OptiView DAB IHC Detection Kit

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1 OptiView DAB IHC Detection Kit DAB Precipitate + Copper H2O2 DAB VERWENDUNGSZWECK Das OptiView DAB IHC Detection Kit (OptiView) ist ein indirektes Biotin-freies System zum Nachweis von Maus-IgG, Maus-IgM und Kaninchen-Primärantikörpern. Dieses Kit wurde zur Zielbestimmung in formalinfixierten, paraffineingebetteten Gewebeschnitten und gefrorenem Gewebe mittels Immunhistochemie (IHC) auf einem Färbeautomaten von VENTANA unter dem Lichtmikroskop entwickelt. Die klinische Auswertung jeglicher Gewebefärbung oder deren Fehlen muss durch morphologische Untersuchungen und korrekte Kontrollen vervollständigt Dieses Produkt sollte von einem qualifizierten Pathologen in Verbindung mit einer histologischen Untersuchung, klinisch relevanten Informationen und geeigneten Kontrollen interpretiert Dieses Produkt ist für die Verwendung in der In-vitro-Diagnostik (IVD) bestimmt. HRP Multimer Tissue HQ Linker Primary Antibody HQ HQ Target Antigen ZUSAMMENFASSUNG UND ERKLÄRUNG Abb. 1. OptiView DAB IHC Detection Kit Immunohistochemie (IHC) ist eine Methode, die in Laboren zur Diagnostik eingesetzt wird. Das zugrundeliegende Konzept der IHC ist die Lokalisierung von Antigenen in Gewebeschnitten mittels spezifischer Primärantikörper. Die so entstandene Antikörper- Antigen-Bindung muss durch eine Farbreaktion unter einem Lichtmikroskop oder unter Verwendung von Fluoreszenzmikroskopie sichtbar gemacht Der spezifische Primärantikörper kann das signalerzeugende Molekül enthalten und so eine direkte MATERIALIEN UND VERFAHREN Im Lieferumfang enthaltene Reagenzien Das OptiView DAB IHC Detection Kit enthält ausreichende Reagenzien für 250 Tests. Darstellung der Bindung ermöglichen. Alternativ dazu erfordern indirekte Ein 25-ml-Spender Darstellungsmethoden zusätzliche Schritte, um den spezifischen Antikörper zu lokalisieren OptiView Peroxidase Inhibitor enthält 3,0 % und ein Signal zu erzeugen. Bei den am häufigsten verwendeten Techniken der indirekten Wasserstoffperoxidlösung. Methoden werden ein gegen die Spezies des Primärantikörpers gerichteter Ein 25-ml-Spender OptiView HQ Universal Linker enthält einen Cocktail aus Tertiärantikörper sowie ein an einen Sekundärantikörper gebundenes Enzym mit einem HQ-markierten (HQ ist ein kovalent an die Ziegenantikörper entsprechenden Substrat-Chromogen-System verwendet. Durch diese Kombination gebundenes firmeneigenes Hapten) Antikörpern (Ziege-Antientsteht ein farbiges Präzipitat an den Stellen der spezifischen Antikörperbindung. Das Maus-IgG, Ziege-Anti-Maus-IgM und Ziege-Anti-Kaninchen) OptiView DAB IHC Detection Kit verwendet eine indirekte Methode zur Darstellung (<50 µg/ml) in einem Puffer, der Protein mit dem spezifischer an Antigene gebundener Antikörper durch Ablagerung eines braunen Konservierungsstoff ProClin 300 enthält. Präzipitats. Ein 25-ml-Spender OptiView HRP Multimer ist ein monoklonaler Anti-HQmarkierter VERFAHRENSPRINZIP HRP Maus-Tertiärantikörper (<40 µg/ml) in einem Puffer, der Protein mit dem Konservierungsstoff ProClin 300 Das OptiView DAB IHC Detection Kit weist spezifische Maus- und Kaninchenenthält. Primärantikörper nach, die in paraffineingebetteten oder gefrorenen Gewebeschnitten an Antigene gebunden sind. Der spezifische Antikörper wird durch einen spezifischen Ein 25-ml-Spender OptiView H2O2 enthält 0,04 % Wasserstoffperoxid in einer Sekundärantikörper lokalisiert, der durch einen enzymmarkierten Tertiärantikörper Phosphatpufferlösung. gebunden wird. Der Komplex wird dann mit einem Enzymfällungsprodukt sichtbar gemacht. Ein 25-ml-Spender OptiView DAB enthält 0,2 % 3,3 -Diaminobenzidin- Tetrahydrochlorid (DAB) in einer firmeneigenen Das OptiView DAB IHC Detection Kit verwendet einen Cocktail aus Sekundärantikörpern Stabilisierungslösung mit einem firmeneigenen zum Lokalisieren des gebundenen Primärantikörpers. Der Sekundärantikörper-Cocktail Konservierungsmittel. wird