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1 BIO-FLASH anti-hcv Tests BIO-FLASH anti-hcv ist ein vollautomatisiertes, chemolumineszentes, zweistufiges Immunassay für die qualitative Bestimmung von IgG-Antikörpern gegen das Hepatitis C Virus (HCV) im humanen Serum und Plasma mit dem Instrument BIO-FLASH. Zusammenfassung Hepatitis C ist eine Virusinfektion der Leber, die als parental übertragbare nicht-a und nicht B Hepatitis bezeichnet wurde, bis 1989 der Erreger identifiziert wurde. Die Entdeckung und Charakterisierung des Hepatitis C Virus (HCV) führte dazu, dass seine bedeutende Rolle in Sachen Hepatitis in Folge von Transfusionen und seine Neigung zu persistenter Infektion 1 zu führen, erkannt wurde. Der Hepatitis C Virus (HCV) ist ein umhüllter, einzelsträngiger, positivsträngiger RNA-Virus. Der Virus infiziert Zellen der Leber und kann zu schweren Leberentzündungen mit dauerhaften Schädigungen führen. 2 Die Krankheit beginnt in der Regel schleichend mit Anorexie, vagen Bauchschmerzen, Übelkeit und Erbrechen, Fieber und Müdigkeit und geht bei 25% der Patienten in Gelbsucht über. Von den mit HCV infizierten Patienten erholen sich ca. 40% vollständig, die übrigen jedoch, unabhängig davon, ob sie Symptome aufweisen oder nicht, werden chronische Träger. Von diesen entwickeln 20% eine Zirrhose. Bis zu 20% der Patienten, die Zirrhose entwickeln, bekommen Leberkrebs. 3,4 HCV ist eine Hauptursache für akute Hepatitis und chronische Lebererkrankungen, einschließlich Zirrhose und Leberkrebs. Weltweit sind etwa 170 Millionen Menschen chronisch mit HCV infiziert und jedes Jahr kommen 3 bis 4 Millionen Neuinfizierte hinzu. HCV wird hauptsächlich über den direkten Kontakt mit menschlichem Blut übertragen. Die Hauptursachen für HCV-Infektionen weltweit sind die Verwendung unkontrollierter Bluttransfusionen und die Wiederverwendung von Nadeln und Spritzen, die nicht entsprechend sterilisiert wurden. 5 HCV-Antikörper können erst Wochen nach der Infektion festgestellt werden, wodurch eine lange Zeitspanne von Seronegativität und potenzieller Infektiosität gegeben ist. 6 Prinzip Werden in der Probe, nachdem die paramagnetischen Mikropartikel von BIO-FLASH anti-hcv mit der Probe vermischt und inkubiert wurden, anti-hcv-antikörper festgestellt, so binden diese an die mit dem spezifischen HCV-Antigen überzogenen Mikropartikel. Nach magnetischer Trennung und einem Waschvorgang, um Reste der Probe zu beseitigen, wird ein Tracer zugegeben, der aus einem isoluminol-markierten Anti-Human-IgG-Antikörper besteht und sich an die HCV-IgG-Antikörper bindet, die von den Mikropartikeln eingefangen wurden. Nach einem zweiten Durchgang mit Inkubation, magnetischer Trennung und Waschvorgang werden die Reagenzien zugegeben, die die chemolumineszente Reaktion auslösen. Das Luminometer von BIO-FLASH misst das abgegebene Licht als relative Lichteinheiten (RLU), die direkt