Resistenzentwicklung des Humanen Immundefizienzvirus Typ 1 gegen Azidothymidin in Zellkultur

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1 Resistenzentwicklung des Humanen Immundefizienzvirus Typ 1 gegen Azidothymidin in Zellkultur Dissertation zur Erlangung des Doktorgrades der Mathematisch-Naturwissenschaftlichen Fakultäten der Georg-August-Universität zu Göttingen vorgelegt von Gabriele Jahn aus Bardenberg Göttingen 2003

2 D7 Referent: Prof. Dr. H.-J. Fritz Correferent: Prof. Dr. W. Schürmann Tag der mündlichen Prüfung:

3 für Stephan

4 Herrn Professor Dr. G. Hunsmann danke ich für die Bereitstellung sehr guter Arbeitsmöglichkeiten, die Vergabe des Themas und hilfreiche Diskussionen. Herrn Professor Dr. H.-J. Fritz möchte ich für die externe Betreuung meiner Arbeit und Herrn Professor Dr. W. Schürmann für die Übernahme des Correferats im Fachbereich Biologie der Georg-August-Universität Göttingen danken. Frau Dr. E. Jurkiewicz danke ich für die Betreuung meiner Doktorarbeit, zahlreiche Diskussionen, ständige Hilfsbereitschaft und Unterstützung. Frau Dr. N. Frijus-Plessen aus der Abteilung für Pharmakologie und Toxikologie des Universitätsklinikums Göttingen möchte ich für die angenehme Zusammenarbeit und viele hilfreiche Diskussionen danken. Mit ihrer Hilfe konnten entscheidende Experimente zur AZT- Aufnahme durchgeführt werden. Herrn Prof. Dr. G.F. Kahl und Frau Prof. Dr. H. Foth danke ich für die Unterstützung dieser Zusammenarbeit und hilfreiche Diskussionen. Herrn Prof. Dr. W.E.G. Müller und Herrn T. Daum aus der Abteilung für Angewandte Molekularbiologie in der Physiologischen Chemie der Johannes Gutenberg Universität Mainz und Herrn Dr. B. Kurelec vom Ruder Boskovic Institut, Zagreb in Kroation danke ich für die Kooperation zum Nachweis des Multidrug-Resistenz-Systems mdr P170 und die außerordentlich schnelle Bearbeitung aller Fragestellungen. Herrn Prof. Dr. Braun und Herrn Dr. Haller von der Bayer AG Wuppertal danke ich für ihr Interesse an einer Zusammenarbeit und die Bereitstellung zahlreicher Inhibitoren. Nicht zuletzt möchte ich Herrn Prof. Laakmann aus der Psychiatrischen Klinik der LMU München für die Freistellung von Arbeitszeiten zur Erstellung meiner Dissertation während der letzten Phase meiner Arbeit nach einer langen Familienpause danken. Dem Max-von-Pettenkofer-Institut München, besonders Frau Taraz und Frau Güthenke, möchte ich für die freundliche Bereitstellung und Hilfe bei der Literaturrecherche danken.

5 ABKÜRZUNGSVERZEICHNIS AIDS Erworbenes Immundefektsyndrom (acquired immunodeficiency syndrome) ARC AIDS related complex AZT Azidothymidin, Zidovudin, 3'-Azido-3',2'-didesoxythymidin DMSO Dimethylsulfoxid DNA Desoxyribonukleinsäure DTT Dithiothreitol E. coli Escherichia coli ELISA Enzym-gekoppelter Immunosorbent Test (enzyme linked immunosorbent assay) FCS Foetales Rinderserum FITC Fluorescein Isothiocyanat FIV Immundefizienzvirus der Katze (feline immunodeficiency virus) HAART highly active antiretroviral therapy HIV-1 Humanes Immundefizienzvirus Typ 1 (human immunodeficiency virus type 1) HTLV-I Humanes T-Zell-lymphotropes Virus Typ I (human T-cell lymphotropic virus type I) NBMPR Nitrobenzylthioinosin 6-((4-Nitrobenzyl)thio)-9-β-D-Ribofuranosylpurin NNRTI nicht kompetitiver Reverse Transkriptase Inhibitor (non kompetitive nucleoside reverse transkriptase inhibitor) pnl43 biologisch aktiver, molekularer Klon des HIV-1 PBMC periphere mononukleäre Blutzellen (peripheral-blood mononuclear cells) PCR Polymerase-Ketten-Reaktion (polymerase chain reaction) PI Proteinase Inhibitor pol Gen der retroviralen Replikationsenzyme, das für Protease, Reverse Transkriptase und RNaseH kodiert RNA Ribonukleinsäure RT Reverse Transkriptase

6 RTI SIV TCID Reverse Transkriptase Inhibitor Immundefizienzvirus des Affen (simian immunodeficiency virus) Gewebekulturinfektionsdosis (tissue culture infectious dose)

7 I INHALTSVERZEICHNIS SEITE 1 EINLEITUNG Retroviren und ihre Klassifizierung Das Humane Immundefizienzvirus (HIV) HIV-Epidemiologie und Erkrankung beim Menschen Morphologie und Genomstruktur von HIV HIV-Infektion und -Replikation Antiretrovirale Therapie Entwicklung neuer antiretroviraler Wirkstoffe Resistenz gegen Chemotherapeutika Aufgabenstellung 25 2 MATERIAL UND METHODEN Material Chemikalien Verbrauchsmaterialien Häufig verwendete Lösungen und Puffer Zelllinien und Virus Zellkultur Lymphozytenisolierung und -kultivierung aus Vollblut Escherichia coli (E. coli)-stämme Methoden Virusisolierung humaner Immundefizienzviren aus Zellkultur- 31 überständen Nachweis von Reverser Transkriptase Aktivität im Zellkultur- 31

8 II SEITE überstand Hemmversuche der Reversen Transkriptase Aktivität durch AZT- 32 Triphosphat Nachweis der HIV-1 Vermehrung im MT-4 Zelltest Bestimmung von HIV-1 Polypeptiden im Zellkulturüberstand 33 mit dem Antigen-ELISA Nachweis einer HIV-1 Infektion in der Immunfluoreszenz- 34 mikroskopie Durchflusszytometrie zur Bestimmung der mdrp170 Expression Messung des zytopathischen Effektes von HIV-1 im Synzytientest Proteinbestimmung nach Lowry (1951) SDS-Polyacrylamidgelelektrophorese (PAGE) von Polypeptiden 36 nach Laemmli (1970) Western Blot zum Nachweis des mdrp170 Polypeptids Polymerase-Ketten-Reaktion (PCR) Primerauswahl und -herstellung Berechnung der Annealingtemperatur DNA-Extraktion aus Kulturzellen DNA-Amplifikation Agarosegelelektrophorese Elution der DNA aus Agarosegelen Klonierung eines PCR-Amplifikats Herstellung transformationskompetenter Zellen Transformation von E. coli-zellen mit Plasmid DNA Minipräparation von Plasmiden 43

9 III SEITE Maxipräparation von Plasmiden Sequenzierung Sequenzierung von Plasmiden Sequenzierung der PCR-Produkte Vergleich der gewonnenen HIV-Sequenzen mit einer Datenbank Hybridisierung nach Southern Radioaktive Markierung von DNA-Sonden durch multipriming Autoradiographie AZT-Akkumulationsversuche mit 3 H-AZT Bestimmung intrazellulärer AZT-Konzentrationen Zellaufschluss HPLC-Analyse von intrazellulärem AZT 48 3 ERGEBNISSE HIV-Varianten des molekularen Klons pnl43 unter AZT- 49 Behandlung Herstellung der HIV-1 pnl43 transfizierten Jurkat-Zelllinie AZT-Behandlung der NL43-transfizierten und infizierten 50 T-Zelllinien Nachweis von HIV-1 Varianten mit veränderter AZT- 51 Sensitivität in Zellkultur Molekularbiologische Untersuchungen am HIV-1 Genom 55

10 IV SEITE 3.2 Herstellung und Nachweis von HIV-1 Varianten des HIV-1 61 Isolats IIIB Selektion AZT-resistenter HIV-Varianten in vitro Erstnachweis von zellfreiem Virus in den AZT-resistenten 63 Kulturen mit PCR Nachweis und Quantifizierung viraler Antigene in den Zellkultur- 68 überständen AZT-behandelter Kulturen Inhibition der Reversen Transkriptase mit AZT-Triphosphat 71 (AZT-TP) in vitro -Untersuchung der viralen Empfindlichkeit gegenüber 72 DDI und AZT PCR-Sequenzierung der AZT-selektionierten Zellen Verhalten der resistenten Zellkulturen unter hochmolaren 75 AZT-Konzentrationen 3.3 Untersuchungen zu zellulären Resistenzmechanismen Nachweis des Multidrug-Resistenz-Proteins mdr P Westernblotanalyse Durchflusszytometrie Zeitabhängige Expression des mdr P170 unter AZT-Behandlung Zelluläre Aufnahme von AZT Zelluläre Aufnahme von 3 H-AZT Zelluläre Aufnahme von 3 H-AZT in AZT-vorbehandelten Zellen Zelluläre Aufnahme von unmarkiertem AZT Zelluläre Aufnahme von unmarkiertem AZT nach 180 Minuten 85 Vorbehandlung mit RPMI

11 V SEITE Die mdr-inhibitoren Verapamil und Forskolin Toxizität von Verapamil und Forskolin Zelluläre Aufnahme von unmarkiertem AZT in Gegenwart der 88 Inhibitoren mit Verapamil oder Forskolin 4 DISKUSSION Entwicklung einer viralen Resistenz in vitro AZT-selektionierte HIV-1 Varianten des molekularen Klons NL AZT-selektionierte HIV-1 Varianten aus der Viruspopulation HIV-1 IIIB Hemmung der viralen Reversen Transkriptase durch AZT-Triphosphat Zelluläre AZT-Resistenz Untersuchungen zur zellulären mdr P170-Expression Zelluläre Aufnahme von 3 H-AZT Zelluläre Aufnahmekinetiken von unmarkiertem AZT Zelluläre Aufnahme von unmarkiertem AZT Zelluläre Abgabe von unmarkiertem AZT Einfluss der mdr P170 Inhibitoren Verapamil und Forskolin auf 109 die zelluläre AZT-Aufnahme 4.3 Zusammenfassende Diskussion ZUSAMMENFASSUNG LITERATUR 115

12 VI ABBILDUNGS- UND TABELLENVERZEICHNIS Seite ABBILDUNGEN Abb. 1 Genomstruktur, Proteinvorläufer, Proteine und schematischer Aufbau des 7 HIV-1 Partikels Abb. 2 Replikationszyklus des HIV 12 Abb. 3 Strukturformel des AZT 21 Abb. 4 Southernblot mit genomischer DNA aus HIV-1 pnl43 transfizierten 50 Jurkat-Zellen nach Verdau mit den Restriktionsenzymen HindIII, KpnI und PstI Abb. 5 Inhibition der HIV-1 pnl43 Replikation in MT-4 Zellen 52 durch AZT in Abhängigkeit von der Viruskonzentration Abb. 6 PCR mit pnl43 aus AZT-selektionierten Jurkat-Zellkulturen in 55 Abhängigkeit von der Zeit nach Transfektion Abb. 7 PCR mit HIV-1 NL43 infizierten AZT-behandelten Molt 4 Klon 8-56 Zellkulturen Abb. 8 Klonierung des pol-fragments aus genomischer DNA 57 Abb. 9 Toxizität von AZT auf uninfizierte und HIV-1 IIIB infizierte T-Zelllinien 62 Abb. 10 Toxizität von AZT auf HIV-1 IIIB infizierte und mit 50 µm AZT- 63 selektionierte HIV-1 IIIB infizierte Jurkat-Zellen Abb. 11 Toxizität von AZT auf MT-4 Zellen 64 Abb. 12 PCR mit HIV-1 IIIB aus AZT selektionierten Zellkulturen 65 Abb. 13 Virusnachweis im Synzytientest 67 Abb. 14 Virustitrationskurve im ELISA 69 Abb. 15 HIV-1 Nachweis in 50 µm AZT-behandelten Jurkat-Zellen nach einer 70 HIV-1 Neuinfektion mit ELISA Abb. 16 HIV-1 Nachweis in 50 µm AZT-behandelten Jurkat-Zellen nach einer 70 HIV-1 Neuinfektion im RT-Aktivitätstest Abb. 17 Bestimmung der Reversen Transkriptase-Aktivität mit dem Template 72 poly rcdg und AZT-Triphosphat Abb. 18 Virale Empfindlichkeit gegenüber AZT 73 Abb. 19 Virale Empfindlichkeit gegenüber DDI 74

13 VII Seite Abb. 20 Virustiter im ELISA nach Erhöhung der AZT-Dosis 75 Abb. 21 Uninfizierte und HIV-1 IIIB infizierte Jurkat-Zellen unter Behandlung mit 78 hohen AZT-Konzentrationen Abb. 22 Westernblot des mdr P170 aus nicht infizierten und HIV-1 IIIB infizierten 79 Jurkat-Zellen Abb. 23 Durchflusszytometrische Analyse von uninfizierten Jurkat-Zellen und 80 HIV-1 IIIB infizierten Jurkat-Zellen Abb. 24 Zelluläre Aufnahme von 3 H-AZT 82 Abb. 25 Intrazelluläre AZT-Konzentration von Lymphozyten, uninfizierten und 84 HIV-1 IIIB infizierten Jurkat-Zellen in Gegenwart von 450 µm AZT Abb. 26 Intrazelluläre AZT-Konzentration von Lymphozyten, uninfizierten und 85 HIV-1 IIIB infizierten Jurkat-Zellen in Gegenwart von 100 µm AZT Abb. 27 Intrazelluläre AZT-Konzentration mit und ohne 180 Minuten 86 Vorinkubation in RPMI 1640 Abb. 28 Toxizität von Verapamil und AZT in Kombination auf uninfizierte 87 Jurkat-Zellen Abb. 29 Toxizität von Forskolin und AZT in Kombination auf uninfizierte 88 Jurkat-Zellen Abb. 30 Intrazelluläre AZT-Konzentration HIV-1 IIIB infizierter Jurkat-Zellen. Die 89 Zellen wurden in Gegenwart von 450 µm AZT und 10 µm Verapamil bzw. 10 µm Forskolin kultiviert. Abb. 31 Intrazelluläre AZT-Konzentration uninfizierter Jurkat-Zellen. Die Zellen 90 wurden in Gegenwart von 450 µm AZT und 10 µm Verapamil bzw. 10 µm Forskolin kultiviert. Abb. 32 Intrazelluläre AZT-Konzentration in humanen Lymphozyten. Die Zellen 91 wurden in Gegenwart von 450 µm AZT und 10 µm Verapamil bzw. 10 µm Forskolin kultiviert. Abb. 33 Intrazelluläre AZT-Konzentration HIV-1 IIIB infizierter Jurkat-Zellen 92 Abb. 34 Intrazelluläre AZT-Konzentration uninfizierter Jurkat-Zellen 92 Abb. 35 Intrazelluläre AZT-Konzentration humaner Lymphozyten 93 Abb. 36 Biochemische Mechanismen der Medikamenten-Resistenz 104

14 VIII TABELLEN Seite Tab. 1 CDC-Klassifikation 4 Tab. 2 Zugelassene Medikamente zur antiviralen Behandlung 16 Tab. 3 Virale und zelluläre Komponenten als Ziele zur Entwicklung von anti-hiv 18 Substanzen Tab. 4 Häufige Mutationen im HIV pol-gen mit Einfluss auf die Arzneimittel- 22 resistenz Tab. 5 Nukleosidtransporter 24 Tab. 6 Verwendete Chemikalien 27 Tab. 7 Häufig verwendete Verbrauchsmaterialien 28 Tab. 8 Häufig verwendete Lösungen und Puffer 29 Tab. 9 Verwendete PCR- und Sequenzierungsprimer 40 Tab. 10 Im MT-4 Zelltest ermittelte Infektions- und Inhibitionsdosen der auf 53 Molt 4 Klon 8-Zellen passagierten HIV-1 Viren Tab. 11 Im MT-4 Zelltest ermittelte Infektions- und Inhibitionsdosen der mit dem 54 HIV-1 Klon pnl43 transfizierten Jurkat-Kulturen Tab. 12 Basen- und Aminosäure-Austausche im Bereich des pol-gens Viruspassage Tab. 13 Basen- und Aminosäure-Austausche im Bereich des pol-gens 60 - sensitive Viren Tab. 14 Nachweis von HIV-1 IIIB Antigenen auf nicht AZT-behandelte und 50 µm 66 AZT behandelte Jurkat-Zellen in der Immunfluoreszenz Tab. 15 Nukleotid- und Aminosäure-Austausche bei HIV-1 IIIB Viren nach 74 Behandlung mit 50 µm AZT Tab. 16 Proliferation uninfizierter und HIV-1 IIIB infizierter Jurkat-Zellen in 76 Abhängigkeit verschiedener AZT-Konzentrationen Tab. 17 Nukleotid- und Aminosäure-Austausche aus 50 µm AZT selektionierten 98 HIV-1 IIIB Tab. 18 Vergleich zwischen den bisher in der Literatur beschriebenen Aminosäure- 99 Austauschen und den in 50 µm AZT selektionierten HIV-1 IIIB gefundenen Austauschen

15 1 EINLEITUNG 1.1 Retroviren und ihre Klassifizierung Retroviren (Reverse Transkriptase Onkoviren) wurden erstmals 1908 von Ellermann und Bang und 1911 von Rous beschrieben (Ellermann und Bang, 1908; Rous, 1911). Sie können bei Tieren ein bösartiges Zellwachstum induzieren, das als zellfreier Tumorextrakt übertragen werden kann. Durch die Entdeckung tumorerzeugender Gene im retroviralen Genom konnte ein ursächlicher Zusammenhang zwischen Virusinfektion und Tumorentstehung hergestellt werden (Stehelin et al., 1976). Aus zellulären Vorläufern entstehen Onkogene, die ins Virusgenom integrieren. Der Integrationsort des Onkogens im Virusgenom hat einen Einfluss auf die Infektiosität des neu entstehenden Viruspartikels. Es kann ein infektiöses oder ein defektes nicht infektiöses Viruspartikel entstehen. Das Genom von Retroviren ist kodogene einzelsträngige Ribonukleinsäure. Die wichtigste biologische Besonderheit von Retroviren ist das Replikationsenzym Reverse Transkriptase (RT) (Temin und Mizutani, 1970; Baltimore, 1970). Mit Hilfe dieses Enzyms wird das Virusgenom nach der Infektion der Zelle in DNA überschrieben und ins Wirtsgenom integriert. Die Retroviren wurden ursprünglich aufgrund der Morphologie des Virusinnenkörpers (Core) in die Typen A, B, C und D klassifiziert. In der aktuellen Nomenklatur des "International Committee on Taxonomy of Viruses" wird die Familie der Retroviridae in 7 Gattungen eingeteilt, wobei Alpha-, Beta- und Gammaretroviren als einfache Retroviren bezeichnet werden, die nur für Strukturproteine (Gag, Env) und Enzyme (Pro, Pol) kodieren. Delta- und Epsilonretroviren, Lenti- und Spumaviren sind dagegen komplex und besitzen zusätzlich noch Gene für regulatorische Proteine. Alpha- und Gammaretroviren werden durch C-Typ Morphologie charakterisiert und unterscheiden sich dadurch, dass bei den Alpharetroviren lediglich Pro und Gag im selben Leseraster kodieren, während sich bei den Gammaretroviren die Gene Gag, Pro und Pol im selben Leseraster befinden. Betaretroviren sind einfache Retroviren mit B- oder D-Typ Morphologie im reifen Virus und einer A-Typ Zwischenform während des Viruszusammenbaus. Die komplexen Delta- und Epsilonretroviren werden durch C-Typ Morphologie charakterisiert und unterscheiden sich durch die Leseraster ihrer Gene. Deltaretroviren besitzen die Gene Gag, Pro und Pol in drei verschiedenen Leserastern, bei den Epsilonretroviren befinden sich die Gene Gag, Pro und Pol im selben Leseraster (Goff, 2001). Spumaviren sind komplexe Viren mit einem zentralen, nicht kondensierten Core und vorstehenden Spikes auf der Oberfläche. Das Genom kodiert für Gag, Pro, Pol und Env. Zusätzlich sind die Gene Tas/Bel-1 und Bet bekannt. Das Gen Tas kodiert für einen

16 2 transkriptionalen Transaktivator (Kang et al., 1998; Mergia et al., 1991), die genauen Funktionen von Bel und Bet sind noch nicht bekannt, Bet scheint jedoch eine Schlüsselrolle beim Wechsel von der lytischen in die chronische Infektion zu spielen (Giron et al., 1998). Spumavirinae verursachen bei zahlreichen Säugerspezies Vakuolisierung, Synzytienbildung und Zelllyse in Zellkultur, bisher wurde jedoch noch keine Erkrankung bei persistenter Infektion beschrieben (Linial, 2000). Die Virusinnenkörper der Lentivirinae sind abhängig von den verschiedenen Gattungen meistens sphärisch, sonst konisch oder zylindrisch geformt. Das Genom der Lentivirinae enthält die Gene Gag, Pro, Pol und Env, wobei Gag in einem anderen Leseraster kodiert als Pro-Pol. Die Vertreter der Subfamilie Lentivirinae lösen nach Infektion Krankheiten mit langer Latenzzeit und langsamem Krankheitsverlauf aus und verursachen Immundefekte und chronisch degenerative Entzündungen (Haase, 1986; Goff, 2001). Retroviren sind im Tierreich weit verbreitet. Sie konnten in Insekten, Reptilien, Fischen, Vögeln und Säugetieren nachgewiesen werden (Teich et al., 1982; Weiss, 1982, Poulet et al., 1994). Beim Menschen wurde erstmals 1979 ein Retrovirus gefunden (Miyoshi et al., 1979). Epidemiologische Studien über die Endemie der HTLV-I Infektion (human T- lymphotropic virus type I) in Südjapan, Afrika und Teilen der Karibik haben gezeigt, dass das HTLV-I für das Auftreten der humanen T-Zell-Leukämie bei Erwachsenen (adult T-cell leukemia, ATL) verantwortlich ist (Poiesz et al., 1980). Das HTLV gehört zu den Deltaretroviren. 1.2 Das Humane Immundefizienzvirus (HIV) 1981 wurde beim Menschen erstmals eine nicht angeborene Immunschwäche mit ungewöhnlichen Krankheitssymptomen und tödlichem Krankheitsverlauf beschrieben (Gottlieb et al., 1981; Masur et al., 1981). Diese Krankheit erhielt später den Namen AIDS (acquired immunodeficiency syndrome) konnte erstmals von der Arbeitsgruppe Montagnier ein als LAV (lymphadenopathy-associated virus) bezeichnetes Virus isoliert (Barré-Sinoussi et al., 1983) und ein ursächlicher Zusammenhang zum Krankheitsbild AIDS nachgewiesen werden (Brun-Vézinet et al., 1984) wurden zwei amerikanische Isolate beschrieben, das HTLV-III (human T-cell lymphotropic virus type III) (Popovic et al., 1984) und das ARV (AIDS-related virus) (Levy et al., 1984). Diese drei Virusisolate wurden 1986 unter dem gemeinsamen Namen HIV-1 (human immunodeficiency virus type 1) zusammengefaßt (Coffin et al., 1986), da eine große Sequenzhomologie für HTLV-III (Hahn et al., 1984; Ratner et al., 1985) und LAV (Wain-Hobson et al., 1985; Alizon et al., 1986) gezeigt wurde. In späteren Jahren stellte sich allerdings heraus, dass es sich bei der

17 3 Erstbeschreibung des HTLV-III um eine Kontaminante des LAV aus dem Pasteur-Institut handelte, dennoch waren in der Folgezeit isolierte Viren ähnlich (Bryant et al., 1985; Chang et al., 1989; Wain-Hobson et al., 1991). Die bisher älteste beschriebene AIDS-Kasuistik stammt aus dem Jahre 1959 und beschreibt einen britischen Seemann, der in Manchester an einer Pneumocystis carinii Pneumonie verstarb; die HIV-1 Infektion wurde nachträglich mit der Polymerase-Ketten-Reaktion (PCR) nachgewiesen (Corbitt et al., 1990) wurde aus einer westafrikanischen Patientin ein weiteres Immundefizienzvirus, das HIV-2, isoliert (Clavel et al., 1986b). Dieses Isolat ruft AIDS mit einer längeren Latenzzeit (Ancelle et al., 1987) und weniger schweren Krankheitssymptomen hervor als es bei HIV-1 der Fall ist (Marlink et al., 1988; Marlink et al. 1994; Adjorlolo-Johnson et al., 1994; Marlink, 1996). Auch in verschiedenen Affenspezies wurden HIV-1 und HIV-2 verwandte SIV-Isolate (simian immunodeficiency virus) gefunden (Daniel et al., 1985; Murphy-Corb et al., 1986; Ohta et al., 1988; Huet et al. 1990). Erst im Jahre 1999 wurde ein HIV-infizierter Schimpanse einer neuen Subspezies (Pan troglodytes troglodytes) entdeckt. Ein Wirtswechsel zwischen Affe und Mensch scheint über rohes Fleisch mit Hilfe der weltweit verbreiteten beißenden Fliege Stomoxys calcitrans möglich zu sein (Brandner et al., 1992; Eigen et al., 2002). Die genetischen Subtypen des HIV-1 werden in die Gruppen M (major), O (outlier) und N (non-m, non-o) unterteilt. In der Gruppe M finden sich mehr als 95 % der weltweit bekannten Virusisolate, die in die Klassen A, B, C, D, F, G, H, J und K gegliedert werden (Myers, 1994; Louwagie et al., 1993; WHO Network for HIV Isolation and Characterization, 1994; Robertson et al., 2000). Als Subsubtypen werden Linien beschrieben, die sich genetisch nicht genug voneinander unterscheiden, um einen neuen Subtyp zu rechtfertigen, wie A1 und A2 (Gao et al., 2001) oder F1 und F2 (Triques et al., 2000). Bei den Typen E und I der Gruppe M stellte sich nachträglich heraus, dass sie nicht in das System passen, weil es sich um Rekombinanten aus verschiedenen Subtypen handelt. Der Typ E besteht aus A und E, ein reiner Subtyp E konnte bisher nicht isoliert werden (Carr et al., 1996; Gao et al., 1996). Bei dem Typ I handelt es sich um Mosaikviren aus mindestens 5 Subtypen (A, G, H, K plus nicht klassifizierte Bereiche) (Paraskevis et al., 2001). Die Gruppe O enthält Viren aus Kamerun, Gabun und Äquatorialguinea, deren Genom weniger als 50 % Übereinstimmung mit der Gruppe M zeigt (Subbarao et al., 1996). Viren der Gruppe N werden in Kamerun gefunden; sie reagieren serologisch nicht im Standard-ELISA für vollständige Viren, sind jedoch im Westernblot nachweisbar (Simon et al., 1998a, Freed et al., 2001). HIV-2 Isolate werden in die genetischen Subtypen A bis G eingeteilt (Chen, 1997; Soriano, 2000;Yamaguchi, 2000).

