Neue Enzyme für ein altes Organeil: Kryptische peroxisomale Lokalisationssignale in Pilzen. Dissertation

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1 Neue Enzyme für ein altes Organeil: Kryptische peroxisomale Lokalisationssignale in Pilzen Dissertation zur Erlangung des Doktorgrades der Naturwissenschaften (Dr. rer. nat.) Dem Fachbereich Biologie der Philipps-Universität Marburg vorgelegt von Johannes Freitag aus Fulda Marburg/Lahn,

2 Inhaltsverzeichnis Zusammenfassung Summary Abkürzungsverzeichnis Inhaltsverzeichnis I II III IV 1 Einleitung Peroxisomen: Konservierte eukaryotische Organellen mit vielfältiger Funktion Der peroxisomale Proteinimport und die Biogenese von Peroxisomen Peroxisomen haben vielfältige und teilweise hochspezialisierte Funktionen Peroxisomale Proteine mit dualer Lokalisierung 8 12 Glykolyse und Gluconeogenese: Eine Übersicht 9 13 Ustilago maydis Der Lebenszyklus von U. maydis ist mit seiner pathogenen Entwicklung verknüpft U. maydis als Modellorganismus für die Molekular- und Zellbiologie Fragestellung 15 2 Ergebnisse Die Untersuchung von PolyA-Signalen in U. maydis führte zur Identifizierung alternativer Transkript-Varianten für die GAPDH Etablierung eines Testsystems zur Untersuchung von PolyA-Signalen in U. maydis Alternative Transkripte von gapd entstehen durch differentielles Spleißen und alternative Polyadenylierung in U. maydis Versteckte Varianten der glykolytischen Enzyme GAPDH und PGK enthalten Zielsteuerungssequenzen für Peroxisomen in U. maydis Alternatives Spleißen führt zur Bildung einer peroxisomalen Isoform von GAPDH Das Überlesen des Stopcodons führt zur Bildung einer peroxisomalen PGK Isoform Das Überlesen des Stopcodons erzeugt einen erheblichen Anteil peroxisomaler PGK Peroxisomale Isoformen von GAPDH und PGK sind in vielen Pilzen weit verbreitet Peroxisomale Isoformen von GAPDH und PGK aus A. nidulans Hinweise auf peroxisomale Varianten von GAPDH und PGK in EST-Banken PGK aus Botrytis cinerea: Ein Hinweis auf die Evolution der Mechanismen zur Generierung der PTS1-Motive in glykolytischen Enzymen Phycomyces blakesleeanus besitzt drei paraloge Gene für die GAPDH 30

3 2.4 Charakterisierung von Peroxinen in U. maydis U. maydis codiert für zwei PTS1 -Rezeptoren Peroxisomaler Import von mcherry-skl in pe.v-mutanten Funktionelle Peroxisomen haben eine Funktion beim Zucker- und beim Fettsäuremetabolismus in U. maydis Peroxisomen spielen während der pathogenen Entwicklung von U. maydis eine Rolle Die peroxisomalen Isoformen von GAPDH und PGK haben eine Funktion bei der biotrophen Entwicklung von U. maydis Die peroxisomale GAPDH hat überlappende Funktionen mit anderen peroxisomalen NAD abhängigen Dehydrogenasen Peroxisomale NAD abhängige Dehydrogenasen in U. maydis Überlappende Funktionen der peroxisomalen NAD abhängigen Dehydrogenasen Peroxisomen beeinflussen das Wachstum von U. inaydis auf verschiedenen Zuckern GAPDH und PGK sind Teil eines größeren metabolischen Netzwerks in Peroxisomen Peroxisomale Varianten von TP1 in U. maydis und A. nidulans Die Fructose-1,6-bisphosphat Aldolasen von U. maydis und A. nidulans enthalten funktionelle PTS 1-Motive Das Enzym Phosphoenolpyruvat Carboxykinase (PEPCK) aus U. maydis enthält ein PTS 1-Motiv Anzeichen für peroxisomalen Import von PGK-Homologen aus Homo sapiens und Bos taurus Die Synthese von Mannosylerythritol Lipiden (MEL) findet zum Teil in den Peroxisomen von U. maydis statt Die beiden Acyltransferasen Macl und Mac2 lokalisieren in den Peroxisomen von U. maydis Die zytoplasmatische Lokalisierung von Macl und Mac2 führt zur Synthese abgewandelter MELs Homologe von Macl und Mac2 aus A. nidulans enthalten ebenfalls PTS 1-Motive 55 Diskussion Die Bedeutung und Verbreitung von alternativem Spleißen in Pilzen Gezieltes Überlesen von Stopcodons zur Erzeugung alternativer Isoformen Ein erweitertes peroxisomales Proteom bedingt durch die duale Lokalisierung von Proteinen und ungewöhnliche PTSl-Motive Mechanismen zur dualen Lokalisierung von Proteinen Ungewöhnliche PTSl-Motive Mögliche Funktionen der peroxisomalen Isoformen glykolytischer/gluconeogenetischer Enzyme in Peroxisomen von Pilzen 66