von einem enzymgebundenen Tertiärantikörper erkannt, der mit einem Wasserstoffperoxidsubstrat und einer 3,3 -Diaminobenzidin-Tetrahydrochlorid- Substratlösung (DAB) visualisiert wird, was zu einer braunen Ablagerung führt, die leicht unter dem Lichtmikroskop zu erkennen ist. Jeder Schritt wird über eine auswählbare Zeitdauer und Temperatur inkubiert. Nach Ablauf der Inkubationszeit werden die Schnitte Ein 25-ml-Spender OptiView Copper enthält Kupfersulfat (5 g/l) in einem Azetat- Puffer mit einem firmeneigenen Konservierungsmittel. mit einem Gerät der VENTANA BenchMark Series gespült, um ungebundene Chemikalien Rekonstitution, Mischung, Verdünnung, Titrierung zu entfernen. Anschließend wird Liquid Coverslip aufgetragen, um die Verdunstung der wasserhaltigen Reagenzien vom Objektträger zu verhindern. 1 Das Nachweiskit wurde für die Verwendung auf VENTANA BenchMark Series-Geräten Die Ergebnisse werden optimiert. Es ist keine Rekonstitution, Mischung, Verdünnung oder Titrierung der im Kit mithilfe eines Lichtmikroskops interpretiert und tragen so zur Differentialdiagnostik von enthaltenen Reagenzien erforderlich. pathophysiologischen Prozessen bei, die mit einem bestimmten Antigen zusammenhängen können oder auch nicht. Weiterführende Informationen finden Sie im entsprechenden Benutzerhandbuch. Eine weitere Verdünnung kann zu einer Abschwächung der Antigen-Färbung führen. Vorgenommene Änderungen müssen vom Benutzer validiert Abweichungen bei der Gewebeverarbeitung und den vorbereitenden Verfahren im Labor können zu signifikanten Abweichungen in den Ergebnissen führen. Weitere Informationen zu Kontrollen finden Sie im Abschnitt Qualitätskontrollverfahren / DE Rev A

2 Nicht im Lieferumfang enthaltene erforderliche Materialien und Reagenzien Die folgenden Reagenzien und Materialien sind nicht im Nachweiskit enthalten, aber können zur Färbung erforderlich sein: 1. Primärantikörper 2. Negatives Kontrollreagenz 3. Positive und negative Gewebekontrollen (empfohlene Typen entnehmen Sie bitte der Packungsbeilage des Antikörpers) 4. OptiView Amplification Kit 5. Protease 1, 2, und 3 (wie für die jeweiligen Anwendungen erforderlich) 6. Hematoxylin und Hematoxylin II Counterstain (wie für die jeweiligen Anwendungen erforderlich) 7. Bluing Reagent (wie für die jeweiligen Anwendungen erforderlich) 8. Reaction Buffer Concentrate (10X) 9. Cell Conditioning Solutions (CC1) und (CC2) (wie für die jeweiligen Anwendungen erforderlich) 10. Antibody Diluent (wie für die jeweiligen Anwendungen erforderlich) 11. EZ Prep Concentrate (10X)-Lösung 12. Liquid Coverslip (High Temperature) 13. Ethanol oder Reagenzalkohol für die Histologie 14. VENTANA BenchMark Series-Geräte 15. Objektträger (positiv geladen) 16. Trockenschrank mit der Leistung zur Aufrechterhaltung einer Temperatur von 60 C ±5 C 17. Barcode-Etiketten (geeignete Barcode-Etiketten für die negative Reagenzkontrolle und den Primärantikörper werden getestet) 18. Xylol für die Histologie 19. Deionisiertes oder destilliertes Wasser 20. Deckglas und Deckglas-Methode um Gewebe ausreichend abzudecken 21. Lichtmikroskop 22. Mildes Geschirrspülmittel Lagerung und Handhabung Bei 2 8 C lagern. Nicht einfrieren. Das Nachweiskit kann sofort nach der Entnahme aus dem Kühlschrank verwendet Um die sachgemäße Abgabe der Reagenzien und die Stabilität jedes Reagenzes zu erhalten, muss die Spender-Verschlusskappe nach Gebrauch wieder aufgesetzt und der Spender sofort in aufrechter Position in den Kühlschrank gestellt Jedes Nachweiskit ist mit einem Verfallsdatum versehen. Bei ordnungsgemäßer Aufbewahrung ist das Produkt bis zu dem auf dem Etikett angegebenen Verfallsdatum stabil. Das Produkt nach Ablauf des Verfallsdatums für die angegebene Lagermethode nicht mehr verwenden. Es gibt keine offensichtlichen Anzeichen bei Instabilität der Reagenzien. Aus diesem Grund müssen immer gleichzeitig positive und negative Kontrollgewebe zusammen mit unbekannten Proben gefärbt Bei Anzeichen von Reagenz-Instabilität den zuständigen Kundendienstmitarbeiter verständigen. Entnahme und Vorbereitung der Proben zur Analyse Formalinfixierte, paraffineingebettete Gewebe sind für den Gebrauch mit dem OptiView DAB IHC Detection Kit und den Geräten der VENTANA BenchMark Series geeignet (siehe Nicht im Lieferumfang enthaltene erforderliche Materialien und Reagenzien ). Zur Fixierung wird 10 % neutral-gepuffertes Formalin (NBF) empfohlen. 