18 4 1.3 HIV-Epidemiologie und Erkrankung beim Menschen Zunächst wurde AIDS als Krankheit von Risikogruppen wie Homosexuellen, Drogenabhängigen, Hämophilen und Empfängern von Blutplasma sowie Blutkonserven beschrieben, breitete sich dann aber durch Sexualkontakt in der übrigen Bevölkerung aus. In Deutschland waren am nach Angaben des Robert-Koch-Instituts AIDS- Fälle ( incl. Meldeverzug) und Verstorbene gemeldet ( weltweit wurde die Zahl der Betroffenen am Welt-AIDS-Tag 2001 auf 40 Millionen geschätzt. Während HIV-1 weltweit verbreitet ist (Samuel et al., 1988; Sato et al., 1989), ist HIV-2 hauptsächlich in Westafrika endemisch (Clavel et al., 1987) oder tritt bei Personen auf, die sich in Westafrika aufgehalten und dort infiziert haben (Clavel et al., 1986a; Kong et al., 1988; Zagury et al., 1988; Franchini et al., 1989; Kühnel et al, 1989; Schneider et al., 1990). Der Subtyp A des HIV-1 findet sich hauptsächlich in Westafrika, B in Nord- und Südamerika, Europa, Nordafrika, Nord- und Ostasien und Australien, C in Ost- und Südafrika und in Indien, D in Zentralafrika, E in Südostasien und in Indonesien. Tab. 1: CDC-Klassifikation der HIV-Infektion Klinische Kategorie A B C CD4-Zellen/µl asymptomatisch Symptome Symptome kein AIDS AIDS 1: 500 A1 B1 C1 2: A2 B2 C2 3: < 200 A3 B3 C3 Die HIV-Erkrankung wird nach der CDC-Klassifikation (Center for disease control) in die drei klinischen Kategorien A bis C und in drei CD4-Zellzahlbereiche 1 bis 3 eingeteilt, so dass sich eine 3 x 3 Matrix mit den Klassen A1 bis C3 ergibt (Tab. 1). Ein bis drei Wochen nach Infektion kann die akute HIV-Krankheit, eine grippeähnliche Erkrankung, beobachtet werden. Dieses frühe Stadium tritt bei 7 von 8 untersuchten Angestellten nach Nadelstichverletzung auf, die in der Folge serokonvertierten, kann aber ohne konkreten Anhaltspunkt meistens nicht einer Infektion mit HIV zugeordnet werden, da die Symptome einer Erkältung zu ähnlich sind.

19 5 Dem Krankheitsbild des ARC (AIDS-related complex) werden folgende klinische Befunde zugeordnet: Fieber, eine Gewichtsabnahme von mehr als 10 %, eine mehr als dreimonatige Lymphadenopathie, Diarrhoe, Müdigkeit und nächtliche Schweißausbrüche. Typische Laborbefunde sind eine verringerte T-Helfer-Zellzahl, ein verringerter Quotient aus T-Helferzellen zu T-Suppressorzellen, erhöhte Serumglobulinwerte, eine verringerte Blastogenese und eine kutane Anergie (Koch, 1987). Für das Endstadium der Immunschwächekrankheit AIDS (acquired immunodeficiency syndrome) wurden die Krankheitssymptome schlechter Allgemeinzustand, Gewichtsverlust, Neoplasien, neurologische Erkrankungen, Enzephalitiden, periphere nervöse Störungen, Meningitiden und eine Vielzahl bakterieller und viraler opportunistischer Infektionen beschrieben (Gottlieb et al., 1981; Masur et al., 1981; Levy, R.M., 1985; Sharer et al., 1986). Besonders häufig treten in späten Krankheitsstadien Pneumocystis carinii-pneumonien, eine rezidivierende Lungenentzündung (Gottlieb et al., 1981) und ein seltener Gefäßtumor der Haut, das Kaposi-Sarkom auf (sarcoma idiopathicum multiplex haemorrhagicum) (Schroff et al., 1983; Centers for Disease Control, 1981). Als weitere wichtige opportunistische Infektionen wurden Toxoplasmose, Kryptosporidiose, Candida-Infektionen, Kryptokokkose, Aspergillose, Histoplasmose, Tuberkulose, atypische Mykobakterien, bakterielle Pneumonien, Salmonellen-Septikämie, Zytomegalievirus-Infektionen, Herpes simplex-infektionen, Varizella Zoster-Virus-Infektionen, orale Haarleukoplakie, bazilläre Angiomatose, progressive multifokale Leukenzephalopathie (PML) beschrieben. Nach Ausbildung des Vollbildes AIDS beträgt die durchschnittliche Überlebenszeit ohne antiretrovirale Therapie ca. 1 Jahr (Anderson und May, 1988). Die Progression der HIV- Erkrankung kann seit 1996 durch antivirale Kombinationstherapien (HAART - highly active antiretroviral therapy) nachhaltig aufgehalten werden. 1.4 Morphologie und Genomstruktur von HIV HIV und SIV (simian immunodeficiency virus) zählen wegen ihrer Morphologie (Gelderblom et al., 1987a; Gelderblom, 1991), ihrer Genomstruktur (Gonda et al., 1985; Wain- Hobson et al., 1985; Ratner et al., 1985; Sonigo et al., 1985; Guyader et al., 1987), sowie dem Krankheitsverlauf nach der Virusinfektion zu den Lentivirinae. Wie alle Retroviren sind HIV und SIV von einer Lipiddoppelmembran umhüllt (Abb. 1). In ihr sind sowohl zelluläre als auch virale Proteine eingelagert (Gelderblom et al., 1987b). Das virale glykosilierte Transmembranprotein gp41 (Gelderblom, 1991), ist mit dem viralen äußeren Glykoprotein gp120 nicht kovalent gebunden (Schneider, J. et al., 1986). Das

20 6 am N-Terminus myristilierte Protein p17 kleidet die Membran innen aus und ist über die Myristinsäure mit ihr assoziiert (Kalyanaraman et al., 1984; Göttlinger et al., 1989). Im Innern des Virus befindet sich das Core, das aus einem konischen oder tubulären Kapsid aus dem Protein p24 aufgebaut wird. Das p24 ist durch ein Linkprotein p6 mit der Lipiddoppelmembran verbunden (Göttlinger et al., 1991; Höglund et al., 1992). Im Virusinnenkörper liegen zwei gleiche einzelsträngige RNA-Moleküle, an die das Nukleinsäure-bindende Protein p7 (Cann und Karn, 1989; Gelderblom, 1991), Heterodimere p66/p51 der Reversen Transkriptase mit RNase H Aktivität (Gelderblom, 1991; Hostomsky et al., 1993; Le Grice et al., 1991), Integrase (Goff, 1992) und trna Primer gebunden sind. Das Enzym Protease findet sich sowohl im Core als auch im Raum zwischen dem Kapsid p24 und der Matrix p17. Das Spacer- Peptid sp1 (p2), das im Genom C-terminal vom p24 liegt, spielt beim Zusammenbau des Virions und für seine Infektiosität eine entscheidende Rolle (Kräusslich et al., 1995; Accola et al., 1998; Wiegers et al., 1998), das Spacer-Peptid sp2 (p1) befindet sich zwischen p7 und p6 und ist notwendig, um stabile reife Cores zu bilden (Carriere et al., 1995). Die Viruspartikel haben einen Durchmesser von nm. Die zwei RNA-Moleküle gleicher Sequenz im Innern des Kapsids enthalten die gesamte Erbinformation des Virus (Murphy und Kingsbury, 1990). Das Genom ist bei allen Retroviren ähnlich aufgebaut. Die kodogene, einzelsträngige RNA ist , bei HIV Nukleotide lang (Abb. 1). Die RNA der Retroviren kodiert für die viralen Strukturproteine Gag (group specific antigen), Pol (polymerase) und Env (envelope). Neben diesen drei Genen enthält das retrovirale Genom weitere offene Leseraster. Das in die Zell-DNA integrierte Genom (Provirus) wird an den 5'- und 3'-Enden von langen terminalen repetitorischen Sequenzen (LTR) flankiert. Die sequenzgleichen LTRs bestehend aus den Bereichen U3, R und U5 dienen zur Integration des Virus ins Wirtsgenom und zur Kontrolle der Gentranskription. Bei HIV und SIV wurden 7 weitere offene Leseraster beschrieben (Varmus, 1988). Die Produkte des Tat (trans-activator of transcription) und des Rev-Gens (regulator of virion protein) erhöhen die Expression der viralen Proteine (Sodroski et al., 1985; Malim et al., 1989a). Das Genprodukt von Tat erhöht die Menge an viraler RNA mehrere 100-fach durch die Bildung eines prozessiven Polymerase II Transkriptionskomplexes in Virus infizierten Zellen. Tat bindet zelluläre Proteine und lagert sich an die TAR-Region in R-U5 der LTRs an, wodurch eine Initiierung und Elongation der viralen Transkription bewirkt wird. Befindet sich kein Tat im infektiösen Provirus, so entstehen keine Virione (Dayton et al., 1986; Fisher et al., 1986).

21 7 Abb. 1: Genomstruktur, Proteinvorläufer, Proteine und schematischer Aufbau des HIV-1 Partikels (verändert nach Goff, 2001).

22 8 Oben: Genomstruktur. LTR: lange terminale repetitorische Sequenzen; gag: group specific antigen; pol: Polymerase-Gen; vif: viral infectivity factor; vpr: viral protein R; vpu: viral protein U; rev: regulator of virion protein; tat: trans-activator of transcription; env: Envelope-Gen; nef: negative regulator factor. Mitte (blau): Virale Proteine. Alle Strukturproteine sind durch ein Symbol dargestellt; Gag Vorläufer (Pr55 Gag ); MA: Matrixprotein; CA: Kapsidprotein; Sp1: Spacer-Peptid 1; NC: Nukleokapsidprotein; Sp2: Spacer-Peptid 2; Link: Linkprotein; PR: Protease; RT: Reverse Transkriptase; IN: Integrase; Vif: viral infectivity factor; Vpr: viral protein R; Tat: transactivator of transcription; Rev: regulator of virion protein; Vpu: viral protein U; Env Vorläufer: Vorläuferprotein für virale Hüllproteine; SU: Oberflächenprotein gp120; TM: Transmembranprotein gp41; Nef: negative regulator factor. Unten Viruspartikel: Das Partikel ist aus den viralen Strukturproteinen zusammengesetzt, wie sie als Symbole bei den Proteinen dargestellt sind. Das Tat-Gen besteht aus zwei Exonen, wobei ein Exon des Tat Proteins experimentell genauso viel transkriptionale Aktivierungseigenschaften hat wie ein komplettes Tat. Das terminale Tat-Kodon ist hoch konserviert, so dass angenommen wird, dass das Ein-Exon- und das Zwei-Exon-Protein während der produktiven Infektion in vivo unterschiedliche Funktionen besitzen. Bei allen Tat aus Primatenviren liegt der Zielort im Gegensatz zu Nicht- Primaten-Viren 3' vom Beginn der viralen Synthese (Rosen et al., 1985). Das Rev-Genprodukt liegt in einem neuen Leseraster, es besteht wie Tat aus zwei Exonen, jedoch ist jedem Exon eine klare Funktion zugeordnet. Exon 1 wird die Funktion der RNA-Bindung (RRE-Region [rev response element] im Env-Gen) (Hadzopoulou-Cladaras et al., 1989; Hammarskjold et al., 1989) und der nukleären Lokalisation zugeordnet, Exon 2 der geförderte Export aus dem Zellkern (Hadzopoulou-Cladaras et al., 1989; Malim et al., 1989b; Malim et al., 1990; Malim et al., 1991; Zapp et al., 1991). Bei fehlendem Rev akkumulieren Gag-Pol, Vif, Vpr, Vpu/Env mrnas nicht im Zytoplasma, so dass die Virusreplikation unzulänglich ist (Felber et al., 1989; Hammarskjöld et al., 1989; Sodroski et al., 1986). Für Retroviren ist die Anhäufung ungespleißter viraler RNA im Zellkern notwendig, da z.b. die Vorläufer für Gag-Pol und das komplette Genom mit 9,2 kb ungeschnitten den Zellkern verlassen muss, um dann in intakte Virione eingebaut werden zu können. In Retroviren ist dieses Problem durch suboptimale Spleißingstellen im Genom gelöst, die von den zellulären Spleißingfaktoren nur sehr ineffizient prozessiert werden.

23 9 Das myristilierte (Niederman et al., 1993) und phosphorylierte (Yang et al., 1999) Nef- Genprodukt (negative regulatory factor) reguliert die Expression des CD4-Rezeptors (Aiken et al., 1994) und des MHC I (Greenberg et al., 1998; Le Gall et al., 1998; Schwartz et al., 1996) herunter. Es erhöht die virale Infektiosität (Kestler et al., 1991; Kirchhoff et al., 1995), verändert zelluläre Stoffwechselwege, beeinflusst die T-Zell-Aktivität (Hanna et al., 1998) und die Viruslast in vivo (Miller, M.D. et al., 1994; Spina et al., 1994). Außerdem ist es mit zellulärer Kinase (Serin, Thyrosin) assoziiert (Cullen, 1994; Sawai et al., 1995; Lee, C.H. et al., 1996; Saksela et al., 1995), die mit 60 bis 200 Molekülen in die Partikel eingebaut wird (Jacque et al, 1998; Kotov et al., 1999). Das Vif-Gen (viral infectivity factor) ist für die Infektiosität des Virions verantwortlich (Strebel et al., 1987), beeinflusst die intermediäre Filamentstruktur (Henzler et al., 2001) und wird in geringen Mengen in die Virione eingebaut (Camaur et al., 1996; Fouchier et al., 1996; Karczewski et al., 1996; Liu et al., 1995; Simon et al., 1998b). Das Gen Vpu bei HIV-1 entspricht dem Gen Vpx bei HIV-2 (viral protein U bzw. X), wobei Vpu die Freisetzung des Virions und den Umsatz des CD4 Antigens (Crise et al., 1992; Willey et al., 1992) erhöht und dessen Degradation bewirkt (Bour et al., 2001), während das Vpx-Gen für den Import des Reverse Transkriptase-Komplexes in den Zellkern verantwortlich ist (Fletcher, 1996) und in großen Mengen in die Viren eingebaut wird (Henderson et al., 1988, Kewalramani, V.N., 1996, Wu et al., 1994). Das Produkt des Vpr- Gens (viral protein R) hat einen Einfluss auf den nukleären Import. Es scheint mit den "Transport-Rezeptoren" Importin α, Importin β im Zytoplasma (Popov et al., 1998 a, Popov et al., 1998 b, Vodicka et al., 1998) zu interagieren, aber auch alternative nukleäre Transportwege wurden beschrieben (Jenkins et al., 1998). Andere Autoren berichten, dass die Funktion des Vpr unabhängig von den Importinen ist. Eine Interaktion mit Nukleoporinen scheint gesichert (Fouchier et al., 1998), ebenso wie die Arretierung des Zellzyklus in der G 2 -Phase (Poon et al., 1998). Vpr induziert evt. Apoptose (Gaynor et al., 2001; Zhu, Y. et al., 2001). Es wird in hohen Mengen in die Partikel eingebaut. Tev, auch TNV genannt, besteht aus dem ersten Tat-Exon und aus Env- und Rev- Exonen (Rice et al., 1993). 1.5 HIV-Infektion und -Replikation HIV wird über Körperflüssigkeiten wie Sperma und Blut übertragen (Centers for Disease Control, 1985) und kann T-Helferzellen, B-Zellen, Monozyten und Astrozyten infizieren (Ho et al., 1986; Cheng-Mayer et al., 1987; Dewhurst et al., 1987). Bei T-Helferzellen oder Makrophagen lagert sich das reife Virus mit einem C-terminalen Epitop des gp120 (Kowalski et al., 1987; Lasky et al., 1987; Cordonnier et al., 1989) an den CD4-Rezeptor der Zellen an (Klatzmann et al., 1984; Levy, J.A. et al., 1985;

24 10 Dalgleish et al., 1984) und interagiert dann mit einem Chemokinrezeptor, meist CXCR4 oder CCR5, was wahrscheinlich durch das gp41 induziert wird (Gonzalez-Scarano et al., 1987), das mit einer stark hydrophoben Domäne in die zelluläre Membran integriert wird (s. Abb. 2). Die virale HIV-1 Membran fusioniert direkt mit der zellulären Plasmamembran. Bei den Chemokinrezeptoren wurde in den letzten Jahren eine Superfamilie von Rezeptoren identifiziert. CXCR4 (CXC Chemokinrezeptor 4) ist der wichtigste Corezeptor für T-zelltropische (T-tropische) HIV-1 Isolate (X4-Viren) (Feng et al., 1996) und wird in dendritischen Zellen (Granelli-Piperno et al., 1996), Nicht-Gedächtnis-T-Zellen (Bleul et al., 1997), Neuronen und Mikroglia (Lavi et al., 1997), frischen primären Monozyten (Di Marzio et al., 1998; Yi et al., 1998), Endothelzellen (Gupta et al., 1998; Volin et al., 1998), Neutrophilen und B-Zellen (Forster et al. 1998) exprimiert. Physiologischer Ligand ist der Bindegewebsfaktor SDF-1 (Bleul et al., 1996; Oberlin et al., 1996). PHA stimuliert die CXCR4-Expression in PBMC (Bleul et al., 1997). CCR5 (Chemokinrezeptor 5) ist der wichtigste Corezeptor für makrophagentropische (M-tropische) HIV-1 Isolate (Choe et al., 1996) und wird in dendritischen Zellen (Granelli- Piperno et al., 1996), aktivierten Gedächtnis-T-Zellen (Bleul et al., 1997), Mikroglia (He et al., 1997; Simmons et al., 1997) und Gewebemakrophagen (Wu, L.J. et al., 1997) exprimiert. Physiologische Liganden sind das Makrophagen inflammatorische Protein 1α (MIP-1α), MIP-1β, RANTES (regulated on activation, normal T cell expressed and secreted) (Alkhatib et al. 1996; Deng et al., 1996; Doranz et al., 1996; Dragic et al., 1996). Der Corezeptor STRL33 ist spezifisch für verschiedene primäre HIV-1 Isolate, z.b. HIV-1 92HT593 und HIV-1 92BR025 (Deng et al., 1997). An STRL33-transfizierten Zellen konnte auch Aktivität mit T-tropischen HIV-1 LAV, IIIB, M-tropischen HIV-1 SF162, ADA, Ba-L, JR-FL mit HIV (Liao et al., 1997) und verschiedenen HIV-2 und SIV Isolaten gezeigt werden (Alkhatib et al., 1997; Deng et al., 1997; Loetscher et al., 1997). STRL33 wird in primärem lymphoiden Gewebe, IL-2/PHA-stimulierten tumorinfiltrierten Lymphozyten (TILs) (Liao et al., 1997), Monozyten und in der Plazenta (Littman et al., 1998) exprimiert. Sequenzanalysen zeigen am ehesten eine Verwandtschaft mit den Rezeptoren der Gruppe STRL22/ GPR-9-6/EBI1 (Liao et al., 1997). US28 kann als Corezeptor für die M-tropischen HIV-1 ADA, HIV-1 Jr-CSF, für die T-Zelllinien adaptierten Stämme HIV-1 LAI und HIV-1 NDK und für HIV-2 ROD (Pleskoff et al., 1997; Rucker et al., 1997) dienen. Er ist laut Sequenzanalyse am engsten mit V28 verwandt (McFadden et al., 1998). V28 ist ein Rezeptor für den neuen membrangebundenen Chemokin-Vorläufer Fraktalkin (Imai et al., 1997). Er kann als Corezeptor für HIV-1 92UG024.2, HIV und HIV-2 SBL6669 dienen. V28 wird in CD16 + Natürlichen Killerzellen (NK) und in neuralem Gewebe hoch

25 11 exprimiert (Rucker et al., 1997) und ähnelt am meisten dem US28-Rezeptor. GPR1 ist ein Corezeptor für 2 SIV-Isolate und zeigt keine Aktivität mit einem breiten Spektrum von HIV-1 Isolaten einschließlich HIV-1 ADA, JR-FL, YU2, 89.6 (Farzan et al., 1997). Er wird im Hippocampus-Gewebe (Marchese et al., 1994), in der Neuroglioma-Zelllinie U87 und in alveolären Makrophagen (Farzan et al., 1997) exprimiert. GPR1 ähnelt dem Angiotensinrezeptor und dem Dez und Apj Chemokinrezeptor am meisten (Farzan et al., 1997). Sequenzanalysen finden ein Motiv mit 3 Tyrosinresten in der N-terminalen extrazellulären Region wie es auch für die CCR5 Corezeptorfunktion notwendig ist (Farzan et al., 1998). GPR15 zeigt Corezeptorfunktion für verschiedene SIV- und HIV-2 Isolate, die makrophagentropischen Isolate HIV-1 ADA und HIV-1 YU-2 und das T- und M-tropische Isolat HIV-1 92HT593, aber nicht für das T- (HXB2) oder M-tropische HIV-1 Isolat (Ba-L) (Deng et al., 1997; Farzan et al., 1997; Owen et al., 1998). GPR15 ist nur entfernt mit den anderen Chemokinrezeptoren verwandt (Samson et al., 1998), weist aber genau wie CCR5 ein Motiv mit drei Tyrosinresten in der N-terminalen extrazellulären Region auf (Farzan et al., 1998). Apj zeigt Corezeptorfunktion mit den primären T-zelltropischen Isolaten HIV-1 ELI, HIV-1 UG21, dem T- und M-tropischen Isolat HIV , weniger Affinität mit den T-zellangepassten Isolaten HIV-1 MN, HIV-1 HXB2, SIV mac-239, SIV mac-316 und gar nicht für die makrophagentropischen primären HIV-1 Isolate HIV-1 ADA, HIV-1 JR-FL oder HIV-1 YU2. Dieser Corezeptor wird in PHA/IL-2 stimulierten peripheren mononukleären Blutzellen exprimiert (Choe et al., 1998). Apj weist ebenfalls ein Tyrosinmotif im N-Terminus auf und hat die größte Ähnlichkeit mit dem Angiotensinrezeptor (O Dowd et al., 1993). ChemR23 zeigt Corezeptoraktivität mit verschiedenen SIV-Isolaten und HIV-1 92UG024-2, wird in Makrophagen und in dendritischen Zellen exprimiert (Samson et al., 1998). Nach der Fusion der viralen HIV-1 Membran mit der zellulären Plasmamembran erfolgt das Uncoating. Der Prozeß des Uncoating ist für HIV ungeklärt, für andere Retroviren aber wird der Prozess als Abdauen der Virushülle und des Virusinnenkörpers mit Hilfe der Lysosomen beschrieben. Zunächst findet nur ein partielles Uncoating der "subviralen" Partikel im Zytoplasma statt und die Reverse Transkription des viralen RNA-Genoms wird initiiert (Baltimore, 1970; Temin und Mizutani, 1970). Möglicherweise ist das Kapsidprotein p24 für den Prozess des Uncoating wichtig, da die Phosphorylierung von drei Serinresten im p24 das Uncoating verhindert (Cartier et al., 1999). Aus dem so entstandenen RNA-DNA-Hybrid wird die RNA mit der viralen RNase H, die mit der Reversen Transkriptase assoziiert ist, abgedaut und die so entstandene einzelsträngige DNA mit Hilfe der zellulären DNA-

