I. Zusammenfassung 1 I. Summary 3. II. Einleitung 5

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1 Inhaltsverzeichnis I. Zusammenfassung 1 I. Summary 3 II. Einleitung 5 1. Enterohämorrhagische Escherichia coli Krankheitsverauf und Epidemiologie Shiga-Toxine Bau und zelluläre Wirkungsweise der Shiga-Toxine Die Rolle von Shiga-Toxinen in der Pathogenese Genetische Organisation und Regulation der Shiga-Toxine Bildung von attaching-and-effacing -Läsionen Weitere charakteristische EHEC-Virulenzfaktoren Konstruktion von bakteriellen Lebendvakzinen Prinzip von Attenuierung und Fremdantigenpräsentation Möglichkeiten der Attenuierung durch das Ausschalten von Regulatorgenen Entwicklung von Impfstoffen gegen EHEC Zielsetzung der Arbeit 23 III. Material und Methoden Material Bakterienstämme Plasmide Oligonukleotide Bakterielles Toxin Antikörper DNA- und Protein-Größenmarker Medien und Nährböden Chemikalien, Enzyme, Kits, Geräte und Sonstiges Häufig verwendete Puffer und Lösungen Methoden Isolierung von Plasmid-DNA aus E. coli Kleiner Maßstab (DNA-Reinigung mit Diatomeenerde) Mittlerer Maßstab (QIAGEN) 36

2 2.2 Isolierung von chromosomaler DNA aus E. coli Phenolisierung von DNA Alkoholische Fällung von DNA Konzentrationsbestimmung von DNA und RNA Spaltung von DNA mit Restriktionsendonukleasen Agarose-Gelelektrophorese zur Trennung von DNA-Fragmenten Elution von DNA aus Agarosegelen (Geneclean-Kit, Bio 101/Dianova) Dephosphorylierung von DNA-Fragmenten DNA-Ligation PCR PCR mit dem Gibco BRL Supermix PCR mit der DAp GOLDSTAR-Polymerase Klonierung von PCR-Produkten (Sure-clone-Kit, Pharmacia Biotech) Automatisierte Sequenzierung von Plasmid-DNA nach der Kettenabbruch-Methode Herstellung kompetenter E. coli-zellen und Transformation Kompetente Zellen durch CaCl 2 -Behandlung und Hitzeschock-Transformation Kompetente Zellen für die Elektroporation und Elektrotransformation Plasmidtransfer durch Konjugation von E. coli Donor- und Rezipientenstämmen Konstruktion von isogenen EHEC-Mutanten unter Benutzung von Suizidvektoren durch Genaustausch mittels Doppelcrossover Integration eines Plasmids basierend auf einem Suizidvektor ins Chromosom (Einzelcrossover) Induktion eines 2. Crossovers Radioaktive Kolonie-Hybridisierung Transfer von Kolonien auf Nylonmembran Radioaktive Markierung einer DNA-Sonde mit dem Random Primers DNA Labelling System (Gibco BRL) Kolonie-Hybridisierung Nichtradioaktive Southern Hybridisierung Southern Blot mit dem VakuGene Blotter (Pharmacia LKB) Nichtradioaktive Markierung einer DNA-Sonde und Hybridisierung (ECL-Kit, Amersham) Isolierung von Gesamt-RNA aus E. coli Radioaktive Northern-Hybridisierung RNA-Gelelektrophorese 47

3 RNA-Transfer durch Kapillarblot Radioaktive Markierung von Oligonukleotiden und Hybridisierung Gewinnung von Gesamtzellysaten durch Lyse mit Laemmli-Puffer aus E. coli Gewinnung von Gesamtzellysaten für Typ 1-Fimbrien-Westernblot durch saure Fimbriendissoziation Hitzeextraktion von Fimbrien Fimbriendissoziation mit Hilfe von Guanidium-Hydrochlorid Isolation von Membranproteinen aus E. coli Quantifizierung von Proteinen Bio-Rad Protein-Assay Proteinquantifizierung nach Markwell Auftrennung von Proteinen in der SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese Auftrennung von Proteinen in der Tricin-SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese Westernblot (Promega ProtoBlot Immunoscreening System) Immuno-Dotblot Coomassie-Färbung von Proteingelen Silberfärbung von Proteingelen Induktion von Bakteriophagen durch Mitomycin C- oder UV-Licht-Behandlung von Bakterienkulturen Isolation von Shiga-Toxin aus Bakterienkulturen Herstellung von Periplasma-Extrakten Minimal-Maßstab für ELISA-Toxinquantifizierung ml-maßstab für Westernblot Stx2-Aufkonzentrierung durch-ammoniumsulfatfällung Quantifizierung von Shiga-Toxin 2 im Toxin-Sandwich-ELISA Quantifizierung von Shiga-Toxin 2 im [ 3 H]Leucin-Inkorporations-Assay Zellkultur Anzüchten von Gewebekulturzellen Passagieren von Gewebekulturzellen Bestimmung der Zelldichte Einfrieren und Aufbewahrung von Gewebekulturzellen Zytotoxizitätsmessung durch [ 3 H]Leucin-Inkorporation Phagen-Plaque-Assay Isolation von lysogenisierten E. coli-stämmen Indirekte Bakteriophagenquantifizierung durch relativ quantitative PCR 59