proportional zur Konzentration des Anti-HCV-IgG der Probe sind. BIO-FLASH nutzt eine Methode zur Datenreduktion mit Anpassung an eine 4-Parameter-logistische Kurve (4PLC), um eine Masterkalibrationskurve zu erzeugen. Diese Kurve ist vordefiniert, hängt von der Charge ab und wird in dem Instrument durch den Strichcode der Kassette eingelesen. Mit der Messung der Kalibratoren (die in einem separaten Kit vertrieben werden) verwandelt sich die vordefinierte Masterkalibrationskurve in eine neue instrumentenspezifische Kalibrationskurve. Die Konzentrationen der Kalibratoren sind in den Strichcodes der Kalibratorenröhrchen enthalten. Reaktionsschema: HERVORGEHOBENE ÄNDERUNGEN LESEN Aktivatoren (Triggers) RLU Magnetisches Partikel Probe Tracer Lichtemission

2 Komponenten Reagenzkartusche Das Kit BIO-FLASH anti-hcv enthält eine Reagenzkassette für 100 Auswertungen (REF ). Hinweis: Das Design der Kassette ist patentgeschützt (US D565,741 / Design CE ) Aufbau der Reagenzkassette: Die Kassette besteht aus 4 Ampullen mit folgendem Inhalt: A. 1 zylindrische Ampulle mit einer Lösung mit Mikropartikeln, die mit dem rekombinanten HCV- Antigenen überzogen sind, die HCV-Epitope darstellen: Core, NS3, NS4 und NS5. B. 1 Ampulle Assay-Puffer. Enthält < 0,1% Natriumazid und 1,0% Triton X-100. C. 1 opake Ampulle mit Tracer, der aus Isoluminolmarkiertem monoklonalem Maus Anti-Human-IgG besteht. Enthält < 0,1% Natriumazid und 8% Ethylenglykol. D. 1 Ampulle Probenverdünnungsmittel. Enthält < 0,1% Natriumazid. Vorbereitung Siehe Abbildung unten. Kassette: Die Mikropartikel sedimentieren während Transport und Lagerung, weshalb sie zur Verteilung erneut gemischt werden müssen. Kippen Sie die Kassette vor dem ersten Gebrauch 30 Mal vorsichtig hin und her, ohne dass dabei Schaum entsteht (die Luftblasen können dazu führen, dass die Flüssigkeitssensoren des Instruments falsche Ergebnisse liefern). Stellen Sie sicher, dass die Mikropartikel sich vollständig verteilt haben. Ist dies nicht der Fall, kippen Sie die Kassette weiter hin und her, bis Sie sich vollständig verteilt haben. Wenn die Mikropartikel nicht resuspendieren oder Sie feststellen, dass der Reagenzbehälter beschädigt ist, VERWENDEN SIE DIE KASSETTE NICHT. Haben sich die Mikropartikel verteilt, dann stellen Sie die Kassette auf eine feste Oberfläche und entfernen Sie vorsichtig die rote Transportsicherung. Lassen Sie die Kassette auf der festen Oberfläche stehen, drücken Sie die zwei Laschen, die sich seitlich an der Behälterkappe (graues Teil) befinden, zusammen und drücken Sie so lange auf den oberen Kassettenteil, bis er blockiert. Die Laschen sind nicht mehr sichtbar, wenn dies der Fall ist. Die geöffnete Kassette nicht umdrehen. Lassen Sie die Kassette 5 Minuten stehen, bevor Sie sie in das Instrument einsetzen. Wenn die Kassette eingesetzt ist, mischt das Instrument den Inhalt automatisch und in periodischen Intervallen.