26 12 Abb. 2: Replikationszyklus des HIV (nach Freed et al., 2001). CD4: CD4-Rezeptor; Chemokincorezeptor: (z.b. CXCR4, CCR5); Envelope: Envelope- Polyproteine; Gag/GagPol: Gag- und Gag/Pol-Polyproteine. Zellfreie Virionen (Schritt 1) interagieren sowohl mit dem CD4- als auch dem Chemokinrezeptor. Im Falle des HIV ist der Eintritt des Virus in die Zelle (Schritt 2) ein ph-abhängiger Prozeß, bei dem die virale und die zelluläre Membran fusionieren und bei dem ein partielles Uncoating (Schritt 3) der eindringenden Viren stattfindet. Innerhalb der subviralen Partikel findet die Reverse Transkription im Zytoplasma der infizierten Zellen statt (Schritt 4). Das doppelsträngige DNA-Produkt wird in den Zellkern transportiert (Schritt 5), wo es mit Hilfe der viralen Integrase in die chromosomale DNA integriert wird (Schritt 6). Die integrierte virale DNA dient als Template für die DNA-abhängige RNA-Polymerase (POL II) und führt zur Produktion von mrnas (Schritt 7), die im Zytoplasma der infizierten Zellen in virale Proteine translatiert werden. Envelope (Schritt 8) und Gag plus Gag/Pol (Schritt 9)

27 13 Polyproteine werden zur Plasmamembran transportiert, wo das Budding aus den Zellen stattfindet und unreife Partikel abgeschnürt werden (Schritt 10). Nachfolgende Proteolyse durch viruskodierte Protease erzeugt reife Partikel (Schritt 11) mit einem charakteristischen kondensierten Core. Nicht mit Virus verknüpftes gp120 Envelope Protein wird ebenfalls aus den Zellen freigesetzt (Schritt 12). Polymerase in doppelsträngige DNA umgeschrieben. Diese doppelsträngige DNA kann sich dann mit Hilfe der LTRs über homologe Rekombination zu einem Ring schließen, bei dem entweder beide LTRs erhalten bleiben oder eine LTR verloren geht. Diese ringförmigen DNAs verbleiben im Zytoplasma und können transkribiert werden (Panganiban, 1985). Die doppelsträngige DNA wird in den Zellkern transportiert und mit Hilfe des viralen Enzyms Integrase in die chromosomale DNA integriert (Braun et al., 1987; Lobel et al., 1989). Die Integration des viralen Genoms in das zelluläre Genom erfolgt durch Einzelstrangbrüche an beliebiger Stelle des Wirtsgenoms. Das sog. Provirus wird durch die zelluläre RNA-Polymerase II (DNA-abhängige RNA- Polymerase) transkribiert. Zunächst werden Tat und Rev exprimiert (Muesing et al., 1985). Das Tat-Protein bindet an die TAR-Region (trans-activation responsible region) in der LTR und erhöht dadurch die Transkriptionsrate (Arya et al., 1985; Dayton et al., 1986; Kao et al., 1987; Muesing et al., 1987). Die ungespleißten Transkripte enthalten die gesamte genetische Information des Virus und dienen im Zytoplasma als Matrize für die Translation der Strukturproteine von Gag, Pol und Env und als genomische RNA der neuen Partikel. Aus dem Vorläuferprotein des Gag-Pol-Bereichs entstehen durch die viruseigene Protease die Gag- und Pol-Proteine (Kramer et al., 1986; Debouck et al., 1987). Aus dem großen Gp160-Vorläuferprotein, für das das Env-Gen kodiert, entstehen durch zelluläre Enzyme das Gp41 und das Gp120, die sich in die Zellmembran einlagern (McCune et al., 1988; Stein, B.S. et al., 1990). Env und Gag/Pol-Polyproteine werden über unabhängige Wege in die zelluläre Plasmamembran transportiert. Dort beginnt der Zusammenbau des Viruspartikels mit der Anreicherung des Gag-Vorläufermoleküls an der Zellmembran (Göttlinger et al., 1989). Es bilden sich unreife Viren, die alle Proteine eines reifen Virus enthalten (Gelderblom, 1991). Provirus-Partikel beginnen mit dem Budding aus den Zellen und werden als unreife Partikel aus den Zellen freigesetzt. Der Virusinnenkörper verdichtet sich erst während der Abschnürung zu einer konischen oder tubulären Form (Gelderblom, 1991). Für die

28 14 Morphogenese des Viruscores ist die Membranlokalisation durch die Myristilierung des p17 essentiell (Gheysen et al., 1989). Das Virus umhüllt sich während des Ausschleusungsprozesses mit der Lipidmembran der Zelle, die die eingelagerten viralen Glykoproteine enthält. Durch die Aktivität der viralen Protease in den freien Virionen entstehen reife Partikel mit ihrem charakteristischen Core. Am Ende dieses Vorgangs entstehen infektiöse Virionen. Unabhängig vom Virus wird Gp120 Env Protein aus den Zellen freigesetzt. 1.6 Antiretrovirale Therapie In den Jahren 1987 bis 1990 wurde die Monotherapie mit den Reverse Transkriptase Inhibitoren (RTIs) 3'-Azido-2',3'-dideoxythymidin (AZT, Zidovudin), 2',3'-Dideoxyinosin (DDI, Didanosin) und 2',3'-Dideoxycytidin (DDC, Zalcitabin) eingeführt. Da bei einer Monotherapie sehr schnell Resistenzen gegen die RTIs entstehen, führte die Behandlung lediglich zu einer durchschnittlichen Lebensverlängerung von ca. 6 Monaten. Zwischen 1991 und 1993 wurden Kombinationstherapien der RTIs eingesetzt, um den Behandlungserfolg zu verbessern und die Resistenzentstehung hinauszuzögern. Erst seit 1996 kann die HIV- Erkrankung durch die kombinierte Gabe von RTIs und Protease Inhibitoren (PIs) nachhaltig behandelt und die Krankheitsprogression gestoppt werden. Dieser medizinische Fortschritt kommt nur der westlichen Welt in den USA und Westeuropa zugute, während sich die Epidemie in anderen Staaten, in denen oft aus wirtschaftlichen Gründen keine teure Kombinationstherapie durchgeführt werden kann, immer noch weiter ausbreitet. Betroffen hiervon sind besonders Schwarzafrika, Südostasien, Indien und die ehemalige Sowjetunion. Die Indikation zur antiretroviralen Behandlung wird ständig neu überarbeitet und jährlich verändert, auch der ideale Beginn einer Therapie wird unterschiedlich beurteilt. Als gesicherte dringende Behandlungsindikationen gelten AIDS, HIV-assoziierte Symptome bzw. Immunthrombozytopenie, Viruslast mit > Kopien/ml Plasma, CD4-Zellen < 350/µl, Patienten mit relevanter Zunahme der Viruslast und Patienten mit relevanter Abnahme der CD4-Zellen. Therapieziel jeder Behandlung ist es, die Virusreplikation maximal zu senken, die Selektion von resistenten Virusstämmen zu verhindern, die Progression der Erkrankung aufzuhalten und die Rekonstitution eingeschränkter Immunfunktionen zu erreichen. Zudem müssen die zahlreichen opportunistischen Infektionen behandelt werden, sofern sie nicht durch die Senkung der Viruslast und die Stabilisierung des Immunsystems zurückgehen. Daher werden zunehmend Kombinationstabletten wie z.b. Trizivir (2',3'-Didehydro- 2',3'-Dideoxyguanosin [ABC, Abacavir], 3'-Azido-2',3'-dideoxythymidin [AZT, Zidovudin], 2',3'-Dideoxy-3'-Thiacytidine [3TC, Lamivudin]) oder Kaletra (ABT-378 [Lopinavir], ABT-538 [RTV, Ritonavir]) entwickelt, um die Compliance der Patienten durch eine

29 15 geringere Anzahl von Tabletten, seltenere und unkompliziertere Verabreichung zu erhöhen. Bei Drogenabhängigen wird versucht, die antivirale Medikation durch Einmalgabe an die Ausgabe des Drogenersatzstoffes Methadon zu koppeln. Nicht vorbehandelte HIV-infizierte Patienten werden zur Zeit bei Therapieinduktion mit zwei RTIs und einem Protease-Inhibitor (PI) behandelt. Dadurch lässt sich bei den meisten Patienten in der Erstbehandlung die Viruslast des HIV unter die Nachweisgrenze senken und ein Anstieg der CD4-Werte erreichen. Zur raschen effizienten Senkung der Viruslast werden auch 5-fach Medikamentenkombinationen bei Behandlungsinduktion eingesetzt und dann eine geringer medikamentierte Erhaltungstherapie fortgeführt (Kamps et al., 2000). Mittlerweile sind zahlreiche Medikamente zur ursächlichen Behandlung der HIV- Krankheit zugelassen (Tab. 2). Hierbei werden neben den RTIs und PIs therapeutisch ergänzend nicht-kompetitive Reverse Transkriptase Inhibitoren (NNRTIs, s.u.) eingesetzt. Reverse Transkriptase Inhibitoren, wie z.b. AZT, sind Nukleosidanaloga, die erst intrazellulär durch Phosphorylierung in ihre wirksame Form überführt werden müssen. Diese Pyrimidin- oder Purinderivate werden unter Abspaltung von Pyrophosphat während der Synthese in die DNA eingebaut. Da diesen Verbindungen am C-3 der Desoxyribose die notwendige Hydroxylgruppe zur weiteren DNA-Synthese fehlt, kommt es nach Einbau dieser Nukleosid-Derivate zu einem Kettenabbruch. Es scheint keine klare Beziehung zwischen Wirkung und Plasmaspiegeln zu bestehen. Protease Inhibitoren wurden anhand der Kristallstruktur der HIV-Protease entwickelt (Navia et al., 1989; Wlodawer et al., 1989). Sie wirken wahrscheinlich während oder kurz nach dem Ausknospen der Viren und unterdrücken den viralen Reifungsprozess in bereits infizierten Zellen, so dass es nur noch zur Expression von unreifen, nicht infektiösen Virushüllen kommt. Nicht-kompetitive Reverse Transkriptase Inhibitoren (NNRTIs) haben einen gemeinsamen Bindungsort in einer hydrophoben Tasche der RT, der sich vom aktiven Zentrum, dem Bindungsort der Nukleosidanaloga, unterscheidet und hemmen die Reverse Transkriptase nicht kompetitiv. NNRTIs dürfen aufgrund von schneller Resistenzbildung bei nur wenigen Tagen Monotherapie nicht alleine verabreicht werden.

30 16 Tab. 2: Zugelassene Medikamente zur antiretroviralen Behandlung Reverse Transkriptase Inhibitoren: Wirkstoff Abk. Generikum Handelsname Quelle Zulassung 3'-Azido-2',3'- AZT Zidovudin Retrovir Furman et al., 1986 BRD dideoxythymidin Mitsuya et al., ',3'-Dideoxy-3'- 3TC Lamivudin Epivir Schinazi et al., 1992b BRD Thiacytidine Lisignoli et al., ',3'-Dideoxyinosin DDI Didanosin Videx Yarchoan et al., 1989a/b BRD 2',3'-Dideoxycytidin DDC Zalcitabin Hivid Yarchoan et al., 1988a BRD 2',3'-Didehydro-2',3'- D4T Stavudin Zerit Lin et al., 1987 BRD dideoxythymidin 2',3'-Didehydro-2',3'- ABC Abacavir Ziagen Vince et al., 1988 BRD Dideoxyguanosin (Carbovir) AZT/3TC Combivir BRD AZT/3TC /ABC Trizivir USA Protease-Inhibitoren: Wirkstoff Abk. Generikum Handelsname Quelle Zulassung Ro SQV Saquinavir Invirase Craig, J.C. et al., 1991 BRD / Fortovase IDV Indinavir Crixivan Lang et al., 1993 BRD AG1343 NFV Nelfinavir Viracept Chapman et al., 1995 BRD ABT-538 RTV Ritonavir Norvir Kempf et al., 1995 BRD VX-478/141W94 APV Amprenavir Agenerase Navia et al., 1995 USA ABT-378? Lopinavir/r? Sham et al., 1998 USA RTV /Lopinavir Kaletra USA Non-kompetitive Reverse Transkriptase Inhibitoren: Wirkstoff Abk. Generikum Handelsname Quelle Zulassung DLV Delavirdin Rescriptor Polsky, 1996 USA EFV Efavirenz Sustiva Young et al., 1995 BRD NVP Nevirapin Viramune Cheeseman et al., 1993 BRD

31 Entwicklung neuer antiretroviraler Wirkstoffe Die Entwicklung neuer Therapeutika gegen die HIV-Erkrankung bleibt trotz der Therapieerfolge in den letzten Jahren notwendig. Durch die lebenslange antivirale Behandlung, die z.zt. ohne längere Unterbrechungen durchgehalten werden muss, sind Medikamentenumstellungen bei zu großen Nebenwirkungen und Therapieresistenz erforderlich. Resistenzen gegen mehrere antivirale Substanzen (Multidrug-Resistenz) wurden bereits beschrieben. (Doerr et al., 1996; Signoretti et al., 1997; Balzarini et al., 1998; Gomez, C.M. et al., 1998; Winters et al., 1998; Sugiura et al., 1999; Garcia et al., 2000; Kim, E.Y. et al., 2001; Lukashov et al., 2001). Ein weiteres wichtiges Problem der aktuellen AIDS-Therapie liegt in der Anwendung sehr ähnlicher Stoffe, die nur an zwei verschiedenen Stellen des viralen Zyklus, der Reversen Transkriptase und der Protease, ansetzen (Mathe et al., 1997). Prinzipiell kann eine antivirale Therapie jedoch an jeder viralen Komponente, jedem Schritt des viralen Zyklus (1.5) und jedem beteiligten zellulären Element ansetzen. Tab. 3 zeigt eine Zusammenfassung der bisher bekannten Angriffspunkte für eine anti-hiv Therapie. So wird versucht, Antikörper (Sutor et al., 1992; Schedel et al., 1999), Peptide (Lifson et al., 1988), Bizyklamderivate (De Clerq, 1998) oder lösliche CD4-Moleküle (Traunecker et al., 1988; Shinya et al., 1999) zu entwickeln, die die Adsorption des Virus an den zellulären CD4-Rezeptor oder den Chemokinrezeptor (Cascieri, 2000; Louache et al., 1992) verhindern könnten. Die Virusadsorption kann durch Gabe sulfatierter Polysaccharide (Schols et al., 1990; Witvrouw et al., 1997) wie das Dextransulfat (Mitsuya et al., 1988; Baba et al., 1990 a; Baba et al., 1990 b; De Clercq, 1990; Argolo-Ferraro, 2001), Chondroitinpolysulfat (Jurkiewicz et al., 1989; Amzazi et al., 1998; Ylisastigui et al., 2000) und Suramin (Mitsuya et al., 1984; Biard-Piechaczyk,-M et al., 2000) behindert werden. Bei den Chemokinrezeptoren wurde in den letzten Jahren eine Superfamilie von Rezeptoren identifiziert, so dass jetzt spezifischere antivirale Substanzen entwickelt werden können. Antivirale Substanzen, die die Interaktion zwischen Envelope und CXCR4 stören können, sind z.b. Suramin (Biard-Piechaczyk et al., 2000), T22, ein 18-Aminosäurenpeptid (Polyphemusin) aus Tachypleus und Limulus (Masuda et al., 1992; Nakashima et al., 1992; de Clerq, 2000), AMD3100, ein Bizyklam aus zwei identischen 1,4,8,11-Tetraazacyclotetradecane (Cyclam) (Schols et al., 1997), ALX40-4C (N-alpha-acetyl-nona-D-arginine amide acetate) (Sumner-Smith et al., 1995; Luo et al., 1999), ein monoklonaler Antikörper (12G5) (Huerta et al., 2002), SDF-1 und SDF-1α. SDF-1 und Phorbol-12-myristat-13-acetat

32 18 Tab. 3: Virale und zelluläre Komponenten als Ziele zur Entwicklung von anti-hiv Substanzen Virale Komponenten (verändert nach Gag Proteine und Vorläufer Matrixprotein p17 Kapsidprotein p24 Vorläufer p9 (p2 + p7) Spacer-Peptid p2 Nukleokapsidprotein p7 Vorläufer p7 (p1 + p6) Spacer-Peptid p1 Link p6 Virale Enzyme Polymerase p61, p55 Reverse Transkriptase Rnase H Protease p10 Integrase p32 Regulatorische Proteine Tat Rev Nef Vif Vpr Vpu Vpx Tev Envelope Proteine Oberflächenglykoprotein gp120 Transmembranprotein gp41 Nukleinsäuren HIV RNA Zelluläre Komponenten (verändert nach Zelluläre Rezeptoren (Immunglobulin Superfamilie) CD4 Chemokinrezeptor Superfamilie CXCR4 (Fusin, LESTR, NPY3R) CCR5 (CKR-5, CMKRB5) CCR3 (CC-CKR-3; CKR-3; CMKBR3) CCR2 (CCR2b; CMKBR2) CCR1 (CKR1; CMKBR1) CCR4 (CKR-4) CCR8 (ChemR1; TER1; CMKBR8) CCR9 (D6) CXCR2 (IL-8RB) STRL33 (Bonzo; TYMSTR) US28 V28 (CMKBRL1; CX 3 CR1; GPR13) gpr1 (GPR1) gpr 15 (BOB; GPR15) Apj (Angiotensinrezeptor ähnlich, AGTRL1) ChemR23 Zelloberflächenmoleküle CD26 Heparansulfat Proteoglykane Galactoceramide Erythrozyten exprimierte Glykolipide Andere Zelloberflächenmoleküle Intrazelluläre Zielorte Zelluläre Enzyme N-Myristoyltransferase Glykosilierungsenzyme gp-160 prozessierende Enzyme Ribonukleotidreduktase Polyamin-Biosynthese Zelluläre Transkriptionsfaktoren Sp1 NF-kB Zytokine und second messenger Tumornekrosisfaktor-α (TNF-α) Interleukin 1α (IL-1α) Interleukin 6 (IL-6) Phospholipase C Proteinkinase C Intrazelluläres Kalzium Zelluläre akzessorische Moleküle Cyclophiline MAP-Kinase (Mitogen aktivierte Proteinkinase) ERK-Kinase (extrazelluläre signalregulierte Kinase)

33 19 (PMA) zeigen eine rasche CXCR4 Endozytose und modulieren CXCR4 hinunter (Signoret et al., 1997). Eine Störung der CCR5 Corezeptoraktivität durch antivirale Substanzen kann sowohl durch die natürlichen Liganden MIP-1α, MIP-1β und RANTES als auch das modifizierte Analog AOP-RANTES (Simmons et al. 1997), die Peptide RANTES[9-68] (Arenzana-Seisdedos et al., 1996) und RANTES[3-68] (Proost et al., 1998), ein Decapeptid aus den Resten 1-10 von RANTES bewirkt werden. Für die übrigen Corezeptoren der Superfamilie wurden bisher keine antiviralen Substanzen entwickelt. Im nächsten Schritt des viralen Zyklus kann das Uncoating im Zytoplasma durch Gabe von Hypericin oder Pseudohypericin verhindert werden (Lavie et al., 1989). Als zusätzliche RT-Inhibitoren sind AZDU (3'-Azido-2',3'-dideoxyuridin) (Eriksson et al., 1989; Chu et al., 1989; Zhu, Z. et al., 1990; Clark et al., 2001), Tenofovir DF, ein Adenosinanalogon (Tenofovir Disoproxil Fumarat) (Barditch-Crovo et al., 2001), d4t XR (Zerit) (Hoffmann, 2002), DPC, oral verabreichte Cytidin-Analoga (Corbett et al., 1999), Polyribonukleotide (Broom et al., 1995), Suraminderivate (Jentsch et al., 1987) und weitere NNRTIs (nicht kompetitive Reverse Transkriptase Inhibitoren) wie TIBO R (Tetrahydroimidazobenzodiazepinon) (Pauwels et al., 1990; Debyser et al., 1991; Hara et al., 1997; Kucera et al., 1998), HEPT (1-(2-Hydroxyethoxymethyl-6-phenylthiothymin) (Baba et al., 1989; de Clerq 1997; Witvrouw et al., 1999), ATV (Atevirdine Mesylat) (Romero, 1994) und azyklische Nukleosidphosphonate (PMEA, PMPA) in präklinischen und klinischen Studien (Gong et al., 1994; de Clerq, 1998). TMC (Trimethylcarbonat) (Yoshimura et al., 2002) wirkt gegen Wildtyp-Viren und gegen NNRTI-resistente Viren. Tipranavir ist der erste nichtpeptidische Proteasehemmer und zeigt eine gute Wirkung gegen PI-resistente Viren (Hoffmann, 2002). Atazanavir ist ein Proteasehemmer mit günstigem Lipidprofil sowohl für Triglyzeride als auch für Cholesterin (Haas et al., 2002). Die Integration der viralen DNA könnte durch Integrase-Inhibitoren (Pani et al., 2000) wie S-1360 (Stephenson, 2002) unterdrückt werden. Nair (2002) beschreibt in einer Übersichtsarbeit mehr als 30 potentielle Wirkstoffe, darunter eine ganze Reihe Mono-, Oligo- und Dinukleotide und einige andere Substanzen wie z.b. Doxorubicin, Ethidiumbromid und die Antimalariamittel Chloroquin und Primaquin. Die Transkription oder Translation könnte durch Antisense-Oligonukleotide behindert werden (Uhlmann et al., 1990; Cohen, 1991; Lisziewicz et al., 1993, Yamaguchi et al., 1997), wenn das Virus bereits in die zelluläre DNA integriert ist. Bei den regulatorischen viralen Proteinen wurden Tat-Antagonisten (Lapidot et al., 2000), der Tat-Inhibitor Ro , ein Benzodiazepin (Camsonne et al., 1993), Suraminderivate (Rusnati et al., 1998) und antisense Oligonukleotide gegen tat (Doerr et al., 1996) entwickelt. Eine Gentherapie mit veränderten Lymphozyten, die ein anti-hiv-gen als

34 20 Insert enthalten (RevTD oder Rev-TD-antiTAR plus ein Markergen) wird aktuell klinisch getestet. Hierbei ist jedoch zu betonen, dass bis heute noch nie eine Gentherapie - auch nicht für einen anderen Bereich - vom FDA zugelassen wurde. Durch die Inhibition von nef würde die virale Replikation verlangsamt und infizierte Zellen besser durch das Immunsystem erkannt (Miller, R.H. et al., 1995; Piguet et al., 1999). Die Assoziation von Vif mit dem Wirtsprotein HP68 scheint für die Bildung unreifer Kapside verantwortlich zu sein (Zimmerman et al., 2002). Veränderungen der Struktur am Zinkfinger des Nukleokapsidproteins p7 führen zum Verlust der Infektiosität (Druillennec, 2000). Posttranslationale Modifikationen der Virusproteine durch Protease-Inhibitoren, die eine proteolytische Spaltung der Virusvorläuferproteine inhibieren, sind zur Zeit sehr erfolgreich eingesetzte Medikamente in der antiviralen Therapie. Glykosidase-Inhibitoren wie das Castanospermin (Walker et al., 1987) und Desoxynojirimycin (Karpas et al., 1988) greifen während der Synthese der Kohlehydrat-Anteile von Glykoproteinen ein. Im letzten Schritt des Zyklus kann der Zusammenbau und das Ausschleusen des Virus gestört werden (Yarchoan et al., 1988; Schinazi et al., 1992 a). Dehydroepiandrosteron (DHEA) soll die Replikationsaktivierung des HIV durch die Störung metabolischer und zellulärer Signalstoffwechselwege beeinträchtigen (Yang et al. 1994). Die Polyamin-Biosynthese ist in die Kontrolle vieler biologischer Prozesse wie Karzinogenese, Zellwachstum, Differenzierung, Gentranskription und Translation involviert. Inhibitoren wie Methylacetylenputrescin (MAP), Alpha-Monofluoromethyldehydroornithinmethylester (MFMOME), MDL 73811, 1-Aminooxyethylamin (AEA) haben potentiellen klinischen Wert als Antitumor- und antiparasitische Substanzen (Chiang et al., 1996). Cyclosporin A und SDZ NIM 811 inhibieren die HIV-Infektion durch Störung der Wechselwirkung von Cyclophilin A und HIV-1 Gag-Proteinen (Luban et al., 1993; Rosenwirth et al., 1994). Die Gabe von Interferonen könnte die Störung des endogenen Interferonsystems beheben (Groopman et al., 1989; Begemann et al. 1999). Eine Rekonstitution des Immunsystems wird durch Transplantation peripherer Stammzellen mit oder ohne vorherige Gabe weißer Blutkörperchen untersucht. Monoklonale Antikörper, die Krebszellen erkennen und sie entweder töten oder tötende Substanzen aktivieren, ohne andere Zellen zu schädigen, werden zur Behandlung des Non-Hodgkin-Lymphoms bei HIV-Infektion, in klinischen Studien untersucht. Die Verabreichung von Interleukinen wie IL-2 und IL-12 und G-CSF soll das Immunsystem der Patienten stärken. Schließlich wird versucht, die Apoptose bei der HIV- Infektion durch Caspase-Inhibitoren aufzuhalten (Deigner, 1999).