2 Unterschiedliche Ergebnisse können in Abhängigkeit von der Gewebeschnittdicke, dem Fixierungstyp, unvollständiger oder verlängerter Gewebefixierung oder anderer spezieller Prozesse, wie z. B. der Entkalkung von Knochenmarkpräparaten, auftreten. Jeder Schnitt muss die für den verwendeten Primärantikörper korrekte Stärke aufweisen (2 5 μm) und auf einen positiv geladenen Glasobjektträger aufgebracht Objektträger mit Gewebeschnitten können in einem 60 C ±5 C heißen Ofen mindestens 2 Stunden (und nicht länger als 24 Stunden) erhitzt Das Erhitzen der Objektträger dient dazu, das Gewebe nach dem Aufbringen auf den Objektträger zu trocknen und die Gewebeanhaftung am Glas zu verstärken. Die Erhitzungsgrenzwerte sind der Packungsbeilage des Primärantikörpers zu entnehmen. Übermäßige Erhitzung des Gewebes kann die Antigenmenge reduzieren. Gefrorene Schnitte in entsprechender Dicke (4 5 µm) für den verwendeten Primärantikörper schneiden, auf einen Glasobjektträger aufbringen und sofort zehn Minuten in kaltes Azeton (4 8 C) legen. Zytospin-Präparate sollten entsprechend standardmäßiger Zytozentrifugations- und Fixierungsmethoden hergestellt Die Schnitte sollten mindestens 30 Minuten, bestenfalls über Nacht, luftgetrocknet Entsprechendes Barcode-Etikett auf getrocknete Schnitte aufbringen. Korrekt fixierte und eingebettete Gewebe, die das Antigen exprimieren, sind stabil, wenn sie kühl (15 25 C) gelagert Im Clinical Laboratory Improvement Act (CLIA) von 1988, 42CFR (b) wird vorgeschrieben, dass das Labor die Objektträger mindestens zehn Jahre ab dem Untersuchungsdatum und Probenblöcke mindestens zwei Jahre ab dem Untersuchungsdatum aufbewahren muss. Jedes Labor sollte die Stabilität der Schnitte auf den Objektträgern für seine eigenen Verfahren und Lagerungsbedingungen validieren. WARNHINWEISE UND VORSICHTSMASSNAHMEN 1. Für die In-vitro-Diagnostik (IVD). 2. Das Konservierungsmittel ProClin 300 wird als Reizmittel eingestuft und kann eine Sensibilisierung durch Hautkontakt hervorrufen. Bei der Arbeit mit den Reagenzien angemessene Vorsichtsmaßnahmen treffen. Kontakt mit Augen, Haut und Schleimhäuten vermeiden. Handschuhe und entsprechende Schutzkleidung tragen. Eine Liste von Spendern, die dieses Konservierungsmittel enthalten, finden Sie im Abschnitt Materialien und Methoden. 3. Materialien menschlichen oder tierischen Ursprungs müssen entsprechend den Vorschriften für potentiell gefährliche Materialien behandelt und mit den notwendigen Vorsichtsmaßnahmen entsorgt 4. Bei der Arbeit mit den Reagenzien angemessene Vorsichtsmaßnahmen treffen. Kontakt mit Augen, Haut und Schleimhäuten vermeiden. Einatmung der Reagenzien vermeiden. Bei der Handhabung von krebserregenden oder toxischen Substanzen Einweg-Handschuhe und geeignete Schutzkleidung tragen. 5. Bei Kontakt der Reagenzien mit empfindlichen Körperteilen mit reichlich Wasser ausspülen. 6. Die Reagenzien werden in optimaler Verdünnung geliefert, eine weitere Verdünnung kann zu einem Nachlassen der Antigenfärbung führen. Vorgenommene Änderungen müssen vom Benutzer validiert Reagenzien-Spender aus mehreren Chargen des Produkts nicht miteinander mischen. 7. Mikrobielle Kontamination der Reagenzien vermeiden, da dies zu falschen Ergebnissen führen kann. 8. Bezüglich der vorschriftsmäßigen Entsorgung wenden Sie sich bitte an Ihre lokalen und/oder staatlichen Behörden. 