3 Vorsichtsmaßnahmen Die Reagenzien BIO-FLASH sind für die IN VITRO-Diagnostik bestimmt. Für den ausschließlichen Gebrauch durch Fachpersonal. Assay-Puffer enthält <0,1% Natriumazid und 1,0% Triton X-100. Nicht schlucken (R22). Bei versehentlicher Einnahme einen Arzt aufsuchen (S46). Der Tracer enthält <0,1% Natriumazid und 8,0% Ethylenglykol. Nicht schlucken (R22). Bei versehentlicher Einnahme einen Arzt aufsuchen (S46). Das Natriumazid kann mit Rohren und Abflüssen aus Blei oder Kupfer reagieren und dadurch hochexplosive Metall-Azide bilden. Bei der Entsorgung von Resten der Reagenzien reichlich Wasser nachfließen lassen. WARNUNG: BIOGEFÄHRDUNG. Entsorgen Sie alle verwendeten Materialien in für biogefährliche Materialien geeigneten Behältern. Bitte kein Reagenz wiederverwenden oder wiederholt in die Kassetten oder Ampullen einfüllen. Entnahme und Aufbewahren von Proben Verwenden Sie frisches Serum (es können auch Serumröhrchen mit Trenngel verwendet werden) oder Plasma (EDTA, Lithium-Heparin, Na-Heparin, Citrat und ACD). Andere Antikoagulantia müssen vor Anwendung geprüft werden. Die Proben dürfen nicht durch Erhitzen inaktiviert worden sein. Die Partikel in der Suspension müssen durch Zentrifugieren beseitigt werden. In den Richtlinien CLSI H18-A3 und H21-A5 finden Sie weitere Informationen über die Handhabung, den Transport, das Verarbeiten und die Aufbewahrung der Proben. Serum Die Serumproben können 8 Tage lang bei 2-8 C gelagert werden. Werden sie länger gelagert, müssen sie bei -20 C oder darunter eingefroren werden. Die Proben können maximal 3 Mal eingefroren/aufgetaut werden. Nach dem Auftauen gut vermischen. Stellen Sie bei Proben sicher, dass sich keine Luftblasen darin befinden; sollte dies doch der Fall sein, entfernen Sie vor der Analyse alle Luftblasen. Plasma Plasmaproben können 8 Tage lang bei 2-8 C gelagert werden. Wenn sie länger gelagert werden, müssen sie bei -20 C oder darunter eingefroren werden. Das Plasma bei 37 C auftauen. Die Proben nur einmal auftauen. Nach dem Auftauen gut vermischen. Stellen Sie bei Proben sicher, dass sich keine Luftblasen darin befinden; sollte dies doch der Fall sein, entfernen Sie vor der Analyse alle Luftblasen. Probenumfang Der Probenumfang, der notwendig ist, um einen einzelnen BIO-FLASH anti-hcv Test durchführen zu können, variiert je nach Probenbehälter. Für eine Untersuchung sind mindestens 26 µl plus das Totvolumen, das bei 200 µl liegt, wenn die empfohlene Probenschale verwendet wird (REF ), notwendig. Andere Materialien Die folgenden Materialien sind nicht in der Reagenzkassette enthalten und müssen separat erworben werden. REF REF BIO-FLASH anti-hcv Calibrators (Kalibratoren) BIO-FLASH anti-hcv Controls (Kontrollen) Für weitere Informationen, lesen Sie die jeweiligen Gebrauchsinformationen aufmerksam. Keine anderen Kalibratoren verwenden. Die Information, die das Instrument BIO-FLASH zur Kalibrierung des BIO-FLASH anti-hcv-assay benötigt, ist in den Strichcodes der Ampullen enthalten. Das Verwenden von Kontrollen anderer Hersteller kann zu unerwarteten Ergebnissen führen. Stellen Sie sicher, dass sich in dem Instrument BIO-FLASH ausreichende Mengen der folgenden Verbrauchsmaterialien befinden, bevor Proben, Kalibrierung oder Kontrollen durchgeführt werden: REF BIO-FLASH Cuvettes (Küvetten) Hinweis: Das Design der Küvetten ist patentgeschützt (US D560,816 / Design CE ) REF REF BIO-FLASH Triggers (Aktivatoren) BIO-FLASH System Rinse (Systemlösung) Instrument / Testdurchführung Im Benutzerhandbuch von BIO-FLASH finden Sie die kompletten Anweisungen zur Durchführung eines Tests. Kalibrierung Der Strichcode der Kassette enthält eine für die Reagenziencharge gültige Masterkalibrationskurve. Dennoch wird für alle Reagenzien eine chargenspezifische Kalibrationskurve benötigt, die bis zum Verfallsdatum der Charge gilt. Eine neue Kalibrationskurve ist nötig, wenn die Kontrollergebnisse außerhalb des Akzeptanzbereiches liegen und wenn Anpassungen am Instrument vorgenommen wurden.

