7. Woche. Dünnschichtchromatographie
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- Regina Falk
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1 7. Woche Dünnschichtchromatographie Die Dünnschichtchromatographie (DC) findet als einfache, schnelle und preiswerte Standardmethode für Substanztrennung in praktisch allen Gebieten der Naturwissenschaften und Medizin Anwendung. Die Dünnschichtchromatographie erlaubt die Trennung größerer Substanzmengen, benötigt kürzere Trennnzeiten, und bringt meist eine bessere Auflösung eines Gemisches als die Papierchromatographie. Sie ist eine Adsorptionschromatographie, bei der auch Verteilungsgleichgewichte eine Rolle spielen. Die stationäre Phase ist eine Adsorbentschicht, die auf Glasplatten, Aluminium- oder Kunststoff-Folien als Träger aufgebracht wird. Man kauft fertig beschichtete Platten (DC-Platten). Mit Hilfe eines Streichgerätes selbst aufgetragenen Dünnschichtplatten werden nur noch selten verwendet. Die Variationsbreite für das Adsorbent ist sehr groß, es gibt verschiedene Adsorbentien wie Kieselgele (Polykieselsäure), Aluminiumoxide, Cellulose, usw. Die Substanzproben werden an einem Ende einer DC-Platte aufgetragen: Startlinie ca. 10 mm vom unteren Plattenrand, Probenabstand mind. 10 mm, Probenmenge 0,5-5 µg in 1-5 µl Lösung, Substanzfleckendurchmesser max. 3 mm. Zum Auftragen bedient man sich mit einer feinen Kapillare, oder Mikropipette, wobei die Sorptionsschicht nicht beschädigt werden sollte. Nach dem Antrocknen wird die Platte in einem Entwicklungstank, meist einem Glasgefäß, mit dem Laufmittel (auch Fließmittel, Eluent genannt) in Berührung gebracht (Abb. 1). Dabei muss die DC- Platte etwa 0.5 cm in das Fließmittel eintauchen, auf keinem Fall aber dürfen die aufgetragenen Flecken in das Fließmittel eintauchen. Durch Wirkung der Kapillarkräfte steigt das Fließmittel auf der DC-Platte nach oben. Es können die gleichen Laufmittel wie in der Papierchromatographie verwendet werden. Eine optimale Trennung ist meist erreicht, wenn die Fließmittelfront ca. 15 mm vom oberen Plattenrand entfernt ist. Die Lösungsmittelfront wird nach dem Herausnehmen der Platte aus dem Kammer sofort markiert, da das Lösungsmittel rasch verdunstet!
2 Abbildung 1 Entwicklungstank Die meistbenützte Methode ist die aufsteigende DC. Die qualitative (R f -Werte) und quantitative Auswertung geschieht analog zur Papierchromatographie. Für die Sichtbarmachung verwendet man Sprühreagenzien mit denen viele Substanzen charakteristische Farbreaktionen geben, oder UV-Licht. (Es gibt auch mit einem Fluoreszenzindikator versehene Dünnschichtplatten. Auf derart beschichteten Platten werden bei Bestrahlung mit UV Licht (λ=254 nm) alle Substanzen sichtbar, die oberhalb 254 nm Fluoreszieren, unabhängig von einer evtl. Eigenfluoreszenz.) Im Labor sind mit Ioddampf gesättigte Glasgefäße (Iodkammer) sehr beliebt (es bilden sich farbige Iodkomplexe). Da viele Farbflecke nicht beständig sind, empfiehlt es sich, sie mit einer Nadel zu umreißen.
3 Versuch 3 Das Tswett -Versuch auf Dünnschichtplatte Die Gruppe präpariert gemeinsam die Probe, die Trennung wird von jedem Student einzeln durchgeführt. a) Zubereitung der Probe: Ungefähr ein Esslöffel geschnittene, grüne Pflanzen- Blätter werden Minuten lang in einem Erlenmeyerkolben mit 20 cm 3 Aceton geschüttelt. Während dieser Zeit löst sich der Großteil der Farbstoffe. Die Acetonische Lösung gießt man in einen 100 cm 3 Scheidetrichter, gibt man 10 cm 3 Hexan und 50 cm 3 Wasser dazu. Nach Ausschütteln lasst man die Phasen sich voneinander trennen. Die Unterphase wird weggeworfen, die Oberphase (Hexan-Extrakt) noch einmal mit 10 cm 3 Wasser ausgeschüttet. Die Oberphase wird in ein Reagenzglas abgelassen, mit wasserfreiem Natrium-Sulfat getrocknet, durch einen Faltenfilter in ein trockenes Reagenzglas filtriert. Jeder Student nimmt aus dieser grünen Lösung mit einer Kapillare eine Probe. b) Trennung: auf der Kieselgel DC-Platte werden drei Startpunkte markiert (vorsichtig mit einem Bleistift, ohne den Schicht zu beschädigen), und von der Probe bringt man links nach rechts wachsende (z.b. die doppelte) Mengen Probe mit einer Kapillare auf. Nach dem Antrocknen der Flecken entwickelt man das Chromatogramm mit einem Hexan-Aceton 7:3 Fließmittel. Nach der Entwicklung sollen die Flecken gleich markiert werden, bevor die Farben verbleichen (photochemischer Abbau). Im Protokoll sollen die R f -Werte der Flecken notiert werden. (Der gelbe Fleck des apolaren ß-Karotins befindet sich an der Front, die andere Karotine zeigen immer kleinere R f Werte in der Reihenfolge ihrer wachsenden Polarität. Chlorophyll-A gibt blaugrünes, Chlorophyll-B gelbgrünes Fleck.