9. Ergänzende Sicherheitsinformationen sind im Sicherheitsdatenblatt des Produkts und in der Gefahrenbezeichnungsliste unter erhältlich. GEBRAUCHSANWEISUNG Das OptiView DAB IHC Detection Kit wurde zur Verwendung auf Geräten der VENTANA BenchMark Series in Kombination mit VENTANA-Primärantikörpern und -Zubehör entwickelt. Die Parameter für die automatischen Verfahren können entsprechend dem im Benutzerhandbuch des Geräts beschriebenen Verfahren angezeigt, gedruckt und bearbeitet Die übrigen Betriebsparameter des Geräts sind werkseitig eingestellt worden. Die Färbeverfahren auf Geräten der VENTANA BenchMark Series werden nachfolgend beschrieben. Weitere Informationen und zusätzliche Protokolloptionen sind dem Benutzerhandbuch zu entnehmen. Ob bei einer Probe Vorbehandlungsbedingungen erforderlich sind, ist vom Antikörper abhängig. Anweisungen sind der Packungsbeilage des Antikörpers zu entnehmen. VENTANA BenchMark Series-Geräte 1. Die entsprechenden Barcode-Etiketten für das vorgesehene Protokoll anbringen. 2. Primärantikörperspender, die entsprechenden Spender des Nachweiskits und die erforderlichen Zusatzreagenzien auf das Reagenzienkarussell laden und auf den Färbeautomaten setzen. 3. Vorratsflüssigkeiten überprüfen und Abfallbehälter leeren. 4. Objektträger in den Färbeautomaten einsetzen. 5. Färbedurchlauf starten. 6. Nach Abschluss des Färbedurchlaufs Objektträger aus dem Färbeautomaten entnehmen / DE Rev A

3 Empfohlene Verfahren zur Geräte-Nachbehandlung 1. Objektträger in mildem Geschirrspülmittel abwaschen, um die Eindecklösung zu entfernen. 2. Objektträger gründlich mit destilliertem Wasser spülen, um das Spülmittel vollständig zu entfernen. 3. Dehydrieren, reinigen und Deckglas mit permanentem Eindeckmedium auflegen. Interpretation der Ergebnisse Verfahren zur Qualitätskontrolle Positive Gewebekontrolle Bei jedem Färbedurchlauf muss eine positive Gewebekontrolle mitlaufen. Bei einer optimalen Laborpraxis wird ein positiver Kontrollschnitt auf denselben Objektträger aufgetragen, auf dem sich das Patientengewebe befindet. Mit dieser Praxis kann festgestellt werden, ob ein primärer Antikörper oder ein anderes kritisches Reagenz fehlt und ob das Gerät ordnungsgemäß funktioniert. Ein Gewebe mit schwach positiver Positive Gewebekontrolle Färbung ist für eine optimale Qualitätskontrolle besser geeignet. Dieses Gewebe kann sich positiv als auch sich negativ färbende Zell- oder Gewebebestandteile enthalten und sowohl zur Positiv- als auch zur Negativkontrolle verwendet Die Kontrollprobe muss aus frischem Gewebe aus einer Autopsie, Biopsie oder einem chirurgischen Eingriff bestehen und so schnell wie möglich auf identische Weise wie die Probenschnitte präpariert oder fixiert Mit derartigem Gewebe können alle Schritte von der Gewebepräparierung bis zur Färbung kontrolliert Die Verwendung eines Kontrollschnitts, der auf andere Weise als das Testpräparat fixiert oder präpariert worden ist, bietet eine Kontrolle für alle Reagenzien und Verfahrensschritte, mit Ausnahme der Fixierung und Gewebepräparierung. Bekannte positive Gewebekontrollen dürfen nur zur Kontrolle der korrekten Leistung von verarbeitetem Gewebe und Testreagenzien, nicht als Hilfe bei der Erstellung einer Negative Gewebekontrolle spezifischen Diagnose von Patientenproben verwendet Wenn mit der positiven Gewebekontrolle keine positive Färbung nachgewiesen werden kann, gelten Ergebnisse mit den Testpräparaten als ungültig. Negative Gewebekontrolle Für die negative Gewebekontrolle kann das gleiche Gewebe verwendet werden wie für die Positivkontrolle. Die Vielzahl der in den meisten Gewebeschnitten vorkommenden Zellarten bietet Stellen zur internen Negativkontrolle, die allerdings vom Benutzer überprüft werden müssen. Aufgabe der nichtfärbenden Komponenten ist es, das Fehlen spezifischer Färbungen nachzuweisen und auf Hintergrundfärbung hinzuweisen. Bei spezifischer Färbung der negativen Gewebekontrolle müssen die mit den Patientenproben erzielten Ergebnisse als ungültig gewertet Unerklärliche Abweichungen Patientengewebe Abweichungen bei Kontrollergebnissen, für