4 Zur Konfigurierung einer Kalibrationskurve schlagen Sie im Benutzerhandbuch von BIO-FLASH nach. Qualitätskontrolle Zur Durchführung einer vollständigen Qualitätskontrolle werden zwei Kontrollstufen empfohlen. Die Kontrollen von BIO-FLASH anti-hcv negativ und positiv wurden für eine solche Qualitätskontrolle entwickelt. An jedem Anwendungstag sollen die Kontrollen mindestens alle 24 Stunden analysiert werden. Stellen Sie sicher, dass die Kontrollergebnisse innerhalb der Akzeptanzbereiche liegen, da das Gegenteil auf ungültige Ergebnisse hindeuten kann, was dann Korrekturmaßnahmen durch den Nutzer erforderlich macht. In diesem Fall müssen alle Ergebnisse, die seit der letzten akzeptablen Qualitätskontrolle des entsprechenden Analyts erhalten wurden, geprüft werden. Eine erneute Kalibrierung des Instrumentes kann erforderlich werden. Weitere Informationen siehe Benutzerhandbuch des Instrumentes. Zur Identifizierung und Lösung von ungewöhnlichen Situationen bei der Qualitätskontrolle wenden Sie sich bitte Westgard et al. 7 Aufbewahrung und Stabilität Die ungeöffneten Reagenzien bleiben bis zum auf dem Kassettenetikett angegebenen Haltbarkeitsdatum stabil, wenn sie bei 2-8 C und in vertikaler Lage aufbewahrt werden. Nach dem Öffnen bleibt die ins Instrument BIO-FLASH eingesetzte oder bei 2-8 C aufbewahrte Kassette 6 Wochen stabil. Interpretation der Ergebnisse Die Menge des Analyts in jeder Probe wird durch die Lichtemission (RLU) mittels Interpolation in der eingelesenen Kalibrationskurve bestimmt. Die Ergebnisse des BIO-FLASH anti-hcv werden in S/CO (Signal/Cut-Off Verhältnis) angegeben. Dabei handelt es sich um einen Qualitätstest; die Zahlenwerte des Ergebnisses werden nur für die Menge der vorhandenen Antikörper angegeben. Die Bestimmung des Anti-HCV mit dem BIO-FLASH anti-hcv Test wird wie folgt interpretiert: Proben mit einem Ergebnis < 0,90 S/CO werden als nicht reaktiv (negativ) betrachtet. Proben mit einem Ergebnis 0,90 und < 1,00 S/CO werden als unbestimmt (Grauzone) betrachtet. Proben mit einem Ergebnis 1,00 S/CO werden als reaktiv (positiv) bewertet. Proben mit anfänglich reaktiven oder unbestimmten Ergebnissen müssen im Duplikat ein zweites Mal analysiert werden. Wenn beide Werte der erneuten Prüfung unter 0,9 liegen, ist die abschließende Bewertung des Tests hinsichtlich HCV-Antikörper negativ. Wenn eines der Ergebnisse im Wiederholungstest positiv oder unbestimmt ist, muss die Probe weiter mit zusätzlichen Tests untersucht werden, um das Ergebnis zu bestätigen. Ein wiederholt positives Ergebnis deutet auf eine HCV-Infektion hin. Einschränkungen Das Ergebnis einer einzelnen Probe ist nicht ausreichend, um eine Primärinfektion durch HCV zu diagnostizieren. Deshalb sollten neben den Ergebnissen des BIO-FLASH anti-hcv andere Daten berücksichtigt werden, wie etwa klinische Anzeichen, Anamnese, Ergebnisse anderer Untersuchungen und weitere relevante Informationen. Ein negatives Ergebnis schließt eine HCV-Infektion nicht vollständig aus. Wie bei allen sensitiven Immunassays, können nicht wiederholbare positive Ergebnisse auftreten. Erwartete Ergebnisse Über die Inzidenz von HCV weltweit liegen keine genauen Kenntnisse vor, weil akute Infektionen in der Regel ohne Symptome verlaufen. 