35 Resistenz gegen Chemotherapeutika Eine Resistenz gegen Chemotherapeutika kann sich auf viraler und zellulärer Ebene ausbilden, wobei auch mehrere Resistenzmechanismen nebeneinander wirksam sein können, die sich gegenseitig beeinflussen. Bei der HIV-Krankheit unterscheidet man zwischen genotypischen und phänotypischen viralen Resistenzen. Bei der genotypischen Resistenzbestimmung wird DNA aus Patientenblut sequenziert und die Nukleotidsequenz des pol-gens aus dem HIV mit der Wildtyp-DNA eines bestimmten Virus verglichen. Bei phänotypischen Methoden findet vor allem ein Vergleich der Wachstumsfähigkeit eines Virus in Anwesenheit eines bestimmten Medikaments mit dem Wildtypstamm statt. Beide Methoden können immer nur Aufschluss über die dominante Virusvariante geben, die mindestens 20 % der Viruspopulation bei einer Mindestviruslast von 1000 Kopien/ml ausmachen muss. Häufig vorkommende Mutationen, sog. "Eckpfeilermutationen" können einen Hinweis auf eine sich noch entwickelnde Resistenz geben, noch bevor diese phänotypisch in Erscheinung getreten ist. Andererseits sind bei zahlreichen Mutationen ihre Auswirkungen auf den Phänotyp nicht interpretierbar. Phänotypische Tests hingegen machen eine Aussage über die Empfindlichkeit des Virusstamms, auch wenn (noch) keine genetischen Veränderungen nachweisbar sind. Die Auswirkungen unterschiedlicher Mutationen auf die Wirksamkeit eines Medikaments und auf Kreuzresistenzen kann klarer beschrieben werden. Abb. 3: Strukturformel des AZT (nach Yarchoan, 1990)

36 22 Tab. 4: Häufige Mutationen im HIV pol-gen mit Einfluss auf die Arzneimittelresistenz (verändert nach Kamps et al., 2000) Medikament Aminosäure-Position Aminosäure-Austausch Kreuzresistenz AZT DDI DDC D4T AZT-typische Mutationen M L D N K R T Y/F K Q/E K R L V M V K R T D M V 3TC 184 M V Abacavir K R L V Y F M V Multiresistente Stämme A V T SSS F L F Y Q M L W T W T Y/F Hochresistente Virusstämme zeigen eine reduzierte Sensibilität gegen andere RTIs DDC 3TC 3TC, DDI (?), DDC (?) ZDV, DDI, DDC, D4T, 3TC, ABC Die Ausbildung einer Resistenz gegen das Anti-HIV-Chemotherapeutikum AZT (Abb. 3) wurde erstmals 1989 gehäuft bei AIDS-Patienten beobachtet (Larder et al., 1989a). In einigen Virusisolaten aus HIV-1 Patienten konnte die AZT-Resistenz mit 4 (Larder et al., 1989c; Rooke et al., 1989) bzw. 5 Aminosäure-Austauschen (St. Clair et al., 1991; Kellam et al., 1992) im pol-gen, das für die HIV-1 spezifische Reverse Transkriptase (RT) kodiert, korreliert werden, während in anderen Isolaten verschiedene andere (Muckenthaler et al., 1992; Levantis und Oxford, 1992; Stein et al., 1994), einige der 4 Aminosäure-Austausche und andere Austausche (Gao et al., 1992; Albert et al., 1992; Sheehy und Desselberger, 1993) oder keine Aminosäure-Austausche (Biesert et al., 1991; Schröder et al., 1992) gefunden

37 23 wurden. 2 Aminosäure-Austausche in der HIV-1 RT wurden für eine Resistenz gegen Nukleosid-Analoga verantwortlich gemacht (Lacey and Larder, 1994). Für die zugelassenen RTIs gibt es mittlerweile Tabellen der häufig vorkommenden Mutationen im pol-gen der Reversen Transkriptase (s. Tab. 4). In den letzten Jahren wurden auch Insertions- und Deletionsmutationen im pol-gen des HIV-1 mit einer Aminosäure als Insert oder einer Deletion beim Kodon 69 (Kim, E.Y. et al., 2001), Insertionen von zwei Aminosäuren zwischen den Kodons 69 und 70 (Sugiura et al., 1999) oder zwei Aminosäuren zwischen den Kodons 68 und 69 (Lukashov et al., 2001) bzw. sechs Aminosäuren zwischen den Kodons 69 und 70 (Winters et al., 1998) beschrieben, die mit einer multiplen Resistenz gegen verschiedene antivirale Substanzen in Verbindung gebracht werden. Es wurden zahlreiche zelluläre Faktoren, die eine Chemotherapeutika-Resistenz in malignen und normalen, untransformierten Zellen bewirken können, beschrieben. Mechanismen zellulärer Chemotherapeutika-Resistenzen sind u.a. die Hemmung des Medikamenten-Influx in die Zelle, eine Erhöhung der intrazellulären Detoxifizierung, eine Amplifikation des Gens, das für das Zielprotein kodiert, eine erhöhte DNA-Reparatur, die Aktivierung von Onkogenen oder ein erhöhter Efflux des Chemotherapeutikums aus der Zelle (Hayes, 1990; Sugawara, 1990). Das mdr P170 Resistenzsystem gehört zu einer Superfamilie von Membran-assoziierten P-Glykoproteinen (Juranka et al., 1989; Kurelec et al., 1992). In Chemotherapeutikaresistenten Zellen, die einen erhöhten Medikamenten-Efflux aufweisen, wurde eine vermehrte Expression eines Oberflächenproteins gefunden (Juliano et al., 1976; Endicott et al., 1989; Juranka et al., 1989). Dieses Multidrug-Resistenz-P-Glykoprotein mit einer molekularen Masse von (mdr P170) konnte mit der auftretenden Resistenz korreliert werden (Nielsen et al., 1992). Yusa beschrieb 1990 erstmals gegen Adriamycin (Doxorubicin), einem Therapeutikum zur Behandlung von Kaposi-Sarkomen oder Neoplasmen bei AIDS-Patienten, resistente uninfizierte Zellen, die das mdr P170 erhöht exprimierten und eine Kreuzresistenz gegenüber AZT zeigen (Yusa et al., 1990). Eine erhöhte Expression des mdr nach AZT-Gabe in Tumorzelllinien fand auch Signoretti (Signoretti et al., 1997). Das mdr P170 konnte in 90 % peripherer Blutlymphozyten (PBL) sowohl in gesunden Probanden als auch in HIV-Patienten nachgewiesen werden (Lucia et al., 1995) wurde von Gollapudi und Gupta ein Doppelmechanismus der AZT-Resistenz beschrieben, der auf einer Resistenz des Virus und auf einer Resistenz der Zellen beruht. In HIV-1 IIIB infizierten H9- und U937-Zellen wurde im Vergleich zu uninfizierten Zellen eine erhöhte Expression des Multidrug-Resistenzproteins

38 24 mdr P170 nachgewiesen (Gollapudi und Gupta, 1990). In PBL (peripheral blood lymphocytes) aus AIDS-Patienten mit und ohne AZT-Behandlung wurde jedoch kein signifikanter Unterschied gefunden (Peter et al., 1996). Das mdr-protein wurde auch mit einer Inhibition (Lee, C.G.L. et al., 2000) und einer Resistenz gegen die Infektion mit HIV-1 (Raviv et al., 2000) in Verbindung gebracht, so dass zum einen ein Zusammenhang des HIV mit dem mdr zu bestehen scheint und zum anderen wahrscheinlich weitere zelluläre Veränderungen durch die HIV-Infektion anzunehmen sind. Wang beschrieb erstmals 2003 eine zelluläre Resistenz gegen Doxorubicin in MT-4- Zellen, bei der das Brust-Krebs-Resistenz-Protein (BCRP/ABCG2) erhöht exprimiert wird und eine Kreuzresistenz gegenüber AZT besteht (Wang et al., 2003). Tab. 5: Nukleosidtransporter Äquilibrierende Nukleosidtransporter ENT 1 äquilibrierend, sensitiv gegen die Inhibition mit NBMPR ENT 2 äquilibrierend, insensitiv gegen die Inhibition mit NBMPR Es äquilibrierend, sensitiv gegen die Inhibition mit NBMPR Ei äquilibrierend, insensitiv gegen die Inhibition mit NBMPR Konzentrierende Nukleosidtransporter CNT 1 für Pyrimidine CNT 2 für Purine CNT 3 für Pyrimidine und Purine und andere Substanzen Cit konzentrierend, insensitiv gegen die Inhibition mit NBMPR, für Thymidin permeabel Cif konzentrierend, insensitiv gegen die Inhibition mit NBMPR, für Formycin B permeabel Cib Konzentrierend, insensitiv gegen die Inhibition mit NBMPR, für viele Substanzen permeabel Der normale Transport von Nukleosiden und Nukleosid-Analogen wird entlang der Zellmembranen durch spezifische Proteine vermittelt. Man unterscheidet äquilibrierende und konzentrierende Transporter, die in verschiedenen Isoformen vorliegen. Bei den äquilibrierenden Transportern wird in ENT1 und ENT2 oder die beiden Klassen "es" (sensitiv gegen die Inhibition mit NBMPR [Nitrobenzylthioinosin]) und "ei" (insensitiv gegen die Inhibition mit NBMPR) eingeteilt. Sie erleichtern die Diffusion der Nukleoside durch die Zellmembran. Äquilibrierende Transporter liegen in fast allen Zelltypen vor (Kiss et al., 2000). Die konzentrierenden, Energie- und Na + -abhängigen Transporter sind normalerweise insensitiv gegenüber NBMPR. Sie werden benötigt, um die Agenzien in die Zelle hinein zu

39 25 transportieren (Belt, 1983; Plagemann, 1988 a; Plagemann, 1988 b). Man unterscheidet die drei Klassen cit (konzentrierend, insensitiv gegen NBMPR, für Thymidin permeabel), cif (konzentrierend, insensitiv gegen NBMPR, für Formycin B permeabel) und cib (konzentrierend, insensitiv gegen NBMPR, für viele Substanzen permeabel) oder die Bezeichnungen CNT1 (für Pyrimidine), CNT2 (für Purine) und CNT3 (für Pyrimidine, Purine und andere Substanzen). Die konzentrierenden Transporter werden im Gegensatz dazu in spezialisierten Geweben wie Darm- und Nierenepithel, Leber, Plexus choroideus gefunden (Hamilton et al., 2001). Bisher wurde der Transport für 2',3'-Dideoxynukleoside, wie z.b. AZT, durch nicht-erleichterte Diffusion beschrieben (Zimmermann, 1987). Für AZT wurde jedoch auch eine schwache Affinität zu dem konzentrierenden Transporter CNT1 gefunden (Kort et al., 2000), die von Yao et al. (2001) bestätigt wurde. Außerdem finden die Autoren noch Aktivität mit dem konzentrierenden Transporter CNT3 und dem äquilibrierenden Transporter ENT2 (Yao et al., 2001). Verapamil, ein Ca 2+ Kanal-Blocker (Doscicin, 1970; Pommerenke et al., 1990) und Forskolin, ein Inhibitor des Transporters der 2-Deoxy-D-Glukose und ein Enhancer der ATP- Konzentration (Wadler et al., 1988) wurden als wirksame mdr-inhibitoren beschrieben (Yusa et al., 1989; Morris et al., 1991). Sie konnten in einigen resistenten Zelllinien, die das mdr P170 Protein vermehrt bilden, den Ausstrom der Chemotherapeutika aus der Zelle verhindern. 1.9 Aufgabenstellung Das Nukleosidanaloge 3'-Azido-2',3'-dideoxythymidin (Azidothymidin, AZT, Zidovudin, Retrovir) war das erste zugelassene Arzneimittel zur ursächlichen Behandlung von Patienten mit Erworbenem Immundefektsyndrom. Die hohe Variabilität des HIV reicht aus, um in vitro aus einem molekularen Klon AZT-resistente HIV-Varianten entstehen zu lassen (Meyerhans et al., 1989). Es zeigte sich aber, dass sich die häufig beschriebene Variabilität des HIV auf das Hüllglykoprotein des Virus zu beschränken scheint, während die inneren Bereiche stärker konserviert sind. Die Variabilität des Glykoproteins konnte für den molekularen Klon HIV-2 ben nach Inokulation in Makaken nicht bestätigt werden, so dass man von einer genetischen Stabilität des HIV sprechen kann (Tolle, 1992). Daher war es wahrscheinlicher, dass sich aus einem Virusisolat, das verschiedene HIV-Varianten enthält, AZT-resistente Varianten über Viruspassagen selektionieren lassen. Außerdem zeigte sich, dass sich aus Patientenisolaten bereits vor Beginn einer AZT-Behandlung AZT-resistente HIV-Varianten isolieren lassen (Broadhurst, 1991). Aus einem Isolat des Katzen Immundefizienzvirus FIV (feline immunodeficiency

40 26 virus) war es zu diesem Zeitpunkt gelungen, resistente Varianten in vitro zu generieren (Remington et al., 1991) wurde von Gollapudi und Gupta ein Doppelmechanismus der AZT-Resistenz beschrieben, der auf einer Resistenz des Virus und auf einer Resistenz der Zelle beruht (Gollapudi und Gupta, 1990). In HIV-1 IIIB infizierten H9- und U937-Zellen wurde im Vergleich zu uninfizierten Zellen eine erhöhte Expression des Multidrug-Resistenzproteins mdr P170 nachgewiesen, ein häufig beschriebener zellulärer Resistenzmechanismus in Tumorzellen. Ziel dieser Arbeit war es, ein umfassenderes Verständnis der molekularen und zellulären Prozesse, die eine AZT-Resistenz verursachen, zu erlangen und die AZT-Resistenz in ihrer Komplexität besser zu begreifen, um ihre Entstehung besser verhindern zu können.

41 27 2 MATERIAL UND METHODEN 2.1 Material Chemikalien Tab. 6: Verwendete Chemikalien Substanz Acetonitril Acrylamid Agarose Ammoniumpersulfat Antikörper Antikörper C219 5-Brom-4-chloro-3-inodyl-phosphattoluidensalz Bromphenolblau Coomassie Brillant Blau R α- 32 P Desoxyguanosintriphosphat (3000 Ci/mmol) α- 35 S Desoxyadenosintriphosphat (600 Ci/mmol) Dimethyldichlorosilan N,N-Dimethylformamid DNA-Größenmarker, 1 kb DNA-Größenmarker, Lambda/HindIII DNA-Größenmarker, PHI X174RF/HaeIII Dithiothreitol Ethidiumbromid Foetales Rinderserum Folin-Ciocalteus Phenolreagenz Glutamin Heringssperma-DNA Inkomplettes Freundsches Adjuvans Klenow-Polymerase Komplettes Freundsches Adjuvans Γ-Methacryloxy-Propyltrimethoxysilan 2-Mercaptoethanol Molekulargewichtsmarker für Proteine Rainbow-Marker (14,3-200 kd) Molekulargewichtsmarker für Proteine Sigma-Marker (26,6-180 kd) Nitro-blau-tetrazoliumchlorid N,N-Methylen-bisacrylamid Nonidet P 40 Bezugsquelle Baker, Deventer, Holland Serva, Heidelberg Sigma, München Biorad, München Dianova, Hamburg Isotopen Diagnostik CIS, Dreieich Sigma, München Serva, Heidelberg Serva, Heidelberg Amersham-Buchler, Braunschweig Amersham-Buchler, Braunschweig Sigma, München Serva, Heidelberg BRL (Gibco), Karlsruhe BRL (Gibco), Karlsruhe Biolabs, Beverly, USA Serva, Heidelberg Sigma, München Gibco, Karlsruhe Merck, Darmstadt Gibco, Karlsruhe Boehringer, Mannheim Difco, Detroit, USA Boehringer, Mannheim Difco, Detroit, USA Sigma, München Serva, Heidelberg Amersham-Buchler, Braunschweig Sigma, München Biorad, München Serva, Heidelberg Fluka, Neu-Ulm

42 28 Substanz Nukleotidtriphosphate ortho-phenylendiamin Penicillin G (Na-Salz) Poly-rCdG Proteinase K Restriktionsendonukleasen Rinderserumalbumin RPMI 1640 Rotiszint 11 Taq-Polymerase Tetramethylendiamin Toluol (Rotiszint 11) Triton X-100 Trypanblau Tween 20 Bezugsquelle Boehringer, Mannheim Sigma, München Seromed, Berlin Pharmacia, Freiburg Sigma, München BRL (Gibco), Karlsruhe Boehringer, Mannheim Gibco, Karlsruhe Roth, Karlsruhe Promega, Heidelberg Serva, Heidelberg Roth, Karlsruhe Serva, Heidelberg Sigma, München Sigma, München Alle übrigen Reagenzien wurden von der Firma Merck im jeweils höchsten Reinheitsgrad bezogen Verbrauchsmaterialien Tab. 7: Häufig verwendete Verbrauchsmaterialien Material Bezugsquelle DEAE 81 Filterpapier Whatman, Maidstone, Großbritannien Einmalpipetten (1, 5, 10, 50 ml) Greiner, Nürtingen Filterpapier (3MM) Schleicher & Schuell, Dassel Gewebekulturflaschen Greiner, Nürtingen Mikrotiterplatten Greiner, Nürtingen Mikrotiterplatten Nunc, Wiesbaden NAP-10 Säulen Pharmacia, Freiburg Nitrozellulose (0,45 µm) Schleicher & Schuell, Dassel Röntgenfilme Kodak, Rochester, USA Sterilfilter (0,2 µm; 0,45 µm) Sartorius, Göttingen Vacutainer Becton Dickinson, Heidelberg Verstärkerfolie (Quanta III) Sigma, München

43 Häufig verwendete Lösungen und Puffer Tab. 8: Häufig verwendete Lösungen und Puffer Material Bezugsquelle LB-Medium 1 % Bacto-Trypton, 0,5 % Hefeextrakt, 1 % NaCl (w/v) LB-Agar 1,5 % Agar (w/v) in LB-Medium TE8-Puffer 10 mm Tris-HCl, 1 mm EDTA, ph 8,0 TBE-Puffer 100 mm Tris, 100 mm Borsäure, 2 mm EDTA PBS 120 mm NaCl, 17 mm Na 2 HPO 4, 3 mm KH 2 PO 4, ph 7,2 Ligationspuffer 50 mm Tris-HCl, ph 7,6, 20 mm MgCl 2, 0,05 mg/ml BSA, 10 mm DTT, 0,14 mm ATP Für alle Lösungen wurde doppelt destilliertes Wasser verwendet Zelllinien und Virus Zur Virusvermehrung und zur Selektion von AZT-resistenten HIV-Varianten aus dem molekularen Klon NL43 (Adachi et al., 1986) und dem Isolat IIIB (Popovic et al., 1984) werden die permanenten humanen T-Zelllinien Molt 4 (Minowada et al., 1972), Molt 4-Klon 8 (Kikukawa et al., 1986), H9 (Popovic et al., 1984) und Jurkat (Weiss, A.L. et al., 1984) eingesetzt. Die mit HTLV-I transformierte humane T-Zelllinie MT-4 (Miyoshi et al., 1981) wird zur Bestimmung des HIV-1 induzierten zytopathischen Effektes, der Toxizität oder der anti-hiv Wirksamkeit einer Substanz verwendet Zellkultur Die verwendeten Zellkulturen werden in RPMI 1640 (Roswell Park Memorial Institute) Zellkulturmedium unter Zusatz von 20 % FCS (v/v) kultiviert. Gegen bakterielle Kontaminationen wird dem Medium 50 mg Streptomycinsulfat und 1 x 10 5 I.E. Penicillin pro Liter zugesetzt. Kulturen eines Volumens bis zu 200 ml werden in Kulturflaschen unter 6 % CO 2 bei 37 o C gehalten. Die Zellzahl der Kulturen wird dreimal wöchentlich mit frischem Medium auf 5 x 10 5 bis 1 x 10 6 lebende Zellen pro ml eingestellt. Zur Bestimmung der Anzahl lebender Zellen wird eine Probe der Zellkultur entnommen und mit Trypanblau (0,5 % Trypanblau in PBS (w/v)) angefärbt. Da eine Infektion von HIV-1 IIIB in den Zelllinien Molt 4 und Molt 4 Klon 8 zur Bildung von

44 30 kurzlebigen Riesenzellen führt, müssen den Kulturen regelmäßig uninfizierte Zellen im Verhältnis von 1:2 bis 1:4 zugeführt werden. Zum Einfrieren der kultivierten Zellen werden mindestens 5 x 10 6 Zellen in 1 ml RPMI unter Zusatz von 20 % FCS (v/v) und 10 % DMSO (v/v) aufgenommen und bei -20 o C für 3-4 Stunden eingefroren. Anschließend werden die Zellen 24 Stunden bei -80 o C aufbewahrt und danach in flüssigem Stickstoff gelagert Lymphozytenisolierung und -kultivierung aus Spenderblut 30 ml 1:2 mit RPMI-Medium verdünntes Vollblut wird auf 15 ml Ficoll-Histopaque mit einer Dichte von 1,077 g/cm 3 geschichtet und 20 Minuten bei 800 x g zentrifugiert. Die Erythrozyten sedimentieren und die peripheren mononukleären Blutzellen (PBMC) bilden eine Bande im Ficoll-Gradienten. Die PBMC-Bande wird mit einer Pipette abgenommen und zweimal in RPMI gewaschen. Eine Probe der PBMC wird zur Bestimmung der Zellzahl 1:2 mit 1 % Essigsäure (v/v) verdünnt, um die Erythrozyten zu entfernen. Die PBMC werden in Zellkulturmedium aufgenommen und 72 Stunden mit 1 % Phytohämagglutinin HA15 (w/v) (Wellcome, Burgwedel) stimuliert. Bei längerer Kultivierung werden dem Zellkulturmedium 400 I.E./ml Interleukin 2 zugefügt. Die PBMC enthalten hauptsächlich Lymphozyten, 20 % Monozyten bzw. Makrophagen und wenige natürliche Killerzellen. Die Fraktion der Lymphozyten besteht zu % aus T4-, zu % aus T8-positiven Zellen und zu 5-15 % aus B-Zellen (Fr. Dr. Jurkiewicz, pers. Mitteilung) Escherichia coli (E. coli)-stämme Zur PCR-Klonierung (s ) wird der E. coli-stamm DH1 mit den Eigenschaften F -, enda1, hsdr17 (r k-,m k+ ), supe44, thi-1, "lambda" -, reca1, gyra96 (Hanahan, D., 1983) verwendet.