die es keine stichhaltige Erklärung gibt, müssen umgehend dem zuständigen Kundendienstvertreter vorgelegt Wenn die Ergebnisse der Qualitätskontrolle die Spezifikationen nicht erfüllen, sind die Patientenergebnisse ungültig. Siehe Abschnitt Fehlerbehebung in dieser Beilage. Problem identifizieren und korrigieren, anschließend die Patientenproben wiederholen. Negative Reagenzkontrolle Für jede Probe muss eine negative Reagenzkontrolle mitlaufen, um die Interpretation der Ergebnisse zu unterstützen. Eine negative Reagenzkontrolle wird anstelle der Primärantikörperkontrolle zur Bewertung von unspezifischer Färbung durchgeführt. Der Objektträger sollte mit Negative Control Mouse bzw. Negative Control Rabbit gefärbt Bei Verwendung einer anderen negativen Reagenzkontrolle eine Verdünnung mit Antibody Diluent im selben Verhältnis wie für das Primärantikörper-Antiserum vornehmen. EINSCHRÄNKUNGEN Alternativ zu den oben beschriebenen negativen Reagenzkontrollen kann das Verdünnungsmittel alleine verwendet Die Inkubationsdauer für die negative Allgemeine Einschränkungen Reagenzkontrolle sollte der für die Primärantikörper geltenden Inkubationsdauer entsprechen. Bei Verwendung von verschiedenen Antikörpern auf seriellen Gewebeschnitten kann eine negative Reagenzkontrolle auf einem Objektträger als negative oder nicht-spezifische bindende Hintergrundkontrolle für andere Antikörper verwendet Test-Verifizierung Vor der ersten Verwendung eines Primärantikörper- oder Färbesystems in einem Diagnoseverfahren muss die spezifische Wirksamkeit des Antikörpers überprüft Zu diesem Zweck wird der Primärantikörper auf einer Reihe von Gewebeproben mit bekannten IHC-Merkmalen getestet, die bekannte positive und negative Gewebe enthalten müssen (siehe dazu die Verfahren zur Qualitätskontrolle in der Packungsbeilage des Primärantikörpers und die Empfehlungen zur Qualitätskontrolle des College of American Pathologists Laboratory Accreditation Program, die Anatomic Pathology Checklist 3 bzw. die CLSI Approved Guideline 4 ). Die Verfahren zur Qualitätskontrolle müssen für jede neue Antikörpercharge und bei jeder Änderung der Versuchsparameter wiederholt Die im Abschnitt Leistungsmerkmale des Primärantikörpers aufgeführten Gewebe sind für die Prüfung der Versuchsanordnung geeignet. Das OptiView DAB IHC Detection Kit bewirkt, dass sich ein braunes Reaktionsprodukt an den Stellen ablagert, an denen das Antigen von dem Primärantikörper lokalisiert wurde. Ein qualifizierter, mit IHC-Verfahren vertrauter Pathologe muss erst die Kontrollen auswerten und das gefärbte Produkt qualifizieren, bevor die Ergebnisse interpretiert werden können. Das Färben von Negativkontrollen muss zuerst festgestellt werden, und diese Ergebnisse mit dem gefärbten Material verglichen werden, um sicherzustellen, dass das erzeugte Signal nicht der Grund für nichtspezifische Interaktionen ist. Die gefärbte positive Gewebekontrolle muss zuerst untersucht werden, um zu gewährleisten, dass alle Reagenzien ordnungsgemäß funktionieren. Ein ordnungsgemäß gefärbtes Reaktionsprodukt in den Zielzellen ist Anzeichen für eine positive Reaktionsfähigkeit. Abhängig von der Inkubationszeit und der Wirkungsstärke des verwendeten Hämatoxylins führt die Gegenfärbung zu einer hell- bis dunkelblauen Färbung der Zellkerne. Übermäßige oder unvollständige Gegenfärbung kann die korrekte Interpretation der Ergebnisse beeinträchtigen. Wenn mit der positiven Gewebekontrolle keine entsprechende positive Färbung nachgewiesen werden kann, müssen Ergebnisse mit den Testpräparaten als ungültig bewertet Die negative Gewebekontrolle wird nach der positiven Gewebekontrolle untersucht, um zu überprüfen, ob die spezifische Anfärbung des Zielantigens mit dem Primärantikörper korrekt erfolgt ist. Das Fehlen einer spezifischen Färbung im negativen Kontrollgewebe bestätigt das Fehlen der Antikörper-Kreuzreaktivität an Zellen oder Zellbestandteilen. Bei spezifischer Färbung der negativen