. Ziel der BfEL Kulmbach ist es nun, eine breite und möglichst repräsentative Datengrundlage für die Gehalte dieser PAK in geräucherten Fleischerzeugnissen zu erstellen und diese dann der Kommission zur Verfügung zu stellen. Ferner soll diese Methode auch auf andere Lebensmittelgruppen, für die Benzo- [a]pyren-höchstgehalte existieren (siehe Tab. 1), ausgedehnt werden und in EUweiten Laborvergleichsuntersuchungen validiert werden. Die Analytik der Dibenzpyrene ist auf einer GC-Säule mit 50 % Phenyl-Anteil aufgrund der deutlich besseren chromatographischen Auftrennung wesentlich besser zu realisieren als auf einer Phase mit 5 % Phenyl-Anteil. Dennoch kann nicht ausgeschlossen werden, dass insbesondere bei dem toxikologisch äußerst relevanten Dibenzo[a,l]pyren immer noch Koelutionen stattfinden. Für derartige Überlagerungen sprechen u. a. auch die Untersuchungen von SCHUBERT et al. [10], der Dibenzo[a,l]pyren als Minorkomponente unter den PAK-Isomeren mit einem Molekulargewicht von 302 in Steinkohlenteer ausmachte. Auch SAUVAIN und VUDUC [11] konnten bei Ihren Untersuchungen von Diesel-Partikeln mögliche Koelutionen von Dibenzo[a,l]pyren mit anderen Isomeren der Massezahl m/z = 302 nicht ausschließen. Trotz einer sehr wahrscheinlichen Überschätzung der Gehalte der Dibenzpyrene auf einer Säule mit 50 % Phenyl-Anteil ist die Überschätzung doch weitaus geringer als auf einer Phase mit 5 % Phenyl-Anteil. Dennoch besitzen auch die mit Hilfe der beschriebenen GC/MS-Methode ermittelten Gehalte an Dibenzpyrenen noch den Charakter einer worst-case -Betrachtung. Literatur [1] USA- (1984): Federal register, rules and regulation, Vol 49, no. 209, method 610 Polynuclear aromatic hydrocarbons (Oct 1984). Environmental Protection Agency [2] Speer, K., Montag, A. (1988): Polycyclische aromatische Kohlenwasserstoffe in nativen pflanzlichen Ölen: Fat Sci Technol 90, [3] Speer, K. (1997): Determination of PAH in foods. In: Food and Environmental Analysis by Capillary Gas Chromatography (ed. L. Matter) Hüthig Verlag, [4] Verordnung (EG) Nr. 208/2005 der Kommission vom 4. Februar 2005 zur Änderung der Verordnung (EG) Nr. 466/2001 im Hinblick auf polyzyklische aromatische Kohlenwasserstoffe [5] Empfehlung der Kommission vom 4. Februar 2005 über die genauere Ermittlung der Mengen von polyzyklischen aromatischen Kohlenwasserstoffen in bestimmten Lebensmitteln [6] Higginbotham, S., Ramakrishna, N., Johansson, S., Rogan, E., Cavalieri, E. (1993): Tumor-initiating activity and carcinogenicity of dibenzo[a,l]pyrene versus 7,12-dimethylbenz[a]anthracene and benzo[a]pyrene at low-doses in mouse skin. Carcinogenesis 14, [7] Jira, W. (2004): A GC/MS method for the determination of carcinogenic polycyclic aromatic hydrocarbons (PAH) in smoked meat products and liquid smokes. Eur Food Res Technol 218, [8] Summary and Conclusion of the Joint FAO/WHO Expert Committee on Food Additives, Sixty-Fourth meeting, Rome, 8-17 February 2005, JECFA/64/SC [9] Fernandez, P., Bayona, J. M. (1989): 10th International Symposium on Capillary Chromatography, Riva del Garda, Italy, 1989, Vol. I, [10] Schubert et al. (2003): Determination of polycyclic Aromatic Hydrocarbons with Molecular Weight 300 and 302 in Environmental-Matrix Standard Reference Materials by Gas Chromatography/Mass Spectrometry: Anal Cheml 75, 2, [11] Sauvain, J., VuDuc, T. (2004): Approaches to identifying and quantifying polycyclic aromatic hydrocarbons of molecular weight 302 in diesel particulates. J Sep Sci 27,

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