45 Methoden Virusisolierung humaner Immundefizienzviren aus Zellkulturüberständen Um Inhibitionsversuche der Reversen Transkriptase Aktivität an gereinigtem Virus durchführen zu können, wird HIV-1 aus dem Zellkulturüberstand HIV-infizierter Zellen gewonnen. Es werden die Zellen aus 3 l Kultur durch Zentrifugation für 15 Minuten bei 350 x g und 4 o C pelletiert. Der Zellkulturüberstand wird zur Entfernung der Zelltrümmer 20 Minuten bei x g und 4 o C zentrifugiert. Das Virus wird anschließend durch zweistündige Zentrifugation bei x g und 4 o C aus dem Überstand gewonnen. Das pelletierte Virus wird in 500 µl PBS suspendiert, auf einen %igen Sucrose-Gradienten (22 g bzw. 90 g Saccharose in 100 ml PBS, ph 7,2) aufgetragen und über Nacht mit x g bei 4 o C bei seiner Schwebedichte (1,15 g/cm 3 ) bandiert. Der Gradient wird mit 17 Tropfen pro Fraktion ausgetropft, die einzelnen Fraktionen im Aktivitätstest der Reversen Transkriptase (s.2.2.2) untersucht und die jeweiligen Brechungsindices im Refraktiometer bestimmt. Die Fraktionen mit der höchsten Aktivität zeigen eine Dichte von 1,14 bis 1,15 g/cm 3. Sie werden zusammengefaßt und 1:2 mit Glyzerin versetzt. Diese Virusfraktionen werden bei -20 o C gelagert Nachweis von Reverser Transkriptase Aktivität im Zellkulturüberstand Als Maß für die HIV-1 Produktion wird im Überstand kultivierter Zellen die Reverse Transkriptase Aktivität bestimmt (RT-Test). Der Nachweis erfolgte nach Hoffman et al. (1985) und Jentsch et al. (1987). Hierbei synthetisiert die freie RT in Gegenwart von radioaktiv markierten Desoxynukleotiden einen DNA-Strang an einer vorgegebenen RNA-Matrize (poly rc, oligo dg). Die in den DNA-Strang inkorporierte Radioaktivität kann nach Filtration in einem ß-Counter gemessen werden und verhält sich proportional zur Menge der vorhandenen aktiven RT. Von den zu untersuchenden Kulturen wird 1,5 ml Überstand abgenommen und durch 0,2 µm Filter sterilfiltriert. Das Virus wird durch 30-minütige Zentrifugation bei 4 o C und x g pelletiert, der Überstand abgesaugt und das Pellet in 20 µl TE8-Puffer suspendiert. Die Proben werden mit 30 µl Testcocktail (83 mm Tris-HCl, ph 8,0, 42 mm MgCl 2, 330 mm KCl, 8,4 mm DTT, 0,25 % Triton-X-100 (v/v), 9 µm dgtp, 1,55 µg poly rc : oligo dg, 1 µci α- 32 P- dgtp in 80 mm Tris-HCl, ph 8,0) bei 42 o C für 45 Minuten inkubiert. Durch Zugabe von 20 µl

46 32 der 10 % SDS Stoplösung (w/v) wird die Reaktion abgebrochen, der Ansatz auf DEAE (Diethylaminoethyl) 81 Filterpapier pipettiert und 15 Minuten bei 80 o C getrocknet. Die Filter werden dann 4-5 mal in 5 % NaH 2 PO 4 -Waschlösung (w/v) geschwenkt, mit doppelt destilliertem Wasser nachgewaschen, zum schnelleren Trocknen mit 70 % Ethanol (v/v) gespült und erneut bei 80 o C getrocknet. Unter Zugabe von Szintillationsflüssigkeit (Rotiszint 11, Roth, Karlsruhe) wird die Aktivität der präzipitierten DNA im Flüssigkeitsszintillationszähler (Minaxi Tri-Carb 4000, Canberra-Packard) bestimmt Hemmversuche der Reversen Transkriptase Aktivität durch AZT-Triphosphat An gereinigtem Virus wurden Inhibitionsversuche der Reversen Transkriptase Aktivität mit AZT-Triphosphat durchgeführt. In einem Standard-RT-Test (s.2.2.2) wird Virus zusammen mit verschiedenen AZT-Triphosphat Konzentrationen im Bereich von nm AZT inkubiert. Das Virus wird in einem Endvolumen von 10 µl TE8-Puffer pro Inkubationsansatz aufgenommen, mit 10 µl AZT-Triphosphat-Verdünnungen in den Konzentrationen von 10 nm bis 1000 nm versetzt und 30 µl Testcocktail zugegeben. Alle weiteren Schritte entsprechen dem unter Punkt beschriebenen Versuchsablauf Nachweis der HIV-1 Vermehrung im MT-4 Zelltest Im MT-4 Zelltest (Harada et al., 1986) wird der zytopathische Effekt eines Virus auf MT-4 Zellen bestimmt. MT-4 Zellen werden nach einer Infektion mit HIV innerhalb weniger Tage abgetötet. Eine Substanz oder ein Serum kann in diesem Test auf ihre anti-hiv-1 Wirksamkeit untersucht werden. Pro Loch einer Mikrotiterplatte mit flachem Boden werden 3000 MT-4 Zellen in 50 µl RPMI 1640 Medium (Gibco) mit 20 % FCS (v/v) und 25 mm HEPES-Puffer (2-[4-(2- Hydroxyethyl)-1-piperazinyl]-ethansulfonsäure) bei ph 6,5 ausgesät. Zur Bestimmung der Infektionsdosis eines Virusstocks werden pro Loch 50 µl zellfreier virushaltiger Kulturüberstand in steigenden Verdünnungsstufen zugegeben. Die Virusstocklösung ist in der Endkonzentration im Test jeweils 1:10, 1:31,6, 1:100, 1:316, 1:1000, 1:3160, 1:10000 und 1:31600 verdünnt. Nach 3-tägiger Inkubationszeit bei 37 o C in einer wasserdampfgesättigten Atmosphäre und 6 % CO 2

47 33 wird 100 µl Medium pro Loch zugegeben, um ein logarithmisches Wachstum der Zellen zu erreichen. Am 4. Tag nach Aussaat werden pro Loch 100 nci 3 H-Thymidin (25 Ci/mmol, Amersham, Braunschweig) in 10 µl RPMI-Medium zugegeben. Die Zellen bauen während des Zellwachstums das markierte Thymidin in ihre DNA ein Stunden später werden die Zellen in einem Zellharvester (Dunn, Asbach) auf Filterpapier geerntet. Die Filterpapiere werden mit Wasser und Ethanol gewaschen und anschließend getrocknet. Der 3 H-Thymidineinbau in die zelluläre DNA wird im ß-Szintillationszähler (Canberra Packard, Frankfurt) unter Zusatz eines Szintillators aus 2,5-Diphenyloxazol (PPO), 1,4-Bis-2-(5-phenyloxazolyl)benzol (POPOP) und Toluol (Rotiszint 11, Roth, Karlsruhe) bestimmt. Die gemessenen cpm-werte werden 10er logarithmisch gegen die Virusverdünnung aufgetragen. Aus dieser Virustitrationskurve wird graphisch die Virusverdünnung bestimmt, bei der fast alle MT-4 Zellen abgetötet werden (optimale Infektionsdosis). Dieser Wert entspricht in etwa 100 TCID 50. In diesem Zellsystem ist 1 TCID 50 die Viruskonzentration, bei der der 3 H-Thymidineinbau in die zelluläre DNA um 50 % reduziert ist (TCID 50 : tissue culture infectious dose). Um festzustellen, ob und in welcher Konzentration eine oder mehrere Substanzen das virusbedingte Absterben der MT-4 Zellen verhindern können, werden sie seriell verdünnt und den MT-4 Zellen zugegeben. Gleichzeitig erhalten alle Kulturansätze eine Viruskonzentration von 100 TCID 50. Die gemessenen cpm-werte werden logarithmisch gegen die Substanzverdünnung aufgetragen und die Inhibitionsdosis (ID 50 ) der Substanz bestimmt. Der ID 50 -Wert einer Substanz ist die Substanzkonzentration bei der die Infektion der MT-4 Zellen um 50 % inhibiert wird. Der gleiche Test kann auch mit anderen Kulturzellen wie Molt 4, Molt 4 Klon 8 und Jurkat durchgeführt werden, um deren Verhalten gegenüber toxischen Substanzkonzentrationen zu bestimmen. Die Inkubationsansätze während des Toxizitätstests werden mit den gleichen Zellzahlen und unter den Bedingungen des MT-4 Zelltests, jedoch ohne Viruszugabe durchgeführt Bestimmung von HIV-1 Polypeptiden im Zellkulturüberstand mit dem Antigen-ELISA Zur Bestimmung des Virustiters in Zellkulturüberständen wird ein Antigen-ELISA (Makoschey, 1993) mit einer "Sandwich"-Methode verwendet. Bei dieser Methode wird 100 µl Überstand (Antigen) pro Vertiefung einer Mikrotiterplatte mit hoher Bindungskapazität (Greiner,

48 34 Nürtingen) gegeben und mit 50 µl 1 % Tween 20 in PBS (v/v) zum Aufschluß der Virusproteine versetzt. Die Antigene werden über Nacht bei 37 o C inkubiert. Unspezifische Bindungsstellen werden 30 Minuten in 0,05 % Tween 20 in PBS (v/v) (PBS-Tween) und 10 % FCS (v/v) (FCS- PBS-Tween) abgesättigt. Das Antigen wird mit 1:1000 in FCS-PBS-Tween verdünntem HIV-1 Patientenserum inkubiert. In dieser Zeit wird das Antigen an den Antikörper gebunden. In zwei weiteren Inkubationsschritten wird zunächst Biotin-gekoppeltes anti-humanes IgG (1:1000 in FCS- PBS-Tween), dann biotinylierter Streptavidin-Peroxidase-Komplex (1:1000 in FCS-PBS-Tween) (Guesdon et al., 1979) jeweils 2 Stunden bei 37 o C gebunden. Nach jedem Inkubationsschritt werden die Mikrotiterplatten dreimal mit PBS-Tween gewaschen und danach auf Zellstoff ausgeschlagen. Die Enzymreaktion erfolgt durch Zugabe von 100 µl Substratlösung (5 µl H 2 O 2, 4 mg ortho-phenylendiamin in 10 ml 0,1 M Citrat und 80 mm Na 2 HPO 4, ph 5). Nach 5 Minuten Inkubation bei Raumtemperatur wird die Reaktion mit 1,3 M Schwefelsäure gestoppt. Die optische Dichte der Farbreaktion wird in einem Photometer (Titertek-Multiscan MC, Flow Laboratories) bei 492 nm gemessen. Die Intensität der Farbreaktion gibt Aufschluß über die Menge an Antigen im verwendeten Zellkulturüberstand Nachweis einer HIV-1 Infektion in der Immunfluoreszenzmikroskopie Zur Bestimmung der Virusexpression in HIV-infizierten Zellen wird eine indirekte Immunfluoreszenz durchgeführt. Die zu untersuchenden Zellen werden auf eine Konzentration von 1 x 10 6 Zellen/ml eingestellt und zweimal in PBS gewaschen. Je 5 µl dieser Zellsuspensionen werden als Doppelproben auf einen Objektträger für Immunfluoreszenz (Hölzel, Dorfen) aufgetragen und 15 Minuten bei Raumtemperatur getrocknet. Die Zellen werden Minuten in 50 % Methanol in Azeton (v/v) fixiert und anschließend getrocknet. Das Antigen wird 30 Minuten mit 10 µl 1:1000 in PBS verdünntem HIV-1 Patientenserum inkubiert und die Objektträger 20 Minuten in einem PBS-Bad gewaschen. Der zweite FITC-gekoppelte anti-humane IgG- Antikörper (1:100 in PBS verdünnt) wird 30 Minuten im Dunkeln bei 37 o C gekoppelt und nicht gebundene Antikörper werden 20 Minuten in einem PBS-Bad abgewaschen. Alle Inkubationsschritte werden in einer Wasserdampf-gesättigten Kammer durchgeführt. Die Virusexpression wird in einem Fluoreszenz-Mikroskop (Zeiss, Jena) bestimmt.

49 Durchflusszytometrie zur Bestimmung der mdr P170 Expression Ein Zellpellet von 1 x 10 7 Zellen wird 7 Minuten in 70 % Methanol in H 2 O bei -20 o C fixiert. Die Zellen werden dreimal in PBS und einmal in PBS mit 20 % FCS gewaschen. Je 1 x 10 6 Zellen werden in 200 µl PBS mit 20 % FCS aufgenommen und im Dunkeln auf Eis mit 10 µl mdr P170 negativem, gegen eine Membranfraktion gerichteten oder einem mdr P170 positiven monoklonalen Maus-Antikörper C219 FITC (Isotopen Diagnostik CIS, Dreieich) eine Stunde inkubiert. Die Expression des mdr P170 wird in einem EPICS Profile Durchflusszytometer (Coulter, Krefeld) bestimmt Messung des zytopathischen Effektes von HIV-1 im Synzytientest Uninfizierte Molt 4 Klon 8-Zellen werden in einer Konzentration von 5 x 10 5 Zellen pro ml in RPMI 1640 mit 10 % FCS und 25 mm HEPES, ph 6,5, aufgenommen. Unbehandelte und mit 50 µm AZT-behandelte HIV-infizierte Jurkat-, Molt 4- oder Molt 4 Klon 8-Zellen werden nach zweimaligem Waschen auf die gleiche Zellzahl von 1 x 10 6 Zellen pro Versuchsansatz eingestellt. Die Zellsuspensionen werden als Doppelproben zu je 100 µl in den Verhältnissen 10:0, 9:1, 7:3, 5:5, 3:7 und 1:9 uninfizierte zu infizierte Zellen in Mikrotiterplatten bei 37 o C im CO 2 -Inkubator kultiviert. Nach 24 Stunden wird der zytopathische Effekt anhand der Riesenzellbildung der Molt 4 Klon 8-Zellen mikroskopisch untersucht Proteinbestimmung nach Lowry (1951) Bei dieser Methode entsteht ein Kupfer-Protein-Komplex in alkalischer Lösung. Dieser Komplex reduziert ein Phosphomolybdat-Phosphowolframat-Reagenz (Folin-Ciocalteus-Phenol- Reagenz), wobei eine intensive blaue Färbung in Abhängigkeit von der Proteinkonzentration entsteht. Die verwendeten Lösungen sind nach Hartree (1972) modifiziert. Ein Teil der zu untersuchenden Probe wird 1:10 in PBS verdünnt und in Mengen von 1, 2, 5, 10 und 20 µl in Eppendorfgefäße gegeben. 5 µl einer 10 %igen SDS-Lösung (v/v) wird pro Ansatz dazu pipettiert und mit PBS auf 100 µl aufgefüllt. Ebenso wird mit einer BSA- Standardlösung (1 mg/ml) verfahren. Nach Zugabe von 100 µl Lösung A (10 mm Natriumkaliumtartrat, 1 M Na 2 CO 3 in 0,5 N NaOH) wird die Lösung 8 Minuten in einem

50 36 Eppendorf-Heizblock auf 56 o C erhitzt. Anschließend werden 10 µl Lösung B (0,1 M Natriumkaliumtartrat, 40 mm CuSO 4 in 0,1 N NaOH) dazugegeben, und die Lösung 10 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert. Nach Zugabe von 300 µl Lösung C (7,5 % (v/v) Folin-Ciocalteus- Reagenz) werden die Proben für 10 Minuten auf 56 o C erhitzt. Die Adsorption des abhängig von der Proteinkonzentration gebildeten Farbstoffkomplexes wird in einem Spektralphotometer (Kontron Uvicon 810) bei einer Wellenlänge von 750 nm bestimmt und der Proteingehalt der Proben anhand der Adsorptionen einer BSA-Eichreihe ermittelt SDS-Polyacrylamidgelelektrophorese (PAGE) von Polypeptiden nach Laemmli (1970) Im Sammelgel werden die Proteine in einem Bereich hoher Feldstärke zwischen einer schnell und einer langsam wandernden Ionenfront konzentriert, so daß sie als scharfe Bande ins Trenngel eintreten. Die in Probenpuffer (50 mm Tris-HCl, ph 6,8, 2,2 % (w/v) SDS, 8 M Harnstoff, 0,5 M 2-Mercaptoethanol, 250 µg/ml Bromphenolblau) aufgenommenen Proteingemische werden darin nach dem Übertritt vom Sammel- in das Trenngel nach ihrer Größe getrennt, da sie durch Anlagerung von SDS negativ geladen sind und ein einheitliches Masse-Ladungsverhältnis besitzen. Die negativ geladenen Proteine wandern im elektrischen Feld zur Anode, wobei die Wanderungsstrecke im Gel umgekehrt proportional zum Logarithmus ihrer Molmasse ist. Das Trenngel besteht aus 9-16 % Acrylamid (Acrylamid:N,N'-Methylenbisacrylamid = 37,5:1 (w/w)), 0,1 % SDS (w/v), 0,375 M Tris, ph 8,8, 25 mg Ammoniumpersulfat (AP) und 8 µl N,N,N',N'-Tetramethylethylendiamin (TEMED) pro 12 ml Gelvolumen. Die Polymerisation der Gele wird mit AP und TEMED gestartet. Das Sammelgel (5 % Acrylamid (w/v), 0,1 % SDS (w/v), 0,375 M Tris, ph 6,8, 50 mg AP, 5 µl TEMED für 10 ml Gelvolumen) wird auf das polymerisierte Trenngel gegossen. Die Proteinproben werden in einer Konzentration von 25 µg pro Spur aufgetragen. Als Laufpuffer für die Elektrophorese wird 25 mm Tris, 200 mm Glyzin, 0,1 % SDS (w/v), ph 8,3 verwendet. Die Elektrophorese durch das Sammelgel wird mit 20 ma, die durch das Trenngel mit 40 ma pro Gel durchgeführt. Vorgefärbte Molekulargewichtsstandards von 27 bis 180 kd (Sigma) dienen als Markerproteine.

51 37 Die Proteine werden im Anschluß an die Elektrophorese für den Proteinnachweis im Western Blot auf Nitrozellulose übertragen oder in Coomassie-Lösung (0,25 % (w/v) Coomassie Brillant Blue R 250, 45,2 % Methanol (v/v), 9,2 % Eisessig (v/v)) eine Stunde gefärbt, eine Stunde in einer Lösung aus 45 % Methanol (v/v), 16,6 % (v/v) Essigsäure 60 %ig (v/v) entfärbt und mehrere Stunden in 5 % Methanol (v/v), 8,3 % Essigsäure 60 %ig (v/v) fixiert Western Blot zum Nachweis des mdr P170 Polypeptids Um das nur in geringen Mengen vorliegende zelluläre mdr P170 nachzuweisen, werden Western Blots nach der Methode von Blake (1984), mit den Modifikationen nach Moosmeyer und Herchenröder (pers. Mitteilung) durchgeführt. Zur Identifikation der in der SDS-PAGE aufgetrennten Proteine werden diese in Anlehnung an Towbin et al. (1979) im elektrischen Feld in einer Nassblotkammer (Biotec Fischer, Reiskirchen) auf Nitrozellulosemembranen übertragen. Der Transfer erfolgt über Nacht im Transferpuffer (20 mm NaH 2 PO 4, 20 mm Na 2 HPO 4, 0,2 % SDS (w/v), 20 % Methanol (v/v)) bei 2,5 ma pro cm 2 Gelfläche. An der Nitrozellulose bleiben die Proteine fest haften und können spezifische Antikörper binden, die durch enzymgekoppelte anti-ig-antikörper nach Zugabe von Substrat sichtbar gemacht werden können. Die Nitrozellulosemembranen werden nach dem Proteintransfer 30 Minuten zur Absättigung unspezifischer Proteinbindungsstellen in 5 % Magermilchpulver (w/v) in 20 mm Tris-HCl, 500 mm NaCl, ph 7,5 (TBS) inkubiert und mit TBS gewaschen. Die Nitrozellulosemembranen können bei -20 o C gelagert werden. Zum Nachweis des transferierten mdr P170 Proteins werden die Membranen in 5 % Magermilchpulver (w/v) in 20 mm Tris-HCl, 500 mm NaCl, 0,05 % Tween 20 (v/v), ph 7,5 (TTBS) unter Zusatz des 1:10 bis 1:200 verdünnten monoklonalen Maus-Antikörper C219 2 Stunden bei 37 o C auf einem Taumelschüttler inkubiert. Ungebundene Antikörper werden durch zweimaliges 10-minütiges Waschen in TTBS entfernt. Es folgt eine 1-stündige Inkubation mit dem zweiten, an Alkalische-Phosphatase gekoppelten 1:1000 in TTBS verdünnten anti-maus-igg- Antikörper. Die Membranen werden zweimal mit TTBS, einmal mit TBS und einmal mit Karbonatpuffer (100 mm NaHCO 3, 1 mm MgCl 2, ph 9,8) für jeweils 10 Minuten gewaschen. Zum

52 38 Anfärben der gebundenen, enzym-markierten zweiten Antikörper werden die Membranen in der frisch angesetzten Färbelösung (15 mg 5-Brom-4-chloro-3-inodyl-phosphat-toluidensalz in 1 ml N,N-Dimethylformamid (DMF) und 30 mg Nitro-blau-tetrazoliumchlorid in 1 ml 70 % DMF (v/v) gelöst, werden in 50 ml Karbonatpuffer gegeben, unter leichtem Schwenken inkubiert und die Reaktion bei ausreichender Farbintensität in H 2 O mit 20 mm EDTA gestoppt Polymerase-Ketten-Reaktion (PCR) Das Prinzip der Polymerase-Ketten-Reaktion (PCR) beruht auf der enzymatischen Synthese spezifischer DNA-Sequenzen, die von an den gegenüberliegenden Strängen bindenden Oligonukleotiden ausgeht und deren Länge dadurch begrenzt wird. Eine Serie von Zyklen, die aus Denaturierung des Templates, Anlagerung der Primer an die DNA-Matrize (Annealing) und deren Verlängerung durch eine hitzestabile DNA-Polymerase, die Taq-Polymerase (Chien et al., 1976), bestehen, führt zu einer exponentiellen Vermehrung des gewünschten DNA-Fragmentes (Mullis et al., 1987). Die hohe Sensitivität der PCR macht sie jedoch äußerst anfällig für Kontaminationen mit Fremd-DNA. Um dies zu verhindern, ist die strikte räumliche Trennung der Arbeitsbereiche DNA- Gewinnung, Probenansatz, Amplifikation und Produktanalyse erforderlich Primerauswahl und herstellung Die Primer für HIV-1 NL43 und HIV-1 IIIB werden nach der publizierten Basensequenz (Adachi et al., 1986; Ratner et al., 1989) ausgesucht und ihre Spezifität für einen bestimmten Bereich des Genoms mit dem Genmon-Programm (s ) geprüft. Im zu amplifizierenden Bereich wurden Sequenzen von 22 bzw. 23 Basen ermittelt, die ein ausgeglichenes Basenverhältnis haben. Die Synthese der Primer wurde von Frau Dr. B. Bachmann mit dem DNA-Synthesizer PCR-Mate EP TM (Applied Biosystems, Californien, USA) nach Angaben des Herstellers durchgeführt (Efcavitch, 1988). Die dafür benötigten Reagenzien werden ebenfalls von Applied Biosystems bezogen. Um die Kopplungseffizienz der aktivierten protonierten Deoxyribonukleosid-

53 39 3'-phosphoramidite während der Synthese festzustellen, werden die Fraktionen der abgespaltenen Tritylgruppen aufgefangen, die bei einer guten Abspaltung orange leuchten. Das restliche Acetonitril wird auf den Synthesesäulen mit einer Kapazität von 200 nmol produzierten Primer durch 1-minütiges Zentrifugieren in 10 ml Röhrchen bei 700 x g entfernt. 1 ml 33 %ige Ammoniaklösung (v/v) wird luftblasenfrei mit zwei 1 ml Spritzen zehnmal durch die Säule gedrückt, die Lösung für 10 Minuten auf der Säule belassen und diese Arbeitsschritte fünfmal wiederholt. Die so von der Synthesesäule eluierten Primer werden in Schraubdeckel- Eppendorfgefäße mit Gummidichtung gegeben und 15 Stunden bei 56 o C inkubiert, um die ß-Cyanoethyl-Schutzgruppen am 5'-Ende abzuspalten. Um die Primer vom Ammoniak zu reinigen, werden NAP-10 Säulen (Sephadex G-25, Pharmacia, Freiburg) durch dreimaliges Spülen mit H 2 O äquilibriert, die ammoniakalische Primer-Lösung auf 1 ml mit H 2 O aufgefüllt und auf die NAP-10 Säule aufgetragen. Die Primer werden anschließend mit 1,5 ml H 2 O eluiert. Zur Konzentrationsbestimmung wird die optische Dichte einer Probe (30 µl) der aufgefangenen Lösung im Photometer bei 260 nm gemessen. Die Primer werden, wie alle in der PCR eingesetzten Lösungen, portioniert und bei -20 o C aufbewahrt. Die benutzten Primer sind in Tab. 9 zusammengefasst Berechnung der Annealingtemperatur Die Annealingtemperatur wird für jeden Primer nach der Formel [(A+T)x2]+[(G+C)x4]-5=X (Itakura et al., 1984) berechnet, wobei X der Annealingtemperatur in o C entspricht. Bei Abweichungen der Schmelztemperatur innerhalb eines Primerpaares wird die weniger stringente Temperatur gewählt.

54 40 Tab. 9: Verwendete PCR- und Sequenzierungsprimer * Primer Lage in NL43 [bp] Sequenz (5'-3') im pol-gen G CCTAC ACCTG TCGAC ATAAT TGG G CTTAA TAAGA GAACT CAAG G ATCTA TCAAT ACATG GATGA G GGGGA ACCAA AGCAC TA G CTAAC TGGTA CCATA ACTTC AC * Die angegebenen Primer zeigen mehr als 90 % Homologie zu HIV-1 NL43. G1 und G2 sind PCR- Primer. G11, G12 und G13 sind Sequenzierungsprimer DNA-Extraktion aus Kulturzellen Kulturzellen werden in Lysispuffer mit Proteinase K und SDS (10 mm Tris-HCl, 400 mm NaCl, 2 mm EDTA, 200 mg/l Proteinase K, 6,6 mg/l SDS, ph 8,2) über Nacht bei 37 o C lysiert. Dabei werden 1 x 10 6 Zellen in 3 ml Lysispuffer (Miller et al., 1988) aufgenommen. Die Proteine werden durch Ausschütteln mit gesättigter Kochsalzlösung (3,2 ml/10 ml Lysat) und anschließendem 15-minütigen Abzentrifugieren bei 1300 x g entfernt. Aus dem Überstand wird die DNA durch Zugabe eines gleichen Volumens Isopropanol gefällt, in 70 %igem Ethanol (v/v) kurz gewaschen und in TE-Puffer aufgenommen DNA-Amplifikation In einem Ziel-DNA-freien Arbeitsbereich werden die Reaktionsansätze (Endvolumen 50 µl) mit Ausnahme der DNA pipettiert und mit 100 µl Paraffin als Verdunstungsschutz überschichtet. Der Reaktionsansatz enthält 500 ng genomische bzw. 5 ng Plasmid-DNA, 50 pmole der Primer, 300 µm dntp, 0,1 % Triton X 100 (v/v), 3 mm MgCl 2, PCR-Puffer mit 67 mm Tris-HCl, ph 8,8, 16,6 mm (NH 4 ) 2 SO 4, 0,17 mg/ml BSA und 10 mm ß-Mercaptoethanol und 2,5 U Taq-Polymerase.