Gewebekontrolle müssen die mit den Patientenproben erzielten Ergebnisse als ungültig bewertet Unspezifische Färbungen weisen, falls vorhanden, ein diffuses Erscheinungsbild auf. In Gewebeschnitten mit exzessiver Formalinfixierung kann es zum sporadischen Auftreten von leichter Färbung von Bindegewebe kommen. Zur Interpretation der Färbeergebnisse sollten intakte Zellen verwendet Nekrotische oder degenerierte Zellen färben sich oft unspezifisch. Die Untersuchung der Patientenproben erfolgt zum Schluss. Die Intensität der positiven Färbung muss unter Berücksichtigung der unspezifischen Hintergrundfärbungen der negativen Reagenzkontrolle bewertet Wie bei jedem immunhistochemischen Test bedeutet ein negatives Ergebnis lediglich, dass das fragliche Antigen nicht nachgewiesen wurde, nicht jedoch, dass das Antigen in den untersuchten Zellen/Geweben nicht vorhanden ist. Wenn erforderlich, Antikörperpanel als Hilfe bei der Identifikation von falsch negativen Reaktionen verwenden. Bei der Interpretation aller immunhistochemischen Ergebnisse sollte die Morphologie aller Gewebeproben zusätzlich auch mit Hilfe eines mit Hämatoxylin und Eosin gefärbten Schnittes untersucht Die morphologischen Befunde der Patientenproben und die entsprechenden klinischen Daten müssen von einem qualifizierten Pathologen interpretiert 1. IHC ist ein aus mehreren Schritten bestehendes Diagnoseverfahren, das hinsichtlich der Wahl der geeigneten Reagenzien und Gewebeproben sowie bezüglich Fixierung, Aufbereitung und Präparation der IHC-Objektträger und der Interpretation der Färbeergebnisse eine besondere Schulung erfordert. 2. Die Färbeergebnisse eines Gewebes sind von sachgemäßer Behandlung und Aufbereitung des Gewebes vor dem Färben abhängig. Unsachgemäßes Fixieren, Einfrieren, Auftauen, Waschen, Trocknen, Erhitzen oder Schneiden oder eine Kontamination mit anderen Geweben oder Flüssigkeiten können zu Artefakten, Antikörperinfizierung oder zu falsch-negativen Ergebnissen führen. Unregelmäßige Ergebnisse können auf Abweichungen bei den Fixierungs- und Einbettungsmethoden oder auf Unregelmäßigkeiten im Gewebe selbst beruhen. 3. Übermäßige oder unvollständige Gegenfärbung kann die korrekte Interpretation der Ergebnisse beeinträchtigen / DE Rev A

4 4. Die klinische Interpretation jeglicher Gewebefärbung oder deren Fehlen muss anhand der Krankengeschichte, Morphologie und sonstiger histopathologischer Kriterien erfolgen. Die klinische Interpretation der Gewebefärbung oder deren Fehlen muss durch morphologische Untersuchungen und korrekte Kontrollen sowie andere diagnostische Tests vervollständigt Es obliegt der Verantwortung eines qualifizierten Pathologen, sich zur Auswertung der eingefärbten Präparate mit den zur Färbung verwendeten Antikörpern, Reagenzien und Methoden vertraut zu machen. Die Färbung muss in einem zertifizierten, lizenzierten Labor unter der Aufsicht eines Pathologen durchgeführt werden, der für die Überprüfung der gefärbten Objektträger sowie die Gewährleistung der adäquaten positiven und negativen Kontrollen verantwortlich ist. 5. Ventana Medical Systems, Inc. liefert Antikörper und Reagenzien in der optimalen Konzentration zur Verwendung gemäß Gebrauchsanweisung. Abweichungen von den empfohlenen Testverfahren können die erwarteten Ergebnisse ungültig machen. Es müssen entsprechende Kontrollen durchgeführt und protokolliert Anwender, die von den empfohlenen Testverfahren abweichen, tragen die Verantwortung für die Interpretation der Patientenergebnisse. 6. Bei Geweben, die im Vorfeld nicht getestet wurden, können unerwartete Reaktionen mit den verwendeten Reagenzien auftreten. Aufgrund der biologischen Schwankungen bei Antigenexpression in Neoplasmen oder anderen pathologischen Geweben können unerwartete Reaktionen auch bei getesteten Gewebegruppen nicht vollkommen ausgeschlossen 5,6 Bei dokumentierten unerwarteten Reaktionen bitte den zuständigen Kundendienstvertreter verständigen. 