4 3.4.1 Die peroxisomale Isoform von GAPDH als Teil eines Redox-Shuttles Glykolyse oder Moonlighting" Die konstitutiv hohe Zahl von Peroxisomen könnte die duale Lokalisierung glykolytischer Enzyme in vielen Pilzen begründen Peroxisomen haben in U. maydis vielfältige Funktionen Funktionelle Peroxisomen sind entscheidend für die Virulenz von U. maydis Peroxisomen spielen in U. maydis eine Rolle beim Metabolismus von Zucker U. maydis codiert für zwei Pex5-Homologe mit unterschiedlicher Funktion Kompartimentierung der Glykolipidsynthese in V. maydis 75 4 Material und Methoden Materialien mit Bezugsquellen Chemikalien Antikörper und Enzyme Puffer und Lösungen Kits Geräte Sonstige Materialien Kultivierung von Mikroorganismen Kultivierung von Escherichia coli Kultivierung von S. cerevisiae Kultivierung von U. maydis Bestimmung der optischen Dichte (OD) von Kulturen Stämme, Plasmide und Oligonukleotide E. coli Stämme S. cerevisiae Stämme U. maydis Stämme Plasmide Oligonukleotide Mikrobiologische Methoden Transformation von E. coli Transformation von S. cerevisiae Transformation von U. maydis Wachstumstests auf Fest- und in Flüssigmedium Test auf filamentöses Wachstum auf PD-Aktivkohle-Medium Infektion von Zea mays mit U. maydis 94

5 4.5 Genetische Methoden Deletion von Genen oder Genfragmenten mittels homologer Rekombination Integration von Konstrukten in den /p-locus von U. maydis Molekularbiologische Methoden Restriktion und Dephosphorylierung von DNA Ligation von DNA Sequenzierung von DNA Agarosegel-Elektrophorese Polymerase-Kettenreaktion (PCR) Quantitative PCR (qrt-pcr) und Untersuchung von cdna Isolierung von Plasmid DNA aus E. coli Isolierung von genomischer DNA aus U. maydis Isolierung von RNA aus U. maydis Transfer und Nachweis von DNA auf Membranen (Southern Blot) Transfer und Nachweis von RNA auf Membranen (Northern Blot) Biochemische Methoden Isolierung von denaturierten Proteinen aus U. maydis Isolierung nativer Proteine aus U. maydis Bestimmung der Proteinkonzentration Elektrophorese von Proteinen Transfer und Nachweis von Proteinen (Western Blot) Isolierung von Glykolipiden aus U. maydis Auftrennung und Nachweis der Glykolipide mit Dünnschichtchromatographie (DC) Massenspektrometrische Untersuchungen der Glykolipide Mikroskopie Bioinformatik Literatur Anhang 134