4 2.40 Transposonmutagenese lysogener Bakteriophagen in E. coli mit dem Transposon Tn10d-Cam Bestimmung der Aktivität von alkalischer Phosphatase (PhoA) im PhoA-Assay Schnelles PhoA-Screening der C600(933W)-Transposonmutanten Motilitätstest auf Schwärmagarplatten Mannose-sensitive Hefeagglutination Nachweis der Häminverwertung Nachweis von Enterohämolysin 61 IV. Ergebnisse Einfluß eines phagenkodierten Faktors auf die Expression von stx 2 im E. coli K-12 Stamm C600(933W/pADR-28) Konstruktion von Transposonmutanten des Bakteriophagen 933W aus dem E. coli K-12 Stamm C600(933W) Phänotypische und genotypische Charakterisierung der 933W-Transposonmutanten Vergleich von zell- und überstandsassoziierten PhoA-Aktivitäten in den 933W- Transposonmutanten Vergleich der Produktion von Stx2 in den 933W-Transposonmutanten Vergleich der Produktion von Phagenpartikeln in den 933W-Transposonmutanten Lokalisation der Transposons Nähere Charakterisierung der Phagentransposonmutante SF Charakterisierung von Reinfektantenstämmen mit dem Phagen aus E. coli SF Klonierung und Sequenzierung der Transposonintegrationsstelle im Phagen des E. coli-stammes SF Komplementation der Transposonmutante SF Konstruktion und Charakterisierung einer stx 2 -Mutante im E. coli-stamm O157:H Konstruktion des Plasmids ptuv Konstruktion der EHEC stx 2 -Mutante TUV Genotypische Charakterisierung der EHEC stx 2 -Mutante TUV Phänotypische Charakterisierung der EHEC stx 2 -Mutante TUV Charakterisierung des Stx2A-B Fusionsproteins Vergleich der in vivo-virulenz von enterohämorrhagischen E. coli und isogenen stx 2 - und reca-mutanten 99

5 4. Konstruktion und Charakterisierung einer leux-mutante im E. coli-stamm O157:H Konstruktion des Plasmids pflx Konstruktion des leux-negativen EHEC-Stamms Genotypische Charakterisierung des leux-negativen EHEC-Stamms Phänotypische Charakterisierung des leux-negativen EHEC-Stamms Einfluß der trna Leu 5 auf die Schwärmaktivität und die Flagellenproduktion Einfluß der trna Leu 5 auf die Siderophorproduktion Einfluß der trna Leu 5 auf die Produktion eines mit Typ 1-Fimbrien-spezifischen Antiserum kreuzreaktiven Antigens Einfluß der trna Leu 5 auf die Anwesenheit von Membranproteinen Einfluß der trna Leu 5 auf die Häminverwertung Einfluß der trna Leu 5 auf die Stx2-Produktion Einfluß der trna Leu 5 auf die Enterohämolyse Einfluß der trna Leu 5 auf die Intiminproduktion Einfluß der trna Leu 5 auf die in vivo-virulenz im Mäusemodell Bestimmung des Gehalts an trna Leu 5 -spezifischen Codons in verschiedenen EHEC-Virulenzfaktoren 121 V. Diskussion Charakterisierung eines putativen phagenkodierten stx 2 -regulatorischen Faktors Attenuierung von enterohämorrhagischen Escherichia coli Attenuierung von EHEC durch die Deletion des Virulenzfaktors stx Attenuierung von EHEC durch die Deletion des Regulators reca 136 Leu 2.3 Attenuierung von EHEC durch das Ausschalten der trna Ausblick 149 VI. Anhang Plasmide Sequenzen Plasmid pflx1, Insertsequenz: leux aus EHEC O157:H Plasmid ppsr1, Insertsequenz: ORF L0065 aus EHEC O157:H7 EDL933 φ 933W Literaturverzeichnis Abkürzungen 185

6 5. Publikationen und Präsentationen Lebenslauf 189