7. Gewebeproben von Personen mit Hepatitis B-Infektion und Proben mit dem Hepatitis B-Oberflächenantigen (HBsAg) können bei Verwendung von Meerrettich- Peroxidase zu unspezifischer Färbung führen Bei der Verwendung von normalem Serum aus derselben Tierquelle wie das sekundäre Antiserum können in Blockierschritten durch Auto-Antikörper oder natürliche Antikörper falsch-negative oder falsch-positive Ergebnisse verursacht 9. Falsch positive Ergebnisse können durch nicht-immunologische Bindung von Proteinen oder Substratreaktionsprodukten entstehen. Sie können ebenfalls durch Pseudoperoxidaseaktivität (Erythrozyten) oder endogene Peroxidase hervorgerufen 10. Wie bei jedem immunhistochemischen Test bedeutet ein negatives Ergebnis lediglich, dass das fragliche Antigen nicht nachgewiesen wurde, nicht jedoch, dass das Antigen in den untersuchten Zellen/Geweben nicht vorhanden ist. Spezifische Einschränkungen 1. Jeder Schritt des Nachweiskit-Verfahrens wurde für VENTANA BenchMark Series- Geräte optimiert und ist werkseitig eingestellt worden. Aufgrund von Schwankungen bei der Fixierung und Verarbeitung kann es erforderlich sein, die Primärantikörper- Inkubationszeit bei einzelnen Proben zu erhöhen oder zu verringern. Die Inkubationszeit von Primärantikörpern hängt von dem Grad der Gewebefixierung ab und kann sich über 4 bis 120 Minuten erstrecken. Weiterführende Informationen finden Sie in Immunohistochemistry Principles and Advances 9 bzw. Immunomicroscopy: A Diagnostic Tool for the Surgical Pathologist Es wurden keine Primärantikörper von VENTANA für den Gebrauch mit dem OptiView DAB IHC Detection Kit optimiert. Die Validierung der Primärkörperfärbung mit OptiView obliegt der Verantwortung des Anwenders. 3. In Kombination mit den Primärantikörpern und dem Zubehör von Ventana lokalisiert das Nachweiskit Antigene, welche die routinemäßige Formalinfixierung sowie die Gewebeaufbereitung und den Gewebeschnitt überlebt haben. 4. Andere als die angegebenen Inkubationszeiten und Temperaturen können zu fehlerhaften Ergebnissen führen. Vorgenommene Änderungen müssen vom Benutzer validiert 5. Zur Fixierung von OptiView wird 10 % neutral-gepuffertes Formalin (NBF) empfohlen. Die Verwendung von Modified Davidson s als Fixiermittel kann zu ungültigen Färbeergebnissen führen. LEISTUNGSMERKMALE Das OptiView DAB IHC Detection Kit ist zur Verwendung mit primären Maus- und Kaninchen-Antikörpern bestimmt. Das Produkt wurde mit einer Vielzahl von primären Antikörpern auf mehreren Gewebetypen getestet, wobei die Protokolle der Packungsbeilagen der jeweiligen Antikörper auf VENTANA BenchMark Series-Geräten mit VENTANA-Bulk- und Zusatzreagenzien verwendet wurden, falls nicht anders angegeben. Testumfang: 1. Spezifizität und Sensivität Spezifizitätstests zum spezifischen Nachweis von primären Maus- und Kaninchenantikörpern sowie akzeptabler nicht-spezifischer Hintergrundfärbung, um eine eindeutige Interpretation der positiven und negativen Ergebnisse zu gewährleisten. Sensitivitätstests zum Nachweis von primären Antikörpern, die an eine geringe Menge von Antigenen gebunden sind und ein geeignetes Färbemuster aufweisen. 2. Wiederholpräzision Intra- und Inter-Wiederholpräzision des Färbelaufs Intra- und Inter-Wiederholpräzision der Plattform Die Gewebeproben wurden in allen Fällen getestet und für die Verwendung bei IHC-Tests und bei morphologischen Zellfärbungen als tauglich befunden. Alle Studien erfüllten ihre Akzeptanzkriterien. FEHLERBEHEBUNG 1. Wenn bei der Positivkontrolle eine zu schwache Färbung auftritt, müssen andere Positivkontrollen desselben Durchlaufs überprüft werden, um festzustellen, ob es an dem Primärantikörper oder an einem der üblichen Sekundärreagenzien liegt. 