55 41 Anschließend wird unter einer Sterilbank die zu untersuchende DNA durch das Paraffin hindurch in die Ansätze gegeben. Die DNA wird mit 35 Zyklen im DNA-Cycler (Bio-med, Obertheres) amplifiziert, wobei mit 95 o C denaturiert wird. Die Anlagerung der Primer erfolgt bei der errechneten Annealingtemperatur, die Kettenverlängerung bei der für die Taq-Polymerase optimalen Arbeitstemperatur von 72 o C. Die Reaktionsgefäße werden während des ersten, auf 5 Minuten verlängerten Denaturierungsschrittes durch Cap-locks (MµLTI-Lid-Locks, Roth, Karlsruhe) gegen ein Aufspringen gesichert. Die Dauer der einzelnen Schritte beträgt bei einer Amplifikatlänge von 1500 bp jeweils 30 Sekunden. Der 72 o C-Schritt dauerte 90 Sekunden und wurde bei jedem Zyklus um eine Sekunde verlängert und im letzten Zyklus auf 6 Minuten ausgedehnt Agarosegelelektrophorese Die elektrophoretische Auftrennung von DNA-Stücken zur Größentrennung von DNA- Fragmenten nach dem Molekulargewicht erfolgt in Agarosegelen (0,5-1 % Agar (w/v) in TBE) in einer horizontalen Elektrophoreseapparatur bei einer Spannung von 5 V/cm mit TBE (0,1 M Tris, 0,1 M Borsäure, 2 mm EDTA) als Laufpuffer (Sambrook et al., 1989). Um die aufgetrennte DNA im UV-Licht (Chroma 43, Vetter, Wiesloch) sichtbar zu machen, wird den Gelen 0,3 µg Ethidiumbromid/l beigefügt. Die Proben werden mit 1/10 Volumen Probenpuffer (50 % Glyzerin (v/v), 0,25 % Bromphenolblau (w/v), 0,25 % Xylen-Cyanol (w/v)) in die Taschen des Gels aufgetragen. Als Molekulargewichtsstandard wird 1 µg 1 kb Leiter ( bp, BRL, Karlsruhe) in Probenpuffer verwendet Elution der DNA aus Agarosegelen Amplifizierte DNA wird mittels des Geneclean TM Kits der Firma Bio 101 nach den Angaben des Herstellers aus den Agarosegelen eluiert. Bei dieser Methode wird die gewünschte DNA-Bande aus dem Gel ausgeschnitten, dieses in Natriumjodidlösung bei 56 o C geschmolzen und die freigesetzte DNA an kleine Glaskugeln gebunden. Nach mehreren Waschschritten mit dem im Kit enthaltenen Puffer, wird die DNA bei

56 42 56 o C mit H 2 O von den Kügelchen eluiert. Ein Aliquot des Eluats wird auf ein 1 %iges Agarosegel (w/v) aufgetragen und die Konzentration anhand bekannter Mengen von Marker-DNA geschätzt. Für die Elution der DNA mit dem Geneclean TM -Kit werden TAE-Gele (40 mm Tris-Acetat, 2 mm EDTA, ph 8,0) anstelle von TBE verwendet Klonierung eines PCR-Amplifikats Die amplifizierte DNA wird in das Plasmid puc18 kloniert. Die Primer G1 und G2 enthalten die Schnittstellen der Restriktionsendonukleasen SalI und KpnI, die in puc18 als einfache Schnittstellen vorhanden sind. 50 pmol puc18 werden in 50 mm Tris-HCl, ph 8,0 mit 0,5 U Alkalischer Phosphatase (Boehringer, Mannheim) 1 Stunde bei 37 o C dephosphoryliert (Sambrook et al., 1989). Die Reaktion wird durch eine Phenol-Chloroform-Extraktion abgebrochen und die DNA mit Ethanol gefällt. Zur Ligation wird das DNA-Fragment in 3-fachem Überschuß zum Plasmid eingesetzt. Die Ligation wird in Ligationspuffer (50 mm Tris-HCl, ph 7,6, 10 mm MgCl 2, 1 mm ATP, 1 mm DTT, 5 % Polyethylenglykol 8000 (w/v)) mit 2 U T4-DNA-Ligase bei 14 o C über Nacht durchgeführt. Kompetente E. coli-zellen (s ) werden direkt mit den Ligationsansätzen transformiert Herstellung transformationskompetenter E. coli Zellen Die Bakterien werden bei 37 o C in LB-Medium ohne Antibiotika bis zu einer OD 600 von 0,6 bis 0,8 vermehrt. Die Inkubationsansätze werden 10 Minuten auf Eis gestellt, 10 Minuten bei 3000 x g und 4 o C zentrifugiert und anschließend in 1/2 Volumen 50 mm CaCl 2 und 10 mm Tris- HCl, ph 8,0 auf Eis suspendiert und 15 Minuten auf Eis belassen. Nach 10 Minuten Zentrifugation bei 4 o C und 3000 x g werden die Bakterien in 1/15 Volumen 50 mm CaCl 2, 10 mm Tris-HCl, ph 8,0 suspendiert. Nach Zugabe von 15 % Glyzerin (v/v) werden die Bakterien sofort portioniert und bei -80 o C gelagert Transformation von E. coli-zellen mit Plasmid DNA 100 µl kompetente E. coli-zellen werden mit ca. 200 ng Plasmid 30 Minuten auf Eis inkubiert, 1 Minute bei 42 o C und anschließend mindestens 2 Minuten auf Eis belassen. Nach

57 43 Zugabe von 1 ml LB-Medium werden die Zellen 1 Stunde bei 37 o C inkubiert. Die Suspension wird mit einem Drigalskispatel auf LB-Amp-Platten (1 % Bacto-Trypton, 0,5 % Hefeextrakt, 1 % NaCl, 1,5 % Agar (w/v) und 1 µg Ampicillin/ml) ausgestrichen, ungefähr 30 Minuten auf den Platten angetrocknet und im Brutschrank bei 37 o C inkubiert. Einzelne Kolonien werden in LB-Amp- Medium bei 37 o C im Schüttler gezogen. Zur Aufbewahrung werden die transformierten Bakterien bei 1700 x g und Raumtemperatur zentrifugiert, in einem Gemisch aus Bacto-Pepton und Glyzerin aufgenommen und bei -80 o C oder in flüssigem Stickstoff gelagert. Das Einfriermedium für Bakterien besteht aus 50 ml 1,5 % Bacto-Pepton (w/v) und 30 ml 87 % Glyzerin (w/v). Die Lösungen werden getrennt autoklaviert und erst vor Gebrauch zusammengeschüttet. Das Gemisch ist ca. 1 Monat haltbar Minipräparation von Plasmiden 5 ml-kulturen transformierter Zellen (s ) werden 10 Minuten bei 1700 x g zentrifugiert. Die Bakterien werden in 500 µl STET-Puffer (8 % Saccharose (w/v), 5 % Triton X- 100 (w/v), 50 mm EDTA, 50 mm Tris-HCl, ph 8,0) resuspendiert und mit 20 µl RNase A-Lösung (10 mg/ml TE8) und 20 µl Lysozymlösung (10 mg/ml STET) versetzt. Die Ansätze werden 40 Sekunden in H 2 O gekocht und 5 Minuten auf Eis inkubiert. Anschließend werden die Proben 30 Minuten bei 4 o C und x g zentrifugiert und die Überstände mit 500 µl Isopropanol präzipitiert. Nach 30 Minuten Zentrifugation bei 4 o C und x g werden die Plasmidpellets in 70 % Ethanol (v/v) gewaschen, im Speed-Vacutainer getrocknet und in 100 µl TE8-Puffer aufgenommen Maxipräparation von Plasmiden 500 ml Bakterienkultur werden bei 3500 x g pelletiert. Die Zellen werden in 10 ml 50 mm Glukose, 25 mm Tris-HCl, ph 8,0, 10 mm EDTA pro 500 ml Bakterienkultur suspendiert und mit 25 mg Lysozym versetzt. Nach 5 bis 15 Minuten Inkubation bei Raumtemperatur werden 20 ml Denaturierungs-Lösung (0,2 M NaOH, 1 % SDS (w/v)) zugegeben und vorsichtig gemischt. Der Ansatz wird 10 Minuten auf Eis inkubiert, danach 15 ml Acetat-Lösung (3 M KAc, 11,5 % Eisessig) zugegeben und kurz kräftig geschüttelt. Nach 10 Minuten Inkubation auf Eis wird

58 44 30 Minuten bei 4 o C und x g zentrifugiert, der Überstand mit 0,6 Volumen Isopropanol extrahiert und 15 Minuten bei Raumtemperatur stehen gelassen. Nach 30 Minuten Zentrifugation bei Raumtemperatur und x g wird das Pellet mit 70 % Ethanol (v/v) bei Raumtemperatur gewaschen und anschließend getrocknet. Das Präzipitat wird in 8 ml TE8 gelöst, mit 8 g CsCl und 20 µl Ethidiumbromidlösung (10 mg/ml) versetzt und 7 bis 14 Stunden bei x g und 20 o C zentrifugiert. Falls zwei Banden nach Zentrifugation sichtbar werden, wird die untere mit einer Spritze abgezogen, da sie das intakte, ungebrochene Plasmid enthält. Das Volumen wird mit TE8 auf 10 ml erhöht und die Lösung mit H 2 O-gesättigtem 1-Butanol im Dunkeln ausgeschüttelt bis die rote bzw. rosa Färbung vollständig verschwunden ist. Es wird jeweils die obere Phase verworfen. Die Plasmid-DNA wird mit 2 Volumen 96 % Ethanol (v/v) bei -20 o C 3 bis 4 Stunden gefällt, das Präzipitat mit 70 % Ethanol (v/v) gewaschen, getrocknet und auf Eis in TE8 gelöst. Die DNA- Konzentration wird bei einer OD 260 bestimmt (1 OD 260 entspricht 50 µg DNA/ml) Sequenzierung Sequenzierung von Plasmiden Die Plasmide wurden nach der Kettenabbruch-Methode (Sanger et al., 1977) mit dem Sequenase 2.0 Sequenzierungskit (United States Biochemicals, Cleveland, USA) sequenziert. Doppelsträngige Plasmid-DNA wird 5 Minuten in 0,25 M NaOH aufgenommen, mit 1/8 Volumen 3 M Natrium-Acetat neutralisiert, mit Ethanol präzipitiert und in TE8 aufgenommen. Die denaturierte DNA wird zur Primerbindung mit 5 pmol Sequenzierungsprimer in Sequenasepuffer (40 mm Tris-HCl, ph 7,5, 20 mm MgCl 2, 50 mm NaCl) in einem Endvolumen von 10 µl 2 Minuten auf 65 o C erhitzt und langsam auf 30 o C abgekühlt. 2 µl Markierungslösung (7,5 µm dgtp, dctp, dttp), 1 µl 0,1 M DTT, 0,5 bis 1 µl α- 35 S-dATP (1000 Ci/mmol, Amersham) und 0,25 µl Sequenase in 2 µl Verdünnungspuffer (10 mm Tris-HCl, ph 7,5, 5 mm DTT, 0,05 % Rinderserumalbumin (BSA) (w/v)) werden zugefügt. Der Ansatz wird 30 Sekunden bei 37 o C inkubiert. Aus diesem Denaturierungsansatz werden je 3,5 µl zu 2,5 µl der entsprechenden Terminationslösung (50 mm NaCl, 80 µm datp, dgtp, dctp, dttp, 8 µm des jeweiligen ddntp) gegeben. Die Reaktion wird nach 5 Minuten bei 37 o C durch Zugabe von je 4 µl Stoplösung (20 mm EDTA, 0,05 % Bromphenolblau (w/v), 0,05 % Xylen-Cyanol (w/v), 95 %

59 45 Formamid (v/v)) abgebrochen. Die Proben werden nach 10 Minuten Denaturierung bei 95 o C und Abkühlen auf Eis auf ein Sequenziergel aufgetragen (s ) Sequenzierung der PCR-Produkte Die PCR-Produkte wurden nach der Kettenabbruch-Methode (Sanger et al., 1977) mit dem T-7 Polymerase Sequenzierungskit (Pharmacia) sequenziert, die von Bachmann et al. (1990) modifiziert wurde. Es werden jeweils 0,25 pmol Template und 20 pmol Primer in die Reaktion eingesetzt. Die Abbruchreaktionen werden in Rundboden-Mikrotiterplatten durchgeführt. Zum Markieren dient α- 35 S-dATP. Zum Auftrennen der Reaktionsprodukte wird das Macrophor Sequencing System (Pharmacia) verwendet. Die Glasplatte wird mit Bindesilane (17,5 µl Γ-Methacryloxy- Propyltrimethoxysilan, 175 µl 10 %ige Essigsäure (v/v), 5 ml Ethanol), die Thermostatierplatte mit Repellsilane (5 % Dimethyldichlorosilane (v/v) in Chloroform) beschichtet. Um den Lauf der kleineren Fragmente zu verlangsamen, werden 0,2-0,6 mm dicke Keilgele verwendet. Die Proben werden in einem 6 %igen Polyacrylamidgel (1 M Tris, 1 M Borsäure, 1 mm EDTA, 8 M Harnstoff, 6 % Acrylamid (Acrylamid:N,N'-Methylenbisacrylamid im Verhältnis 37,5 : 1 (w/w)) und 40 µl TEMED, 80 µg AP pro 100 ml Gelvolumen) bei 2000 V mit Harnstoff zur Denaturierung der Proben aufgetrennt. Als Laufpuffer dient TBE. Nach dem Lauf wird die Glasplatte mit dem Gel von der Isothermalplatte abgenommen und zur Entfernung des Harnstoffs und Fixierung der DNA im Gel 10 Minuten in 10 %iger Essigsäure (v/v) geschwenkt und 10 Minuten mit deionisiertem Wasser gespült. Nach dem Trocknen für etwa 3 Stunden bei 60 o C im Trockenschrank werden die Gele auf einem Röntgenfilm für etwa 4 Tage exponiert Vergleich der gewonnenen HIV-Sequenzen mit einer Datenbank Die bestimmten Sequenzen wurden mit denen der Los Alamos HIV Sequenzdatenbank (Myers et al., 1990) verglichen. Zum Aussuchen von Restriktionsschnittstellen und zur

60 46 Überprüfung der Homologie von Oligonukleotiden zur Sequenz des proviralen Genoms diente das Genmon-Programm der Gesellschaft für Biotechnologische Forschung, Braunschweig Hybridisierung nach Southern Als Southern Blotting wird die Übertragung von DNA-Fragmenten aus Agarosegelen auf Nitrozellulosemembran mit anschließender Hybridisierung bezeichnet (Southern, 1975; Maniatis 1982). Das Agarosegel mit den elektrophoretisch aufgetrennten DNA-Fragmenten wird 1 Stunde bei Raumtemperatur in 0,5 M NaOH mit 1,5 M NaCl denaturiert und anschließend eine Stunde in 1 M Tris-HCl, ph 8,0 und 1,5 M NaCl neutralisiert. Im Anschluss an den Transfer werden die Filter für 2 Stunden bei 80 o C gebacken. Bis zur weiteren Verarbeitung können die Filter trocken aufbewahrt werden. Zum Absättigen freier Bindungsstellen an den Membranen werden diese mindestens 4 Stunden bei 56 o C in Hybridisierungslösung (50 % Formamid (v/v), 6 x SSC, 0,1 % SDS (w/v), 0,1 % Ficoll (w/v), 0,1 % Polyvinylpyrrolidone (w/v), 0,1 % BSA (w/v), 1 mm EDTA, 10 % Dextran-Sulfat (w/v), 0,2 % denaturierte Heringssperma-DNA (w/v)) vorhybridisiert. Zum Hybridisieren wird die durch Aufkochen und schnelles Abkühlen auf Eis denaturierte radioaktive Sonde dem Mix hinzugefügt und 12 Stunden mit der Membran bei 56 o C inkubiert. Anschließend werden die Filter bei Raumtemperatur jeweils 2 mal 10 Minuten mit 6 fach-, 2 fach- und 1 fachkonzentriertem SSC (20 x SSC: 3 M NaCl, 300 mm NaCitrat, ph 7,2) gewaschen. Die in Plastikfolie eingeschweißte feuchte Membran wurde für 4 Tage gegen einen Röntgenfilm mit Verstärkerfolie bei -80 o C exponiert Radioaktive Markierung von DNA-Sonden durch multipriming Das Prinzip des "Multiprime DNA Labelling"-Systems (Amersham-Buchler) ist die zufällige Anlagerung beliebiger Hexanukleotide an die hitzedenaturierte, einzelsträngige DNA. Diese Primer dienen als Startpunkte für die Synthese des komplementären Stranges. Die Strangverlängerung erfolgt in Gegenwart von radioaktiv markierten Desoxyribonukleotiden mit Hilfe des Klenow- Fragmentes der DNA-Polymerase-I aus E. coli. 25 ng der zu markierenden DNA werden in 10 µl H 2 O aufgenommen und durch 5-minütiges Erhitzen auf 95 o C und anschließendes schnelles Abkühlen auf Eis denaturiert. Es werden 5 µl des

61 47 Klenow-Enzym-Puffers, 5 µl der Hexanukleotidmischung, jeweils 4 µl datp, dctp, dttp, α- 32 P- dgtp (1 µci/ml), 2 U DNA-Polymerase-I (Klenow-Fragment) gemischt und der Ansatz mit H 2 O auf 50 µl aufgefüllt und bei Raumtemperatur für 3 Stunden inkubiert. Zur Abtrennung nicht eingebauter Nukleotide werden die Proben 5 Minuten auf 65 o C erhitzt, auf Eis abgekühlt, auf eine in TE8 äquilibrierte Sephadex-G-50 Säule aufgetragen und mit 10 Volumen zu 100 µl TE8 eluiert. Die radioaktive Strahlung der aufgefangenen Fraktionen wird in einem ß-Zähler gemessen und die Fraktionen mit der markierten DNA vereinigt. Als Sonde wurde das HindIII-Fragment des molekularen Klons NL43 mit 4,3 kb aus dem pol-bereich benutzt. Diese entsprechen den Bereichen LTR, gag, pol und env Autoradiographie Die Röntgenfilme werden mit den Southernblots bei -80 o C und mit den Sequenziergelen bei Raumtemperatur in Röntgenfilmkassetten (Intas, Göttingen) exponiert. Die Autoradiographien (X-OMAT AR, Kodak, Rochester, USA) werden in der Dunkelkammer für 5 Minuten in Entwickler (LX24, Kodak) gelegt und anschließend für 5 Minuten unter fließendem Wasser gewaschen. Nach 5-minütigem Fixieren des Films in Fixierer (AL4, Kodak) wird der Film für 10 Minuten in Wasser gewaschen und getrocknet AZT-Akkumulationsversuche mit 3 H-AZT 3000 Zellen pro 100 µl Medium (RPMI 1640 mit 20 % FCS, 1 % Glutamin, 25 mm HEPES, ph 6,5) werden mit 1 µci 3 H-AZT (450 µm AZT) inkubiert. Nach Ablauf der Inkubationszeit werden die Zellen im Zellharvester geerntet (s.2.2.4). Die AZT-Akkumulation der Zellen wird nach Zugabe des Flüssigkeitsszintillators im ß-Zähler gemessen Bestimmung intrazellulärer AZT-Konzentrationen 0,5 bis 2 x 10 7 Zellen werden in einem Endvolumen von 500 µl RPMI 1640-Medium in 10 ml - Plastikröhrchen bei 37 o C in einem Schüttelwasserbad inkubiert. Um Volumenverluste zu vermeiden, sind die Inkubationsansätze während der Inkubationszeiten verschlossen. Bei Farbumschlag des Mediums werden sie mit 50 µl 20 mm NaHCO 3 versetzt. Inkubationsansätze mit

62 48 AZT alleine werden 3 Minuten vor AZT-Zugabe bei 37 o C vorinkubiert. Ansätze mit AZT und Inhibitor werden ebenfalls 3 Minuten vor Inhibitorzugabe bei 37 o C vorinkubiert. 20 Minuten nach Zugabe des Inhibitors erfolgt die AZT-Zugabe. Nach Ablauf unterschiedlicher Inkubationszeiten werden 400 µl der Zellsuspension auf eine Schicht aus Siliconöl (ca. 0,5 cm Füllhöhe, 70 µl Wacker AR 200) pipettiert, 30 Sekunden bei x g zentrifugiert und das Zellpellet in flüssigem Stickstoff eingefroren. Der Überstand (Extrazellularprobe) wird abgenommen und bei infizierten Kulturen mit dem gleichen Volumen Methanol gefällt. Anschließend wird die Ölschicht vollständig abgenommen. Pellet und Überstand können bei -20 o C aufbewahrt werden Zellaufschluss Das Zellpellet wird in 100 µl Sørensenpuffer (13 mm KH 2 PO 4, 60 mm Na 2 HPO 4, ph 7,4) aufgenommen und die Zellen durch dreimaliges Einfrieren in flüssigem Stickstoff und wieder Auftauen aufgeschlossen. Die Suspension wird 2 Minuten bei x g zentrifugiert, 80 µl Überstand abgenommen und die Proteine mit dem gleichen Volumen Methanol gefällt. Nach 2 Minuten Zentrifugation bei x g kann die AZT-Konzentration im Überstand (Intrazellularprobe) mittels HPLC analysiert werden HPLC-Analyse von intrazellulärem AZT Die HPLC-Analytik wurde von Frau Dr. Frijus-Plessen, Abt. für Pharmakologie und Toxikologie des Universitätsklinikums Göttingen, durchgeführt. Die Auftrennung der Proben erfolgt auf einer Phenyl-Hypersil-Säule. Die mobile Phase bestehend aus 17 mm Natriumacetat mit 25 % Methanol (v/v), ph 6,55 wird vor Gebrauch im Ultraschallbad 15 Minuten entgast. Die Eichkurven mit bekannten AZT-Konzentrationen werden im Bereich der zu erwartenden Konzentrationen mit AZT-Medium erstellt. Es werden jeweils 50 µl der Zellaufschlüsse auf die Säule aufgetragen. Die Retentionszeit für AZT beträgt 7 Minuten. Der Gehalt an AZT wird bei 267 nm gemessen. Die Flußgeschwindigkeit beträgt 1 ml/min.

63 49 3 ERGEBNISSE Das Ziel dieser Arbeit war die Etablierung eines Modells zur Erzeugung AZT-resistenter Humaner Immundefizienzviren Typ 1 in der Zellkultur. Dazu wurde HIV-1 auf humanen T-Zelllinien in Gegenwart von AZT kultiviert. Die Untersuchungen wurden zum einen mit dem molekularen Klon pnl43 und zum anderen mit einer Viruspopulation, dem HIV-1-Isolat IIIB, durchgeführt. Ferner wurde untersucht, ob die Kulturzellen für eine AZT-Resistenz verantwortlich sein könnten. 3.1 HIV-Varianten des molekularen Klons pnl43 unter AZT-Behandlung Da die Charakterisierung von Nukleotid- bzw. Aminosäure-Austauschen in einem molekularen Klon einfacher zu bestimmen sein sollte als in einem Virusisolat, das viele verschiedene HIV-Varianten enthält, wurde zunächst versucht, mit dem molekularen Klon pnl43 (Adachi et al., 1986) AZT-resistente HIV-Varianten in vitro herzustellen. Nukleotid-Austausche können leicht mit einem veränderten Verhalten des Virus im MT-4 Zelltest korreliert werden. Eine AZT-Resistenz bedingte Vermehrung von HIV-1 im Zellkulturüberstand kann somit in Zellkultur im MT-4 Zellsystem (Harada et al., 1985) nachgewiesen werden Herstellung der HIV-1 pnl43 transfizierten Jurkat-Zelllinie Jurkat-Zellen (Weiss, A.L. et al., 1984) wurden mit dem infektiösen, molekularen HIV-1 Klon pnl43 (Adachi et al., 1986) mit der DEAE-Dextran Methode (Sambrook et al., 1989) transfiziert (Jurkiewicz, pers. Mitteilung). Der Erfolg der Transfektion wurde 24 Tage danach mit der Reversen Transkriptase Aktivität nachgewiesen. Die Integration des Klons NL43 wurde durch Southernblot gezeigt (Abb. 4). Die genomische DNA wurde durch den Verdau zellulärer DNA mit den Restriktionsenzymen HindIII, KpnI und PstI verdaut und mit einer 4.3 kb HindIII-Sonde des Klons NL43, die dem pol-fragment entspricht, nachgewiesen. Beim Verdau mit HindIII waren die Fragmente von bp für die gag-region, bp für pol und env, bp für env und bp für 3'nef und die 3'LTR und ein Fragment größer als bp zu erwarten. Durch Verdau mit KpnI treten die Fragmente 320 bp und bp, die das pol-gen enthalten und die Banden von bp und größer als bp auf. Nach PstI-Verdau werden theoretisch die Banden bp für p7 und pol, sowie Fragmente von bp, bp (sites in flanking sequences) und ein Fragment größer als bp gefunden. DNA aus nicht infizierten Jurkat-Zellen enthalten diese Fragmente nicht. Mit der 32 P-markierten Sonde aus einem Verdau mit dem Restriktionsenzym HindIII des Klons pnl43 konnte das bp-fragment für pol und env im HindIII-Verdau nachgewiesen werden. Beim Verdau mit KpnI trat das Fragment bp für pol in der Autoradiographie auf (Abb. 4).