4 Versuch 4 Chromatographische Untersuchung der Komponente von Analgetika (Schmerzstillende Mittel) Mit Hilfe eines Glasstabes wird zwischen zwei Filterpapier Schichten eine Tablette zerdrückt. Das Pulver wird in 3 cm 3 Chloroform suspendiert und eine Minute lang geschüttelt (extrahiert) und stehen gelassen. Auf der Kieselgelplatte werden 3 Felder markiert: Auf Feld 1. und 3. wird mit einer Kapillare 1-1 Tropfen Koffeinstandard aufgebracht. Nach Antrocknen wird über das Koffein auf Feld 1. ein Tropfen Phenazetin, auf Feld 3. ein Tropfen Amidazophen aufgebracht. Auf Feld 2. bringt man ein Tropfen vom Tabletten Extrakt auf. 20 cm 3 Fließmittel (Ethylacetat Eisessig 9:1) wird ins Entwicklungstank gefüllt, die DC-Platte hineingelegt und abgedeckt. Nach Entwickeln wird die Platte unter Infrarotlampe 5 Minuten lang getrocknet, dann werden die Flecken sichtbar gemacht. Die getrocknete Platte wird mit einer alkoholischen Jodlösung, danach umgehend mit einer alkoholischen Salzsäure Lösung besprüht. Die Platten werden dann unter Infrarotlampe erwärmt. Die Flecken des Koffeins erscheinen zuerst in blaugrauer Farbe, dann erscheint Amidazophen in brauner und Phenazetin in rotbrauner Farbe. Identifiziert werden die einzelne Komponente durch ihre R f Werte. Versuch 5 Säulenchromatographie: Entionisierung von einer wässrigen K 2 CrO 4 Lösung mit Ionenaustauscherharz Mit dem Versuch wird der Prozess des Ionenaustausches veranschaulicht. Als Trennsäule verwendet man ein senkrecht stehendes Glasrohr. Der untere Teil des Rohres ist verengt und ist mit einem Hahn versehen, um den Lösungsmitteldurchfluß regulieren zu können (sog. Chromatographierohr ). Es wird bei der Einengung ein Wattepfropfen (oder Glaswollepfropfen) eingebracht um ein Herausfließen der stationären Phase (hier Ionenaustauscher) zu verhindern. Der aufgeschlämmte Anionenaustauscherharz wird in die Säule von oben eingefüllt.
5 Danach lässt man das Laufmittel teilweise langsam auslaufen, um das Absetzen des Harzes zu beschleunigen (Schichhöhe cm). In gleicher Weise wird über die Anionenaustauscher ein Schicht Kationenaustauscherharz gefüllt. Der Austauscherschicht wird mit einem Wattepfropfen abgedeckt. Die fertige Säulenfüllung darf nicht Trockenlaufen, d.h. sie muss stets mit Lösungsmittel bedeckt bleiben. 1 cm 3 verdünnte K 2 CrO 4 Lösung (gelb) wird mit Hilfe einer Pasteur-Pipette aufgetragen. Der Durchfluss wird auf ca. 1 Tropfen/sec eingestellt, Fiessmittel ist destilliertes Wasser. Der obere Säulenschicht (Kationenautauscher) tauscht nun die farblosen K + gegen H + Ionen aus, die orangefarbigen Dichromatione (2 CrO H + = Cr 2 O H 2 O!!) wandern bis zum Anionenaustascherschicht, werden dort festgehalten und gegen OH Ionen ausgetauscht. Nur Wasser (H + + OH ) verlässt die Säule. Den Austausch der farblosen K + Ionen kann man mit der Natriumhexanitrocobaltat(III) Reaktion bestätigt werden: In dem Effluat kann kein K + Ion mehr nachgewiesen werden. (siehe: 1.5.Woche, Versuch 2.2).
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