2. Falls die positive Kontrolle negativ ist, sollte sie überprüft werden, um sicherzugehen, dass der Objektträger das korrekte Barcode-Etikett aufweist. Wenn der Objektträger richtig etikettiert ist, müssen andere Positivkontrollen desselben Färbedurchlaufs geprüft werden, um festzustellen, ob es an dem Primärantikörper oder an einem der üblichen Sekundärreagenzien liegt. Gewebe können unsachgemäß gewonnen, fixiert oder entparaffiniert worden sein. Entnahme, Lagerung und Fixierung der Gewebeproben müssen sachgemäß ausgeführt 3. Wenn das Paraffin nicht vollständig entfernt wurde, kann die Färbung ausbleiben. Das Entparaffinierungsverfahren sollte in diesem Fall wiederholt 4. Bei zu intensiver Antikörperfärbung den Durchlauf mit um je vier Minuten gekürzter Inkubationsdauer des Primärantikörpers wiederholen, bis die gewünschte Farbintensität erreicht ist. Außerdem können die Inkubationszeiten von Linker und Multimer zur weiteren Optimierung des Protokolls angepasst 5. Wenn die Gewebeschnitte vom Objektträger abfließen, Objektträger prüfen, um zu gewährleisten, dass sie positiv geladen sind. 6. Hinweise zur Fehlerbehebung sind in der Gebrauchsanweisung, dem Benutzerhandbuch des Geräts oder bei dem zuständigen Kundendienstvertreter erhältlich. 7. Wenn ein Reagenzspender keine Flüssigkeit abgibt, prüfen Sie, ob die Aktivierungskammer oder der Meniskus Fremdkörper enthält, wie z. B. Fasern oder Ablagerungen. Ist der Spender blockiert, setzen Sie ihn nicht ein, sondern kontaktieren Sie Ihren zuständigen Kundendienstvertreter. Reaktivieren Sie andernfalls den Spender, indem Sie ihn über einen Abfallbehälter halten, die Düsenkappe entfernen und von oben auf den Spender drücken. 8. Wird der Peroxidase Inhibitor nicht vor bzw. nach dem Primärantikörper ausgewählt, kann Endogene-Peroxidase-Aktivität auftreten. In der Standardeinstellung findet keine Applikation statt. Der Anwender muss bei der Erstellung eines Protokolls ggf. den Zeitpunkt der Peroxidase Inhibitor-Applikation auswählen. 9. Als Folge von proteolytischer Spaltung kann eine unerwünschte Färbung des Plasmas und der Mastzellen auftreten. Die Hintergrundfärbung der negative Gewebekontrolle sollte mit dem positiv gefärbten Kontrollergebnis verglichen 6 LITERATUR 1. Elias JM, Gown AM, Nakamura RM, Wilbur DC, Herman GE, Jaffe ES, Battifora H, Brigati DJ. Quality control in immunohistochemistry. Report of a workshop sponsored by the Biological Stain Commission. Am J Clin Pathol. 1989;92(6): Sheehan DC, Hrapchak BB. Theory and Practice of Histotechnology. 2nd edition. St. Louis, MO: The C.V. Mosby Company; College of American Pathologists Laboratory Accreditation Program, Anatomic Pathology Checklist, / DE Rev A

5 4. Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI) formerly NCCLS. Quality Assurance for Immunocytochemistry: Approved Guideline. CLSI document MM4-A (ISBN ). CLSI, 940 West Valley Road, Suite 1400, Wayne, PA USA, Herman GE, Elfont EA. The taming of immunohistochemistry: the new era of quality control. Biotech Histochem. 1991;66(4): Hautzer NW, Wittkuhn JF, Elliott-McCaughey WT. Trypsin Digestion in Immunoperoxidase Staining. Jour of Histochem and Cytochem. 1980;28: Omata M, Liew CT, Ashcavai M, Peters RL. Nonimmunologic binding of horseradish peroxidase to hepatitis B surface antigen. A possible source of error in immunohistochemistry. Am J Clin Pathol. 1980;73(5): Nadji M, Morales AR. Immunoperoxidase: part 1. The technique and its pitfalls. Lab Med. 1983;14: Roche PC, Hsi ED. Immunohistochemistry-Principles and Advances. Manual of Clinical Laboratory Immunology, 6th edition. In: NR Rose, ed. ASM Press; Taylor C, Cote RJ. Immunomicroscopy: A Diagnostic Tool for the Surgical Pathologist. 2nd Edition. Philadelphia, PA: W.B. Saunders Company; GESCHÜTZTE WARENZEICHEN BENCHMARK, OptiView, VENTANA und das VENTANA-Logo sind Warenzeichen von Roche. Alle anderen Warenzeichen sind Eigentum der jeweiligen Inhaber. Ventana gewährt dem Käufer eine Einzelanwenderlizenz gemäß den US-Patenten Nr , und und ihren ausländischen Entsprechungen. KONTAKT Ventana Medical Systems, Inc E. Innovation Park Drive Tucson, Arizona USA (USA) Roche Diagnostics GmbH Sandhofer Strasse 116 D Mannheim Germany / DE Rev A