64 kb M M M M kb a b c a b c a b c 4, ,3 2, ,2 Abb. 4: Southernblot mit genomischer DNA aus HIV-1 pnl43 transfizierten Jurkat-Zellen nach Verdau mit den Restriktionsenzymen HindIII, KpnI und PstI. Die genomische DNA aus a: nicht infizierten Jurkat-Zellen, b: pnl43 transfizierten Jurkat-Zellen und c: HIV-1 IIIB infizierten Jurkat-Zellen wurde mit 1: HindIII, 2: KpnI und 3: PstI verdaut. Das 4,3 kb Fragment aus einem Verdau mit dem Restriktionsenzym HindIII des Klons pnl43 wurde durch multipriming mit 32 P markiert und als Sonde eingesetzt. M: 1 kb-leiter AZT-Behandlung der NL43-transfizierten und infizierten T-Zelllinien HIV-1 NL43 produzierende Jurkat-Zellen wurden in Gegenwart steigender AZT- Konzentrationen kultiviert, um so resistente HIV-1 Varianten zu selektionieren. Begonnen wurde mit einer AZT-Konzentration von 13 nm AZT, die einer 50 %igen Hemmung des HIV-1 bedingten zytopathischen Effektes entspricht (Hartmann et al., 1988). Nach 4 Monaten Kultivierung wurde die AZT-Konzentration auf 26 nm AZT erhöht. Mit zellfreien Überständen der Transfektionskulturen wurden Molt 4 Klon 8-Zellen (Kikukawa et al., 1986) infiziert. Um die Mutationshäufigkeit des viralen Genoms zu erhöhen, wurden nicht infizierte Molt 4 Klon 8-Zellen jede Woche erneut mit zellfreiem Virus infiziert. Diese Viruspassagen sollten bewirken, dass der virale Replikationszyklus

65 51 mit Hilfe der fehlerhaft arbeitenden viralen Reversen Transkriptase ständig durchlaufen werden muss. Durch den Selektionsdruck sollte die Ausbildung AZT-resistenter HIV-Varianten gefördert werden. Als Kontrolle dienten transfizierte Jurkat-Zellen, die in Zellkulturmedium ohne AZT kultiviert wurden Nachweis von HIV-1 Varianten mit veränderter AZT-Sensitivität in Zellkultur Zunächst wurde mit dem MT-4 Zelltest alle 2-4 Wochen nach AZT-resistenten Varianten des HIV-1 Klons pnl43 gesucht (Harada et al., 1986). Mit der Bestimmung der Viruskonzentration, die zu einem 50 %igen Absterben der MT-4 Zellen führte (TCID 50 - Gewebe infektiöse Einheiten), konnte die Virusproduktion der Kulturen kontrolliert werden. Die Sensitivität des Virus gegenüber dem HIV-Inhibitor AZT wurde in Gegenwart von 100 TCID 50 auf die MT-4 Zellen mit unterschiedlichen AZT-Konzentrationen gemessen. Eine Erhöhung der AZT- Konzentration, die zu einer 50 %igen Inhibition des HIV-1 bedingten zytopathischen Effektes (ED 50 ) führt, sollte Hinweise auf eine Resistenz geben, eine Erniedrigung der AZT-Konzentration auf eine erhöhte Sensitivität der Viren gegenüber AZT. Es zeigte sich, dass die Bestimmung der ED 50 -Werte für AZT durch eine unregelmäßige Virusproduktion in den Zellkulturen, die schlechte Reproduzierbarkeit mit eingefrorenen, virushaltigen Überständen bzw. das nicht konstante Verhalten der MT-4 Zellen im Test erschwert wurden. Wurde im MT-4 Zelltest das Virus 1:4 verdünnt eingesetzt, lag der ED 50 -Wert für AZT bei 150 nm (Abb. 5). Bei geringeren Viruskonzentrationen reduzierten sich die ED 50 -Werte für AZT. Bei einer Virusverdünnung von 1:40 lag der ED 50 -Wert bei 70 nm, bei geringeren Viruskonzentrationen (1:100 bis 1:400) nur noch bei 17 nm. Diese 17 nm AZT entsprechen in etwa dem mit 13 nm in der Literatur angegebenen Wert. Die eingesetzte Virusverdünnung von 1:100 bzw. 1:400 geht aus der Bestimmung der Infektionsdosis hervor und entspricht 100 TCID 50 (Daten nicht gezeigt). Da die ED 50 -Werte von AZT im Testansatz von der Viruskonzentration abhängig sind, musste, um eine Standardisierung des Testsystems zu erreichen, bei jeder Untersuchung die Infektionsdosis der Virusüberstände für die MT-4 Zellen neu bestimmt werden.

66 52 3 Abb. 5: Inhibition der HIV-1 pnl43 Replikation in MT-4 Zellen durch AZT in Abhängigkeit von der Viruskonzentration. AZT wurde auf MT-4 Zellen in Anwesenheit 1:4, 1:40, 1:100 und 1:400 verdünnter HIV-1 pnl43- haltiger Zellkulturüberstände austitriert. Der 3 H-Thymidineinbau [cpm] wurde gegen verschiedene AZT-Konzentrationen [nm] doppelt-logarithmisch aufgetragen. Die Balken kennzeichnen die unterschiedlichen ED 50 -Werte für AZT in Abhängigkeit der verwendeten Viruskonzentration. In den Zellkulturüberständen der Kulturen, die mit AZT kultiviert wurden, war nur sehr wenig oder häufig kein Virus im MT-4 Zelltest nachweisbar. Zum Nachweis geringer Virusmengen wurden deshalb zusätzlich zellfreie Kulturüberstände pnl43-transfizierter Jurkat-Zellen auf Molt 4 Klon 8-Zellen passagiert und im MT-4 Zelltest auf ihre Virusproduktion und ihr Verhalten gegenüber AZT untersucht (Tab. 10). Die so neuinfizierten Molt 4 Klon 8-Zellen bilden einen Tag nach der Infektion Riesenzellen, in den AZT-behandelten Kulturen zwei Tage nach Infektion. Die eintretende Synzytienbildung in den Molt 4 Klon 8-Zellkulturen, die mit zellfreien Überständen 13 nm AZTbehandelter pnl43 transfizierter Jurkat-Zellen infiziert wurden, zeigten, dass trotz AZT-Behandlung Virus repliziert wurde. Die Virusreplikation lag jedoch häufig unterhalb der Nachweisgrenze. Innerhalb von eineinhalb Jahren konnte mit dem molekularen Klon pnl43 keine Resistenz gegen AZT in Zellkultur hergestellt werden (Tab. 11).

67 53 Tab. 10: Im MT-4 Zelltest ermittelte Infektions- und Inhibitionsdosen der auf Molt 4 Klon 8- Zellen passagierten HIV-1 Viren AZT-Behandlung Passage 1 ohne 2 mit 3 Infektionsdosis 4 ID 50 (nm) 5 Infektionsdosis ID 50 (nm) 9 1:40 2 1: :4 18 1: : : : u.n. 6 u.n. 17 1:4 22 u.n. u.n. 19 1:40 10 u.n. u.n. 22 1:4 24 u.n. u.n. 23 1:4 2 1: :4 65 1:4 18 1: Anzahl der zellfreien Viruspassagen auf Molt 4 Klon 8-Zellen. Jede Passage dauert 7 Tage. 2: Kontrollkulturen, die ohne AZT im Zellkulturmedium gezogen werden. 3: Testkulturen, die mit 13 nm AZT im Zellkulturüberstand kultiviert werden. 4: Eingesetzte Virusverdünnung, die ca. 100 TCID 50 entspricht. Sie gibt die Höhe der Virusproduktion in den infizierten Zellkulturen an. 5: Inhibitionsdosis in nm AZT im MT-4 Test. 6: Die Werte liegen unterhalb der Nachweisgrenze. Die Tabelle 10 zeigt zum einen, dass die Virusproduktion sowohl in den Kulturen mit 13 nm AZT-Behandlung als auch ohne AZT-Behandlung sehr niedrig ist. Eine Verdünnung von 1:4 bei der Infektionsdosis liegt an der Nachweisgrenze, wodurch die Bestimmung der ID 50 -Werte erschwert und ungenau wird. Das zeigt sich z.b. in der 27. Passage beim ID 50 -Wert für nicht AZT-behandelte Kulturen von 65 nm, der ca. 4- bis 5-fach oberhalb des in der Literatur beschriebenen Wertes liegt. Bei einer Dauerkultur unter 13 nm AZT wurde aber einmal eine 100-fach erhöhte Sensitivität gegen AZT im MT-4 Zelltest festgestellt (Tab. 11). In den mit AZT-behandelten Jurkat- Kulturen konnte 209 Tage nach Transfektion im MT-4 Zelltest mit HIV pnl43 Varianten eine

68 54 10-fach erhöhte AZT-Sensitivität nachgewiesen werden. Die Inhibitionsdosen sanken von anfänglich 90 nm auf 2 nm 349 Tage nach Transfektion und auf 0,02 nm AZT 356 Tage nach Transfektion bei hohen Infektionsdosen, d.h. stabiler Virusproduktion. Tab. 11: Im MT-4 Zelltest ermittelte Infektions- und Inhibitionsdosen der mit dem HIV-1 Klon pnl43 transfizierten Jurkat-Kulturen Tage 1 AZT-Behandlung p.t. ohne 2 mit 3 Infektionsdosis 4 ID 50 (nm) 5 Infektionsdosis ID 50 (nm) 209 1: : : : : : : : : : :400 0,2 1:100 0, :40 11 n.d. 6 n.d. 1: Tage nach Transfektion des Klons NL4-3 in Jurkat-Zellen. 2: Kontrollkulturen, die ohne AZT im Zellkulturmedium gezogen werden. 3: Testkulturen, die mit 13 nm AZT im Zellkulturüberstand kultiviert werden. 4: Eingesetzte Virusverdünnung, die ca. 100 TCID 50 entspricht. Sie gibt die Höhe der Virusproduktion in den infizierten Zellkulturen an. 5: Inhibitionsdosis in nm AZT im MT-4 Test. 6: Die Werte liegen unterhalb der Nachweisgrenze. In den AZT-behandelten Molt 4 Klon 8-Zellen zeigt sich zunächst eine ca. 10-fach erhöhte Resistenz gegenüber AZT in der 9., 10. und 14. Passage. Die Viren lassen sich jedoch nicht stabil auf die folgenden Passagen übertragen. Die Virusproduktion dieser Kulturen sinkt während der weiteren Kultivierungsdauer unter die Nachweisgrenze.

69 Molekularbiologische Untersuchungen am HIV-1 Genom Da ein Nachweis einer AZT-Resistenz in den AZT-behandelten HIV-1 pnl43 transfizierten Jurkatkulturen im MT-4 Zelltest nicht möglich war, und um in schlecht Virus-produzierenden Zellen zeigen zu können, dass trotz hoher AZT-Konzentrationen im Kulturmedium NL43 noch repliziert wird, also intrazellulär vorhanden ist, wurde DNA aus den AZT kultivierten HIV-1 pnl43 transfizierten Jurkat-Zellen, den infizierten Molt 4 Klon 8-Zellen, ihren jeweiligen nicht-infizierten Zellkulturkontrollen und aus uninfizierten Jurkat- bzw. Molt 4 Klon 8-Zellen isoliert (Abb. 9). Die darin enthaltene Virus-DNA wurde im Bereich der Polymerase-Funktion ( bp) (Ratner et al., 1985; Myers et al., 1990) mit Hilfe der Polymerase-Kettenreaktion (PCR) amplifiziert (Abb. 6; Abb. 7) Abb. 6: PCR mit pnl43 aus AZT-selektionierten Jurkat-Zellkulturen in Abhängigkeit von der Zeit nach Transfektion. DNA wurde monatlich isoliert und eine PCR der AZT selektionierten (4, 6, 8, 10, 15, 17, 19, 21) und der Kontrollkultur ohne AZT (2, 3, 5, 7, 9, 13, 14, 16, 18, 20) durchgeführt. Die Amplifikationsprodukte wurden in einem 2 %igen Agarosegel aufgetrennt. Als PCR-Kontrollen dienten uninfizierte Jurkat-DNA zweier verschiedener Isolierungsdaten (1, 12) und eine Kontrolle ohne DNA (11). Als Marker wurde 1 kb-marker eingesetzt.

70 θx174 bp Abb. 7: PCR mit HIV-1 NL43 infizierten AZT-behandelten Molt 4 Klon 8-Zellkulturen. 1: Molt 4 Klon 8 - uninfiziert; 2: Molt 4 Klon 8-1. Passage; 3: Molt 4 Klon 8-1. Passage +AZT; 4: Molt 4 Klon 8 - HIV-1 IIIB ; 5: Kontrolle - HIV-1 Han ; 6: Wasserprobe; M: φx174. Die PCR-Primer wurden so ausgewählt, dass sie Restriktionsschnittstellen für die Enzyme KpnI bzw. SalI enthalten (Abb. 8). Diese Schnittstellen ermöglichen eine direkte Klonierung in puc18, da die Klonierungsstelle (multiple cloning site) in puc18 ebenfalls Schnittstellen für diese beiden Enzyme enthält. Nach Restriktionsverdau und Dephosphorylierung mit Alkalischer Phosphatase des Vektors puc18 und Restriktionsverdau des amplifizierten pol-fragmentes (Insert) wurden sie mit Hilfe des Enzyms Ligase miteinander verknüpft. In diesem System wurde eine Doppelstrangsequenzierung durchgeführt (Sanger et al., 1977) (Abb. 8).

71 57 Abb. 8: Klonierung des pol-fragments aus genomischer DNA. Das 1350 bp-fragment wurde durch PCR mit einem 23-mer Primer (G1: bp in NL43), der eine SalI-Schnittstelle ( eine KpnI-Schnittstelle ( ) enthält und einem 22-mer Primer (G2: bp), der ) enthält, amplifiziert. Das auf einem 2 %igen Agarosegel aufgetrennte und anschließend eluierte Amplifikationsprodukt wurde in die SalI- und KpnI- Schnittstellen der multiple cloning site von puc18 legiert. puc18 enthält ein Gen für eine Ampicillin-Resistenz (Amp r ), O ist der Origin des Plasmids. Ein pol-fragment aus der 1. Viruspassage unter Selektionsdruck mit AZT wurde kloniert und direkt aus einer DNA-Minipräparation (Boiling-Präparation) vollständig sequenziert. Im Vergleich zum ursprünglichen Klon pnl43 traten in der DNA aus AZT-behandelten infizierten Molt 4 Klon 8- Zellen 24 Nukleotid-Austausche auf. Auffällig sind der selten auftretende Austausch eines Cysteins gegen Serin in Position bp, der durch zwei Nukleotid-Austausche bedingt wird und der eines Serins gegen Glutaminsäure in Position 3284 bp (Tab. 12).

72 58 Tab. 12: Basen- und Aminosäure-Austausche im Bereich des pol-gens - 1. Viruspassage. Nukleotid-Austausch Kodon-Position in NL43 Aminosäure-Austausch [bp] AAA AGA 2581 Lys Arg GTA ATA 2772 Val Ile CAG AAG 2853 Gln Lys GGC GGT 2885 Gly Gly GAC GAA 2918 Asp Glu CCA TCA 3018 Pro Ser CAG CAA 3032 Gln Gln TGT AGC 3035 Cys Ser ATC TTC 3048 Ile Phe AGG AGA 3182 Arg Arg ACA ACC 3197 Thr Thr AAA AAG 3218 Lys Lys GTG GAG 3283 Val Glu AAG AAA 3296 Lys Lys AAA AAG 3326 Lys Lys TTG TTA 3341 Leu Leu AAA AGA 3391 Lys Arg GAG GAA 3573 Glu Glu GGG GGA 3548 Gly Gly CCG CCA 3588 Pro Pro AAA AAG 3608 Lys Lys AAG AGG 3622 Lys Arg ACT ACG 3635 Thr Thr GTG GTA 3644 Val Val Verglichen wurde eine DNA-Präparation aus der 1. Viruspassage von pnl43 transfizierten Jurkat- Zellen auf Molt 4 Klon 8-Zellen mit dem Klon pnl43. Um auftretende Basen-Austausche, die durch die angewendeten Methoden entstehen könnten, ausschließen zu können, musste geprüft werden, ob die Transformation in Bakterien ebenfalls Basen-Austausche bewirken kann. Bei einer Sequenzanalyse aus PCR-Fragmenten muss beachtet werden, dass Zellkulturen stets Viruspopulationen enthalten und es somit mehr als eine Virusvariante in der Zellkultur gibt. Dieses ist auch dann der Fall, wenn die Zellen anfänglich mit einem Virusklon transfiziert wurden. Das macht es erforderlich mehrere Klone einer Amplifikation zu

73 59 sequenzieren und diese miteinander zu vergleichen. Ferner ist es notwendig, mehr als eine DNA- Amplifikation pro Zellkultur und DNA-Präparation durchzuführen. Die DNA der Jurkat-Zelllinie, die im MT-4 Zelltest 100 fach erhöhte Sensitivität gegenüber AZT zeigt, wurde untersucht. Dieses Phänomen der erhöhten Empfindlichkeit trat nur einmal auf. Sie wurde mit Hilfe der PCR amplifiziert und in 5 verschiedenen Ligationsansätzen in kompetente E. coli-zellen transformiert. Aus diesen transformierten E.coli-Zellen wurden bei zwei Ligationen je ein Klon, bei zwei weiteren Ligationen je zwei Klone und bei der fünften Ligation 6 Klone im Bereich der Polymerase-Funktion von bp im pol-gen sequenziert. In dieser Sequenz von ca Basen wurden in den 12 untersuchten Klonen 38 Nukleotid-Austausche gefunden (Tab. 13). Auch hier wurde keiner der nach Larder et al. (1989 c) für eine AZT-Resistenz verantwortlichen 4 Aminosäure-Austausche gefunden. Die meisten der gefundenen Austausche sind G A Austausche, ein typischer Fehler der Reversen Transkriptase (Goodenow et al., 1989). Die Nukleotid-Austausche in den Positionen 2513, 2594, 2618, 2635, 2674, 2707, 2963, 2989, 3042, 3081, 3155, 3172, 3177, 3231, 3240, 3241, 3266, 3292 und 3609 bp treten nur in jeweils einem der 12 untersuchten Klone auf. Die Austausche in den Positionen 2514, 2553, 2653, 2656, 2665, 2748, 2773 und 3183 wurden in 2 der untersuchten Klone beobachtet. Lediglich der Austausch in Position 2673 tritt 3-mal auf. Das heißt, dass die Ergebnisse der Tab. 12 keine reproduzierbaren Resultate sind. Sie geben eine Variante aus der Viruspopulation wieder, die nicht unbedingt der Hauptvariante entspricht. Tab. 13 zeigt 12 verschiedene Klone mit unterschiedlichen Nukleotid-Austauschen, die meistens nicht in den jeweils anderen 11 Klonen auftreten. Tab. 13: Basen- und Aminosäure-Austausche im Bereich des pol-gens - sensitive Viren.

74 60 Aus- Tausch Position in pnl43 bp Arg Lys 2513 AGA AAA Arg Arg 2514 AGA AGG AGA AGG Pro Pro 2553 CCC CCT CCC CCT Gly Glu 2594 GGA GAA Gln Arg 2618 CAA CGA Glu Lys 2635 GAA AAA Val Ile 2653 GTA ATA GTA ATA Glu Lys 2656 GAA AAA GAA AAA Thr Ala 2665 ACA GCA ACA GCA Met Ile 2673 ATG ATA ATG ATA ATG ATA Glu Lys 2674 GAA AAA Glu Lys 2707 GAA AAA Lys Lys 2748 AAA AAG AAA AAG Val Ile 2773 GTA ATA GTA ATA Glu Gly 2963 GAG GGG Asn Asp 2989 AAT GAT Met Ile 3042 ATG ATA Asp Asp 3081 GAC GAT Ile Thr 3155 ATA ACA His Asn 3172 CAT AAT Leu Leu 3177 CTG CTA Arg Arg 3183 AGG AGA AGG AGA Phe Leu 3231 TTC TTA Met Ile 3240 ATG ATA Gly Ser 3241 GGT AGT Gln Gln 3266 CAG CAA Glu Lys 3292 GAA AAA Lys Arg 3609 AAA AGA Klone

75 61 Verglichen wurden 12 verschiedene Klone aus einer genomischen DNA-Präparation der NL43 transfizierten Jurkat-Zellen mit erhöhter Sensitivität gegenüber AZT. 3.2 Herstellung und Nachweis von HIV-Varianten des HIV-1 Isolats IIIB Mit dem molekularen HIV-1 Klon pnl43 (Adachi et al., 1986) konnte innerhalb von 1 ½ Jahren keine Resistenz gegen AZT in Zellkultur hergestellt werden. Broadhurst et al. (1991) beschrieben das Vorkommen AZT-resistenter HIV-Varianten in Patienten, die nicht mit AZT behandelt worden waren. Eine Resistenzbildung gegen AZT scheint somit hauptsächlich auf einem Selektionseffekt bereits existierender HIV-1 Varianten zu beruhen. Für die Untersuchung der AZT- Resistenzentstehung in vitro wurde deshalb parallel zu den Untersuchungen mit dem HIV-1 Klon pnl43 das Isolat HIV-1 IIIB (Popovic et al., 1984) gewählt, das aus einer Viruspopulation mit den drei HIV-1 Hauptvarianten BH5, BH10 und HXB2 besteht (Ratner et al., 1985) Selektion AZT-resistenter HIV-Varianten in vitro Entsprechend der Publikation von Remington et al. (1991), in der das Entstehen einer AZT- Resistenz in vitro an dem HIV-1 verwandten Immundefizienzvirus der Katze (FIV - feline immunodeficiency virus) beschrieben wurde, erfolgte die Selektion AZT-resistenter HIV-1 Isolate mit hohen AZT-Konzentrationen von 5, 10 und 50 µm AZT. HIV-1 IIIB infizierte Zellkulturen wurden mit AZT-Konzentrationen von 50 µm AZT behandelt (1. Viruspassage). Die höchste eingesetzte AZT-Konzentration von 50 µm ist für die verwendeten HIV-1 infizierten und uninfizierten Zellkulturen Jurkat, Molt 4 und Molt 4 Klon 8 noch nicht toxisch (Abb. 9). Erst ab einer AZT-Konzentration von 2000 µm AZT sterben die Jurkat-, Molt 4- und Molt 4 Klon 8-Zellen ab, unabhängig davon ob sie HIV-1 infiziert sind oder nicht. Dieses Verhalten gegenüber AZT ändert sich auch dann nicht, wenn die Zellen zuvor an eine AZT- Konzentration von 50 µm AZT angepaßt wurden. Abbildung 10 zeigt die Toxizität von AZT auf AZT-vorbehandelte infizierte Jurkat-Zellen.

76 62 3 Abb. 9: Toxizität von AZT auf uninfizierte und HIV-1 IIIB infizierte T-Zelllinien. AZT wurde auf uninfizierte und HIV-1 IIIB infizierte Jurkat-Zellen, Molt 4-Zellen und Molt 4 Klon 8- Zellen titriert. Der 3 H-Thymidineinbau [cpm] wurde gegen die AZT-Konzentrationen [µm] doppelt logarithmisch aufgetragen.

77 63 3 Abb. 10: Toxizität von AZT auf HIV-1 IIIB infizierte und mit 50 µm AZT-selektionierte HIV-1 IIIB infizierte Jurkat-Zellen. AZT wurde auf HIV-1 IIIB infizierten und auf HIV-1 IIIB infizierten mit 50 µm AZT selektionierten Jurkat-Zellen titriert. Der 3 H-Thymidineinbau [cpm] wurde gegen verschiedene AZT- Konzentrationen [µm] doppelt logarithmisch aufgetragen Erstnachweis von zellfreiem Virus in den AZT-resistenten Kulturen mit PCR In den Zellkulturüberständen von uninfizierten und HIV-1 IIIB infizierten Jurkat-, Molt 4- und Molt 4 Klon 8-Zellen, die mit 5, 10 und 50 µm AZT kultiviert wurden, konnte mit Hilfe des MT-4 Zelltestes und dem Aktivitätstest der Reversen Transkriptase kein zellfreies Virus nachgewiesen werden. Ein Virusnachweis im MT-4 Zelltest wird durch die im Vergleich zu Jurkat-, Molt 4- und Molt 4 Klon 8-Zellen höhere Empfindlichkeit der MT-4 Zellen gegen AZT erschwert. Bereits 50 µm AZT ist für die MT-4 Zellen toxisch (Abb. 11).