5 Nicht weniger als 2 bis 4 Millionen Personen in den USA könnten chronisch infiziert sein, in Europa 5 bis 10 Millionen und in Indien sogar 12 Millionen und die meisten davon wissen gar nicht, dass sie infiziert sind. In den USA und Westeuropa treten jedes Jahr ca neue Fälle auf, in Japan sind es um die % dieser Infizierten zeigen Symptome, 60 bis 80% könnten eine chronische Lebererkrankung entwickeln und 20% entwickeln eine Zirrhose. Um die 5%-7% der Patienten sterben schließlich an den Folgen der Infektion. 1,2 In den meisten europäischen Ländern wird in der Bevölkerung eine Inzidenz von HCV zwischen 0,5 und 2% berichtet. 1 Die WHO schätzt, dass rund 3% der Weltbevölkerung mit HCV infiziert wurden und es über 170 Million chronische Träger gibt, die eventuell eine Leberzirrhose und/oder Leberkrebs entwickeln könnten. 3 Hohe Reaktivitätswerte der HCV-Antikörper (>70%) wurden bei Konsumenten von Drogen berichtet, die gespritzt werden, sowie auch bei Blutern. Ein mittleres Auftreten von 20 bis 30 % wurde bei Patienten berichtet, die mit Hämodialyse behandelt werden. 1 Die Inzidenz geht zurück, da die Übertragung durch Blutprodukte auf nahezu Null gesunken ist und allgemeine Vorsichtsmaßnahmen in medizinischen Einrichtungen besser beachtet werden. 3 Leistungsdaten HINWEIS: Die folgenden Daten sind repräsentativ; Ergebnisse von Einzelexperimenten können von diesen Daten abweichen.

5 Spezifität Die Bewertung der Spezifität basierte auf Analysen von zufällig gewählten Blutserumspenden, sowohl von Erstspendern, als auch hospitalisierten Patienten. Insgesamt wurden 5022 zufällig ausgesuchte Serumproben aus zwei Blutbanken frisch analysiert, 3509 von der Banc de Sang i de Teixits de Catalunya (Spanien), und 1513 von der EFS Centre Atlantique site de Tours (Frankreich). Zusätzlich wurden 250 zufällig ausgewählte Serumproben von hospitalisierten Patienten des Hospital de la Santa Creu i Sant Pau (Spanien) bewertet. Die Proben, die wiederholt reaktiv waren, wurden mit einem ergänzenden Testverfahren erneut geprüft. Dann wurde die Spezifität bewertet. Die Ergebnisse befinden sich in der unten stehenden Tabelle: Getestete Proben Anfangs reaktiv (IR) wiederholt reaktiv (RR) RR, die unbestimmt waren RR, die positiv bestätigt wurden Spezifität N N N N N % Blutspenden ,7 Hospitalisierte Patienten Sensitivität Die Sensitivität wurde bewertet, indem Proben mit verifiziert positivem Ergebnis hinsichtlich HCV-Antikörpern getestet wurden. Dann wurde die Sensitivität für jede Probengruppe errechnet. Die Ergebnisse befinden sich in der unten stehenden Tabelle: Getestete Proben Reaktiv Sensitivität N N % Nicht genotypisiert Tag nach Probenentnahme Genotyp Genotyp Genotyp Genotyp 4 (nicht-c, nicht-d) Genotyp 4c/4d Genotyp Genotyp Gesamt genotypisierte Proben Sensitivität Serokonversion Zusätzliche Studien zur Sensitivität wurden durchgeführt, indem Proben von 30 handelsüblichen HCV Serokonversionspanelen getestet wurden. Die Ergebnisse wurden mit zugelassenen handelsüblichen Methoden verglichen. Frühere Reaktivität wurde bei neun (9) Panelen festgestellt, gleiche Reaktivität bei zwanzig (20) Panelen und nur bei einem (1) Serokonversionspanel zeigte BIO-FLASH Anti-HCV spätere Reaktivität. Präzision In Übereinstimmung mit den Richtlinien CLSI EP05-A2 wurde die Präzision in den Tests und gesamt (Test zu Test und Tag zu Tag) in zahlreichen Untersuchungen geprüft. Die Ergebnisse sind in der folgenden Tabelle zusammengefasst: Mittel (S/CO) % CV im Test % CV Gesamt Negativkontrolle 0,26 7,1 12,3 Positivkontrolle 3,16 4,3 9,2 Um den Cut-off-Wert 0,94 4,6 8,1

6 Reproduzierbarkeit Es wurde die Reproduzierbarkeit unter Repliken, Chargen und Instrumenten an 50 Proben bewertet. Die folgende Tabelle zeigt die Ergebnisse: N Copositivität Conegativität Replikat 2 vs. Replikat % 100% Charge 2 vs. Charge % 100% Instrument 2 vs. Instrument % 100% Interferenzen Studien in Übereinstimmung mit den Richtlinien CLSI EP7-A haben bewiesen, dass die folgenden potenziell störenden Substanzen die Ergebnisse des BIO-FLASH anti-hcv nicht beeinflussen: Potenziell störende Substanz Konzentration % Interferenz Hämoglobin 500 mg/dl 10 Indirektes Bilirubin 18 mg/dl 10 Direktes Bilirubin 18 mg/dl 10 Triglyzeride 1300 mg/dl 10 Rheumafaktor 800 UI/mL 10 HAMA 1 µg/ml 10 Kreuzreaktivität 134 positive Proben von Schwangeren zu einer Reihe Kreuzreagenzien wurden mit BIO-FLASH anti-hcv analysiert. Ein potenzielles Kreuzreagenz ruft eine Kreuzreaktion hervor, wenn die Diagnose von negativ zu positiv wechselt oder umgekehrt. Die reaktiven Proben wurden mit einem Referenzassay verglichen, bei dem keine Kreuzreaktionen mit der potenziell beeinflussenden Substanz nachgewiesen wurden. Die Ergebnisse sind in der folgenden Tabelle zusammengefasst: Potenzielle Kreuzreaktion Übereinstimmu Anti-Toxoplasma 6/6 Anti-CMV (Zytomegalievirus) 6/6 Anti-Röteln 6/6 Anti-HDV IgG (Hepatitis D Virus) 8/8 IgG erhöht 4/4 Mononukleose 5/5 RF (Rheumafaktor) 5/5 ANA (Antinukleäre Antikörper) 5/5 Anti-HBs 6/6 Anti-HBc 5/5 Anti-VZV (Varizella Zoster-Antikörper) 5/5 RPR (schnelles Plasma Reagin) 5/5 Schwangere 7/7 Schwangere (multipare) 5/5 Anti-EBV (Epstein-Barr Virus-Antikörper) 4/4 IgM erhöht 6/6 Anti-HEV (Hepatitis E Virus) 5/5 HBsAg 6/6 HAV-IgG (Hepatitis A Virus) 6/6 HAV-IgM (Hepatitis A Virus) 5/5 Anti-HIV (Antikörper gegen Humanes-Immundefizienz-Virus) 3/3 Anti-HSV 1 (Herpes simplex Typ 1-Antikörper) 6/6 Anti-E. coli 15/15

7 Nachweisgrenze In Übereinstimmung mit den Richtlinien CLSI EP17-A liegt die Nachweisgrenze (Lod=limit of detection) bei 0,08 S/CO.