78 64 3 Abb. 11: Toxizität von AZT auf MT-4 Zellen. AZT wurde auf MT-4 Zellen titriert. Der 3 H-Thymidineinbau [cpm] wurde gegen verschiedene AZT- Konzentrationen [µm] doppelt logarithmisch aufgetragen. Um Virus, das mit den bisher verwendeten Methoden nicht nachweisbar war, zu bestimmen, wurden Neuinfektionen mit den zellfreien Kulturüberstanden aus den HIV-1 IIIB infizierten Zellen durchgeführt, die 5 Wochen mit AZT behandelt wurden. AZT-vorbehandelte Jurkat-, Molt 4- und Molt 4 Klon 8-Kulturzellen wurden mit zellfreiem Kulturüberstand infiziert. 1 Stunde nach Infektion wurde AZT-haltiges Medium in den entsprechenden Konzentrationen zugegeben, so dass eine optimale Hemmung einer Neuinfektion nichtinfizierter Zellen gewährleistet wurde. 3 Wochen nach dieser Neuinfektion (2. Viruspassage) wurde die zelluläre DNA isoliert und das virale pol-gen

79 65 mit einer PCR nachgewiesen. Für die PCR wurde das Primerpaar G1 und G2 (Tab. 9 - s ) verwendet (Abb. 12). In allen neuinfizierten Kulturen konnte unter fortgesetzter AZT-Behandlung das 1500 bp-fragment des pol-gens von HIV-1 IIIB nachgewiesen werden, während die Kontrollen der uninfizierten Zelllinien negativ waren. Mit diesem Ergebnis konnte gezeigt werden, dass die Virusreplikation HIV-1 IIIB infizierter Zellen trotz hoher AZT-Konzentrationen von 5, 10 und 50 µm AZT, nicht unterbunden werden konnte bp Abb. 12: PCR mit HIV-1 IIIB aus AZT selektionierten Zellkulturen. 5 Wochen nach Selektion mit AZT wurden mit zellfreien Kulturüberständen Neuinfektionen durchgeführt. Die DNA wurde 3 Wochen nach Neuinfektion aus den Kulturen isoliert. M: 1 kb Marker; 1: Jurkat uninfiziert; 2: Jurkat HIV-1 IIIB ; 3: Jurkat HIV-1 IIIB + 5 µm AZT; 4: Jurkat HIV-1 IIIB + 10 µm AZT; 5: Jurkat HIV-1 IIIB + 50 µm AZT; 6: Molt 4 uninfiziert; 7: Molt 4 HIV-1 IIIB ; 8: Molt 4 HIV-1 IIIB + 5 µm AZT; 9: Molt 4 HIV-1 IIIB + 10 µm AZT; 10: Molt 4 HIV-1 IIIB + 50 µm AZT; 11: Molt 4 Klon 8 uninfiziert; 12: Molt 4 Klon 8 HIV-1 IIIB ; 13: Molt 4 Klon 8 HIV-1 IIIB + 5 µm AZT; 14: Molt 4 Klon 8 HIV-1 IIIB + 10 µm AZT; 15: Molt 4 Klon 8 HIV-1 IIIB + 50 µm AZT; 16: HIV-1 IIIB negative DNA; 17: Wasserprobe. Im folgenden wurden nur noch die mit der höchsten AZT-Konzentration von 50 µm behandelten HIV-1 IIIB infizierten Zellen untersucht, da freies Virus indirekt über die Neuinfektionen und anschließende PCR nachweisbar war. Neben dem Nachweis des Provirus durch die PCR wurde die Virusexpression der AZTbehandelten Kulturen zusätzlich mit Hilfe der indirekten Immunfluoreszenz (Tab. 14) und des Synzytientests (Abb. 13) überprüft. In der Immunfluoreszenz ließen sich sogar in den 50 µm AZTbehandelten HIV-1 IIIB infizierten Zellen Virusantigene in allen 3 Viruspassagen nachweisen (Tab. 14).

80 66 Die Fluoreszenz war hier aber deutlich geringer als in den infizierten, aber nicht AZT-behandelten Jurkat-Zellen. Auch im Synzytientest, in dem Molt 4-Zellen mit 50 µm AZT-behandelten HIV-1 IIIB infizierten Jurkat-Zellen kokultiviert wurden, ließ sich in der Kokultur mit den AZT-behandelten HIV-1 IIIB infizierten Jurkat-Zellen der 3. Viruspassage, die 1 Monat nach Anlage der 2. Viruspassage hergestellt wurden, eine Zunahme der Riesenzellbildung im Vergleich zu den Kokulturen der frühen Passagen und der nicht infizierten Kontrollzellen feststellen (Abb. 13). Tab. 14: Nachweis von HIV-1 IIIB Antigenen auf nicht AZT-behandelte und 50 µm AZTbehandelte Jurkat-Zellen in der Immunfluoreszenz Infektion Viruspassage AZT-Konzentration Fluoreszenz [µm] uninfiziert keine 50 / HIV-1 IIIB keine 0 ++ HIV-1 IIIB HIV-1 IIIB /- HIV-1 IIIB /- /: fehlende, +/-: schwache, +: mittelstarke und ++: starke Fluoreszenz

81 67 Abb. 13: Virusnachweis im Synzytientest. Molt 4-Zellen wurden in verschiedenen Konzentrationen mit HIV-1 IIIB infizierten Jurkat-Zellen mit und ohne AZT-Behandlung 19 Stunden kultiviert. Die Kulturen enthielten im Verhältnis 3:7 uninfizierte, nicht AZT-behandelte Molt 4-Zellen und HIV-1 IIIB infizierte AZT- oder nicht AZTbehandelte Jurkat-Zellen. 1: uninfizierte Jurkat-Zellen, 2: HIV-1 IIIB infizierte Jurkat-Zellen, 3: HIV-1 IIIB infizierte Jurkat-Zellen der 1. Viruspassage unter 50 µm AZT, 4: HIV-1 IIIB infizierte Jurkat-Zellen der 2. Viruspassage unter 50 µm AZT, 5: HIV-1 IIIB infizierte Jurkat-Zellen der 3. Viruspassage unter 50 µm AZT.

82 Nachweis und Quantifizierung viraler Antigene in den Zellkulturüberständen AZT-behandelter Kulturen Da der Synzytien- und der Immunfluoreszenztest in ihrer Bewertung subjektiv sind und deshalb keine konkrete Aussage über aus der Zelle ausgeschleuste zellfreie Viren zulassen, wurde zum Nachweis und zur Quantifizierung des Virus im Kulturüberstand ein sensitiver ELISA eingesetzt (Makoschey, 1993). Zunächst mußte zum Nachweis von HIV-1 IIIB ein geeignetes HIV-1 IIIB spezifisches Patientenserum gefunden werden. Nicht alle HIV-1 Patientenseren sind für den HIV-1 Nachweis im ELISA mit einem speziellen HIV-1 Isolat gleich gut geeignet. Von drei untersuchten HIV-1 Patientenseren war nur eins in einem Titer von 1:1000 in der Lage im ELISA das Isolat HIV-1 IIIB aus Zellkulturüberstand zu erkennen. Um den Nachweis auch sehr geringer Virustiter zu gewährleisten, wurde das ELISA- Testsystem in Übereinstimmung mit den Arbeiten von Frau Dr. Makoschey für HIV-2 und SIV agm, für HIV-1 optimiert. Hierzu wurden die optimalen Inkubationszeiten und -temperaturen für das HIV-1 Antigen, das Patientenserum, das biotinylierte αigg, den biotinylierten Streptavidin- Peroxidase-Komplex und die Substratreaktion untersucht. Es konnte gezeigt werden, dass die optimalen Bedingungen für HIV-1 die gleichen wie für HIV-2 und SIV agm sind (s.2.2.5). Um die Nachweisgrenze viraler Antigene in den Zellkulturüberständen in diesem ELISA zu quantifizieren, wurde Virus in dem optimierten System titriert und der Proteingehalt der Virussuspension mit Hilfe einer BSA-Eichkurve bestimmt. Es lassen sich in diesem Antigen-ELISA HIV-1 IIIB Antigenmengen bis zu 100 ng/ml bzw. 10 ng/loch einer Mikrotiterplatte nachweisen (Abb. 14). Um die Virusproduktion verschiedener Viruspassagen im ELISA und im RT-Nachweis besser vergleichen zu können, wurden Neuinfektionen mit zellfreiem Virus der verschiedenen Selektionsstufen (1., 2. und 3. Viruspassage) durchgeführt. Zusätzlich wurden um eine Selektion von AZT-resistenten HIV-Varianten zu fördern, die für die Infektion benötigten uninfizierten Jurkat- Zellen einen Tag mit 50 µm AZT vorbehandelt. Die Infektion erfolgte ebenfalls in Anwesenheit von 50 µm AZT. Während der ersten 12 Tage waren in allen Zellkulturüberständen gleich hohe Virus-Titer im ELISA nachweisbar (Abb. 15). Am 13. Tag p.i. konnte erstmalig bei den Jurkat-Kulturen gezeigt werden, dass der Virus-Titer der 3. Passage um einen Faktor von 2 erhöht war. Eine kontinuierliche Erhöhung der Virus-Titer ließ sich über einen Zeitraum von 31 Tagen nach der Infektion

83 69 beobachten. Nach 31 Tagen unterschieden sich die im ELISA messbaren HIV-Mengen der neuinfizierten 50 µm AZT behandelten Jurkat-Kulturen nicht mehr in der Menge normaler nicht AZT-behandelter HIV-1 IIIB infizierter Jurkat-Zellen. Die im ELISA gemessene optische Dichte bei 492 nm liegt bei den Überständen aus den HIV-1 IIIB infizierten Kulturen zwischen 0,5 und 1,0, das entspricht einem Virusproteingehalt von 1 µg bis 3,75 µg pro ml Zellkultur (Abb. 14). Diese ansteigende Tendenz der Virusproduktion weist auf eine AZT-Resistenz der Viren in Zellkultur hin. Gleichzeitig durchgeführte Bestimmungen der Reversen Transkriptase-Aktivität in den Kulturüberständen stimmen mit den im ELISA gefundenen Ergebnissen überein (Abb. 16). Abb. 14: Virustitrationskurve im ELISA. HIV-1 IIIB wurde im ELISA austitriert und mit einem HIV-1 Patientenserum nachgewiesen. Die unterschiedlichen Viruskonzentrationen [µg/100 µl] wurden gegen die optische Dichte bei 492 nm aufgetragen.

84 70 Abb. 15: HIV-1 Nachweis in 50 µm AZT-behandelten Jurkat-Zellen nach einer HIV-1 Neuinfektion mit ELISA. HIV-1 IIIB wurde im ELISA mit einem HIV-1 Patientenserum nachgewiesen. Die Balken geben die Virustiter für die 1., 2. und 3. Virusinfektion wieder. Die Tage nach der Neuinfektion (Tage p.i.) wurden gegen die optische Dichte bei 492 nm aufgetragen. Abb. 16: HIV-1 Nachweis in 50 µm AZT behandelten Jurkat-Zellen nach einer HIV-1 Neuinfektion im RT-Aktivitätstest. Am 14. und 20. Tag wurde kein Aktivitätstest der Reversen Transkriptase durchgeführt. HIV-1 IIIB wurde im Aktivitätstest der Reversen Transkriptase nachgewiesen. Die Balken geben die Aktivität der viralen Überstände der 1., 2. und 3. Virusinfektion wieder. Die Tage nach Neuinfektion (Tage p.i.) wurden gegen die RT-Aktivität [cpm] aufgetragen.

85 Inhibition der Reversen Transkriptase mit AZT-Triphosphat (AZT-TP) Um zu untersuchen, ob die gefundene erhöhte HIV-1 IIIB Expression in den 50 µm AZTbehandelten Jurkat-Kulturen auf einer AZT-Resistenz der viralen RT beruht, wurde die RT-Aktivität der Viruslysate mit AZT-Triphosphat (AZT-TP) mit der RT-Aktivität der Viruslysate nicht behandelter Kulturen verglichen. Hierzu wurden unterschiedliche Mengen von Saccharose gereinigten HIV-1 Viren im RT-Test (s.2.2.2) auf optimale Polymerase-Reaktionszeiten untersucht. Die optimalen RT-Aktivitäten wurden bei einem Proteingehalt des Viruskonzentrats von ca. 1-2 µg und einer Inkubationszeit von 45 Minuten erzielt. Unter den ermittelten optimalen Versuchsbedingungen wurden die Aktivitäten der Reversen Transkriptase unter AZT-TP Behandlung untersucht. Eine 50 %ige Inhibition der RT-Aktivitäten der 50 µm AZT-behandelten Viren der 2. und 3. Viruspassage wurden bei 34 nm AZT-TP erzielt und unterscheiden sich somit nicht von der AZT-TP Empfindlichkeit des Viruslysats unbehandelter Kulturen (Abb. 17). Dieses Ergebnis weist darauf hin, dass es trotz vermehrter HIV-1 Produktion in AZT-behandelten Kulturen keine Resistenz auf viraler enzymatischer Ebene zu geben scheint. Da die antivirale Wirkung von AZT auf die RT-Aktivität sowohl als Kettenterminator (Elwell et al., 1987; Kedar et al., 1990) als auch als allosterischer Hemmer der RT (Larder et al., 1989 c) beschrieben wurde, wurde der gleiche Inhibitionsversuch mit dem Template poly rcdg anstelle von poly radt durchgeführt. Während der Polymerase-Reaktion mit AZT-Triphosphat kommt es bei dem Template poly radt zu einem Abbruch des sich bildenden komplementären Thymidin-Stranges. Mit poly rcdg als Template konnte bis zur untersuchten Konzentration von 20 mm AZT-TP keine der untersuchten RTs inhibiert werden (Abb. 17). Da in diesen Strang kein AZT-MP eingebaut werden kann, sprechen diese Ergebnisse für eine Wirksamkeit des AZT-TP als Kettenhemmer und gegen eine allosterische Wirkung als RT-Inhibitor.

86 72 Abb. 17: Bestimmung der Reversen Transkriptase-Aktivität mit dem Template poly rcdg und AZT-Triphosphat. AZT-Triphosphat (AZT-TP) wurde im Aktivitätstest der Reversen Transkriptase mit dem Template poly radt titriert. Die Aktivität der Reversen Transkriptase [%] wurde logarithmisch gegen die AZT-TP Konzentration [µm] aufgetragen in vitro -Untersuchung der viralen Empfindlichkeit gegenüber DDI und AZT Zusätzlich zu den Hemmversuchen der viralen RT durch AZT-TP wurde die für AZT resistente HIV-Varianten beschriebene Kreuzresistenz gegenüber DDI untersucht. Hierzu wurden die Viren der 50 µm AZT selektionierten 1. und 3. Viruspassage im MT-4 Test auf ihr Verhalten gegenüber AZT und DDI untersucht. Eine AZT-Resistenz würde sich im MT-4 Zelltest dadurch bemerkbar machen, dass der virusbedingte Zelltod nur durch erhöhte AZT-Gabe verhindert werden kann oder eine antivirale AZT-Wirkung gar nicht mehr nachzuweisen wäre. Voraussetzung für die Untersuchung der antiviralen Wirkung von AZT und DDI mit den Zellkulturüberständen der AZTbehandelten Kulturen war eine ausreichend nachweisbare Virusproduktion der Zellkulturen. Nur größere Mengen an HIV-1 können im MT-4 Zelltest einen meßbaren Zelltod herbeiführen. Ferner wirken die 50 µm AZT Konzentration in den Überständen der AZT-behandelten Viruspassagen auf die MT-4 Zellen zelltoxisch (Abb. 11). Deshalb war es erforderlich, dass die AZT-behandelten Zellen in Kulturmedium ohne AZT gewaschen und ohne AZT weiter kultiviert wurden. Es wurden

87 73 täglich zellfreie Überstände aus den Zellkulturen entnommen und der Virustiter der Überstände im MT-4 Test bestimmt. Nach 3 Tagen produzierten die Kulturen ausreichend Virus und die antivirale Konzentration von AZT und DDI konnte bestimmt werden. Die Viren der mit 50 µm AZT behandelten Viruspassagen verhielten sich gegenüber AZT so wie normale nicht resistente Viren (Abb. 18). Der virusbedingte Zelltod konnte bei einem ED 50 -Wert von 13 nm AZT um 50 % reduziert werden (Abb. 18). Eine Erhöhung der Inhibitorkonzentrationen war nicht erforderlich, um den HIV-1 bedingten MT-4 Zelltod zu verhindern. 3 Abb. 18: Virale Empfindlichkeit gegenüber AZT. AZT wurde mit Zellkulturüberständen der 1. und 3. Viruspassage in den Verdünnungen 1:4 und 1:40 titriert. Die 3 H-Thymidin-Einbaurate [cpm] wurde doppelt logarithmisch gegen die Konzentration von AZT [µm] aufgetragen. Wurden die gleichen Überstände auf ein verändertes Verhalten gegenüber DDI im MT-4 Zelltest untersucht (Abb. 19) wich der ermittelte ED 50 -Wert für DDI, der für die 50 µm AZTbehandelte Viruspassage bei 1-2 µm DDI lag, von dem ED 50 -Wert für unbehandelte HIV-1 IIIB Viren nicht ab.

88 74 3 Abb. 19: Virale Empfindlichkeit gegenüber DDI. DDI wurde mit Zellkulturüberständen der 1. und 3. Viruspassage in den Verdünnungen 1:4 und 1:40 austitriert. Die 3 H-Thymidin-Einbaurate [cpm] wurde doppelt logarithmisch gegen die Konzentration von DDI [µm] aufgetragen PCR-Sequenzierung der AZT-selektionierten Zellen Obwohl die vorherigen Untersuchungen nicht auf eine virale AZT-Resistenz bei 50 µm AZT behandelten HIV-1 IIIB Viren hindeuten, wurde zur Absicherung der gefundenen Ergebnisse die zelluläre DNA aus 50 µm AZT-behandelten HIV-1 IIIB infizierten Jurkat-Kulturen isoliert und das Polymerase-Gen mit Hilfe der PCR-Sequenzierung analysiert. Die Aminosäure-Austausche wurden in den Positionen 20, 134, 139 und 212 gefunden (Tab. 15). Tab. 15: Nukleotid- und Aminosäure-Austausche bei HIV-1 IIIB Viren nach Behandlung mit 50 µm AZT Nukleotid-Austausch Kodon-Position in NL43 Aminosäure-Austausch [bp] AAA AGA 20 Lys Arg AGT AAT 134 Ser AsN ACA ATA 139 Thr Ile TGG TGC 212 Trp Cys

89 Verhalten der resistenten Zellkulturen unter hochmolaren AZT-Konzentrationen Um die Replikation noch vorhandener AZT-sensitiver HIV-1 Varianten weiterhin einzuschränken oder vollkommen auszuschließen, wurden die 50 µm AZT behandelten Jurkat- HIV-1 IIIB Kulturen der 2. Viruspassage stufenweise auf AZT-Konzentrationen von 250, 500, 1000, 1500, 2000, 3000, 4000 und 5000 µm AZT hochgesetzt. Obwohl gezeigt werden konnte, dass unbehandelte und mit 50 µm AZT-behandelte HIV-1 IIIB infizierte und uninfizierte Jurkat-Zellen bei Abb. 20: Virustiter im ELISA nach Erhöhung der AZT-Dosis. HIV-1 IIIB wurde im ELISA mit einem HIV-1 Patientenserum nachgewiesen. Die Balken geben die Virustiter für die verschiedenen AZT-Konzentrationen ( 250, 500, 1000, 1500, 2000, 3000, 4000, 5000 µm) an, mit denen das HIV-1 IIIB in Zellkultur selektioniert wurde. Die Tage nach Erhöhung der AZT-Konzentration [Tage] wurden linear gegen die optische Dichte bei 492 nm [OD 492 nm] aufgetragen. einer AZT-Konzentration von 2000 µm AZT nicht mehr in der Lage sind 3 H-Thymidin in ihre zelluläre DNA einzubauen (Abb. 18), ließen sich die Kulturen bis zu 3000 µm AZT vermehren. Sogar in den Überständen der Kulturen, die mit 5000 µm AZT behandelt wurden, ließ sich Virus im ELISA nachweisen (Abb. 20). Dies entspricht einer AZT-Konzentration, die mehr als fach über der AZT-Dosis liegt, die die HIV-Infektiosität für die MT-4 Zellen auf 50 % inhibiert (ED 50 = 13 nm).

90 76 Tab. 16: Proliferation uninfizierter und HIV-1 IIIB infizierter Jurkat-Zellen in Abhängigkeit verschiedener AZT-Konzentrationen In den ersten 10 Tagen nach Dosiserhöhung scheinen die 250 und 500 µm AZT behandelten HIV-1 IIIB infizierten Jurkat-Kulturen mehr Virus aus den Zellen auszuschleusen als die 1000 µm und 1500 µm AZT behandelten, dann jedoch sinkt die Virusproduktion aller AZT behandelten Kulturen auf eine mehr oder weniger gleiche Höhe ab. Zwischen dem 12. und 17. Tag nach der Dosiserhöhung zeigt sich erstmals eine Virusproduktion auch in den 2000, 3000 und 4000 µm AZTbehandelten Kulturen. Am 47. Tag nach Dosiserhöhung scheint sich das Verhältnis der Virusproduktion in den Kulturen umzukehren. In den 250 µm und 500 µm AZT Kulturen läßt sich wenig HIV-1 im ELISA nachweisen, aber in den 1000, 1500, 2000 und 3000 µm AZT behandelten Jurkat-Zellen kommt es zu einem starken Virusanstieg. Um die Proliferation HIV-1 IIIB infizierter Jurkat-Zellen mit der unbehandelter Jurkat-Zellen in Abhängigkeit verschiedener AZT-Konzentrationen zu untersuchen, wurden die Zellen auf die gleiche Zellzahl von 10 6 Zellen/ml eingestellt und 3 Tage in Anwesenheit der jeweiligen AZT-Konzentration kultiviert. Die Zellproliferation wurde fotografisch festgehalten (Abb. 21). Es konnte gezeigt werden, dass die Proliferationsrate mit steigender AZT-Konzentration sinkt (Tab. 16). Auch das Erscheinungsbild der Zellen veränderte sich mit steigender AZT-Konzentration. Ab einer AZT- Konzentration von 1500 µm AZT wurden die Zellen granulierter, es bildeten sich Riesenzellen. Schließlich platzten die Zellen unter den extrem hohen, toxischen AZT-Dosen von 4000 und 5000 µm AZT. Bei den HIV-1 IIIB infizierten Jurkat-Kulturen treten im Gegensatz zu den uninfizierten Kulturen bräunlich, behaart erscheinende Zellen auf, die größer als normale T-Zellen sind. Jurkat uninfiziert Jurkat HIV-1 IIIB AZT-Konzentration Prozent [%] AZT-Konzen- Prozent [%] [µm] tration [µm] / / , , , , , , , ,1

91 77 Wie im ELISA gezeigt werden konnte (Abb. 20), produzierten die HIV-1 IIIB infizierten Zellen unter 5000 µm AZT 21 Tage Virus, obwohl sich die Zellen im Untersuchungszeitraum nicht vermehrten, sondern kontinuierlich abstarben. A1 A2 B1 B2 C1 C2 D2 D1 E2

92 78 E1 F2 Abb. 21: Uninfizierte und HIV-1 IIIB infizierte Jurkat-Zellen unter Behandlung mit hohen AZT-Konzentrationen. Die Photos wurden 3 Tage nach Erhöhung der AZT-Konzentrationen aufgenommen. Die anfängliche Zellkonzentration betrug 10 6 Zellen/ml. A1: uninfizierte Jurkat-Zellen mit 50 µm AZT; B1: uninfizierte Jurkat-Zellen mit 500 µm AZT; C1: uninfizierte Jurkat-Zellen mit 1500 µm AZT; D1: uninfizierte Jurkat-Zellen mit 4000 µm AZT; E1: uninfizierte Jurkat-Zellen mit 5000 µm AZT; A2: HIV-1 IIIB infizierte Jurkat-Zellen ohne AZT; B2: HIV-1 IIIB infizierte Jurkat-Zellen mit 50 µm AZT; C2: HIV-1 IIIB infizierte Jurkat-Zellen mit 1500 µm AZT; D2: HIV-1 IIIB infizierte Jurkat-Zellen mit 3000 µm; E2: HIV-1 IIIB infizierte Jurkat-Zellen mit 4000 µm; F2: HIV-1 IIIB infizierte Jurkat- Zellen mit 5000 µm. 3.3 Untersuchungen zu zellulären AZT-Resistenzmechanismen Bisher konnte gezeigt werden, dass bei einer Kultivierung von HIV-1 IIIB infizierten Jurkat- Zellen unter sehr hohen für nicht AZT-vorbehandelte Jurkat-Zellen (Abb. 9) bereits toxischen AZT- Konzentrationen zellfreies HIV nachgewiesen werden konnte (Abb. 20). Eine Veränderung der viralen AZT-Empfindlichkeit konnte jedoch weder bei in vitro -Nachweismethoden gezeigt werden, noch ließen sich die für eine virale AZT-Resistenz beschriebenen Aminosäure-Austausche im Polymerasegen nachweisen. Daher wurde ein zellulärer Resistenzmechanismus angenommen Nachweis des Multidrug-Resistenz-Proteins mdr P170 Die Expression des Multidrug-Resistenz-Proteins mdr P170 wurde mit mdr-spezifischen Antikörpern im Westernblot und in der Durchflusszytometrie nachgewiesen.

93 Westernblotanalyse Ist das mdr P170 Protein auf der Zelloberfläche der Zellen vorhanden, kann es im Westernblot mit einem monoklonalen Antikörper (C219) nachgewiesen werden, der gegen das mdr P170 Protein gerichtet ist. In HIV-1 IIIB infizierten Jurkat-Zellen konnte das mdr P170 als eine Doppelbande in der Höhe von 48 kd bzw. 46 kd gefunden werden. In uninfizierten Jurkat-Zellen ließ sich das mdr P170 jedoch nur sehr schwach erkennen (Abb. 22). Die Doppelbande weist auf die verschiedenen glykosilierten Formen des mdr P170 hin (Greenberger et al., 1987; Ichikawa et al., 1991). Ein anderer monoklonaler Antikörper, der gegen das mdr P170 gerichtet ist, konnte das P-Glykoprotein in den Zelllinien nicht erkennen. kd kd Abb. 22: Westernblot des mdr P170 aus nicht infizierten und HIV-1 IIIB infizierten Jurkat- Zellen. 1: Jurkat uninfiziert + MRK16; 2: Jurkat uninfiziert + C219; 3: Jurkat-HIV-1 IIIB + MRK16; 4: Jurkat-HIV-1 IIIB + C219; MRK16, C219: monoklonale Antikörper, die gegen das mdr P170 gerichtet sind.